潘 菁，曹子蔚，管 贇，蔣備戰(zhàn)

年輕恒牙易受齲病、外傷、感染等因素影響導(dǎo)致牙髓壞死甚至是根尖周炎。牙髓再生作為治療年輕恒牙牙髓壞死的新方法，有誘導(dǎo)根管壁增厚、根尖閉合、神經(jīng)血管再生等優(yōu)勢，可以獲得較為理想的治療效果[1]。

富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin，PRF)是二代血小板濃縮產(chǎn)品，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和促進(jìn)組織愈合的作用，Choukroun等[2]在此基礎(chǔ)上提出可注射型富血小板纖維蛋白(injectable platelet rich fibrin，iPRF)。iPRF的三維纖維蛋白網(wǎng)中富含血小板、白細(xì)胞、Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣素和多種生長因子，可成為促進(jìn)軟硬組織愈合的良好載體[3]。

本實(shí)驗(yàn)擬探究iPRF的生長因子含量及其對根尖牙乳頭干細(xì)胞的增殖、遷移和成骨/成牙向分化的影響，為后續(xù)的牙髓再生治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

胰酶、α-MEM不完全培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素、PBS、茜素紅染色液(凱基，中國)；胎牛血清(Gibco，美國)；細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管、細(xì)胞培養(yǎng)板、Transwell板(Coring，美國)；CCK-8試劑盒(翊圣，中國)；ELISA試劑盒(博士德，中國)；倒置顯微鏡(Nikon，日本)；細(xì)胞總RNA提取試劑盒、實(shí)時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒(TaKaRa，日本)；膠原酶、地塞米松、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉(Sigma，美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

收集因阻生拔除的第三磨牙(根尖孔未閉合)，剪碎根尖部軟組織并用胰蛋白酶消化處理，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)獲得人根尖牙乳頭干細(xì)胞(human stem cells from apical papilla, hSCAPs)。培養(yǎng)基由10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和α-MEM不完全培養(yǎng)基制成。本實(shí)驗(yàn)所獲取的hSCAPs已經(jīng)過課題組前期鑒定[4]，選取第4代hSCAPs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 可注射型富血小板纖維蛋白提取液(injectable platelet rich fibrin extracts，iPRFe)的制備

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過同濟(jì)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審查編號：2018-012)，所有志愿者知情同意。選取健康男性8例，年齡25～40歲，血常規(guī)示血小板計(jì)數(shù)正常。分別抽取志愿者10 mL靜脈血，以700 r/min的速率低溫離心3 min，上層即為iPRF，吸取上層液體狀物質(zhì)凍干成膜，研磨成粉，浸入50 mL α-MEM不完全培養(yǎng)基中，24 h后通過0.22 μm濾器過濾，得到液體定義為1×iPRFe，放入-20 ℃冰箱待用。

1.4 ELISA法測定iPRFe相關(guān)因子含量

取出待用iPRFe，按ELISA試劑盒說明書分別檢測iPRFe中血小板衍生生長因子-BB(platelet derived growth factor-BB，PDGF-BB)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)和轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGFβ1)的含量。測定450 nm吸光度值，并根據(jù)曲線計(jì)算相應(yīng)結(jié)果。

1.5 iPRFe對hSCAPs增殖的影響

將1×iPRFe用α-MEM不完全培養(yǎng)基分別稀釋至1/2×、1/4×和1/8×濃度，并加入10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素制成條件培養(yǎng)液，對照組不含iPRFe。將hSCAPs以2×103個/孔接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁24 h后換用條件培養(yǎng)液。每組設(shè)置6個復(fù)孔，每孔200 μL液體，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。分別于第1、3、5天取出檢測，棄去原培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入含有10% CCK-8試劑的100 μL PBS，孵育1 h后取出，酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處吸光度值，記錄結(jié)果。選取促進(jìn)hSCAPs增殖最佳濃度的iPRFe進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的比較。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測iPRFe對hSCAPs遷移的影響

實(shí)驗(yàn)分為2組：對照組(由10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和89% α-MEM不完全培養(yǎng)基制成的培養(yǎng)基培養(yǎng))和iPRFe組(含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素和促進(jìn)增殖最佳濃度的iPRFe培養(yǎng)液培養(yǎng))。常規(guī)將hSCAPs細(xì)胞懸液以2×105個/mL的密度接種至6孔Transwell板的上室，下室加入各組條件培養(yǎng)基，于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，PBS沖洗，4%多聚甲醛溶液固定，棉拭子擦去膜上面未遷移的細(xì)胞，PBS沖洗，0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡觀察并拍照。3%醋酸溶液脫色，酶標(biāo)儀測定各孔570 nm處吸光度值，記錄結(jié)果。

1.7 茜素紅檢測iPRFe對hSCAPs礦化的影響

配制礦化誘導(dǎo)條件培養(yǎng)基(osteogenic medium，OM)：α-MEM不完全培養(yǎng)基、10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素、終濃度分別為10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、0.05 mmol/L的抗壞血酸和0.1 μmol/L的地塞米松。實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組(空白細(xì)胞培養(yǎng)液)、OM組(僅含OM)和iPRFe組(OM+iPRFe)。將hSCAPs接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞融合至80%，分別加入各組誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每2 d換液，分別培養(yǎng)7、14、21 d。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，PBS沖洗，4%多聚甲醛溶液固定，茜素紅染色，PBS沖洗，拍照。1 mmol/L氯化十六烷基吡啶脫色，紫外分光光度儀檢測562 nm處吸光度值，記錄結(jié)果。

1.8 qRT-PCR檢測成骨/成牙向分化相關(guān)基因的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分組同1.7。按1.7方法礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)7、14、21 d后用TRIzol分別提取OM組、iPRFe組與對照組hSCAPs的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1 (dentin matrix protein 1，DMP1)、牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)和骨鈣素(osteocalcin, OCN)的mRNA表達(dá)情況。所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 GAPDH、ALP、DSPP、DMP1、OCN引物序列Tab.1 Primer sequences of GAPDH, ALP, DSPP, DMP1, OCN

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，由SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 iPRFe的因子含量

ELISA結(jié)果顯示，iPRFe中有PDGF-BB、TGFβ1和IGF1等細(xì)胞因子，且TGFβ1和IGF1的含量較高，而PDGF-BB的含量則相對較低(圖1)。

圖1 iPRFe生長因子含量Fig.1 The content of growth factors in iPRFe

2.2 iPRFe對hSCAPs增殖的影響

將hSCAPs培養(yǎng)1、3、5 d后發(fā)現(xiàn)，所有濃度的iPRFe均明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖；與對照組相比，濃度為1×組明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，但低于1/4×組(P<0.05)，與其余組間無差異(P>0.05)。1 d和5 d時，在iPRFe濃度1/4×?xí)r，細(xì)胞增殖量較濃度為1/2×明顯增加(P<0.05)；而濃度為1/8×?xí)r，細(xì)胞增殖量比濃度為1/4×?xí)r稍低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。因此在所有濃度中，1/4×iPRFe對hSCAPs的增殖促進(jìn)效果最佳(圖2)。

2.3 iPRFe對hSCAPs遷移的影響

將hSCAPs置于1/4×濃度的iPRFe中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞遷移量。結(jié)果可見iPRFe組(圖3B)細(xì)胞遷移數(shù)目明顯多于對照組(圖3A)。定量結(jié)果顯示，iPRFe組的細(xì)胞遷移量明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3C)。

*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

2.4 iPRFe對hSCAPs礦化的影響

hSCAPs在經(jīng)過礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后，7 d可見iPRFe組的礦化結(jié)節(jié)染色均比對照組和OM組的更深。隨著時間推移，OM組的染色逐漸變深，且比對照組明顯；iPRFe組的礦化結(jié)節(jié)染色比對照組和OM組的深染更明顯。定量結(jié)果顯示，7、14、21 d時OM組和iPRFe組的染色均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且相同時間點(diǎn)，iPRFe組比OM組深染(圖4)。

2.5 iPRFe對成骨/成牙向分化相關(guān)基因表達(dá)的影響

hSCAPs經(jīng)過礦化誘導(dǎo)7 d，OM組和iPRFe組的ALP、DMP1和DSPP的表達(dá)均升高，iPRFe組的OCN表達(dá)明顯升高，但OM組OCN表達(dá)與對照組相比無明顯差異；除DSPP和OCN外，iPRFe組的升高量明顯高于OM組(P<0.05)。誘導(dǎo)培養(yǎng)中后期14 d及21 d時，iPRFe組的ALP、DMP1、DSPP和OCN的表達(dá)均明顯升高，且高于OM組(P<0.05)(圖5)。

3 討 論

成功的牙髓再生，離不開三個基本要素，即種子細(xì)胞(干細(xì)胞)、支架材料和生長因子。目前已有多種血小板濃縮制品，包括PRF、濃縮生長因子等，含有各種活性因子，同時具有三維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)，且無需添加任何其他生物來源制劑，避免了倫理道德爭議和疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)，可以作為牙髓再生較為理想的選擇。研究表明，PRF和濃縮生長因子均能促進(jìn)牙髓再生[5-6]。PRF是凝膠狀，應(yīng)用于根管內(nèi)需要經(jīng)過一定的修剪，而iPRF在具有PRF和濃縮生長因子相似優(yōu)點(diǎn)的同時，臨床操作的便利性大大提升。

A：對照組Transwell結(jié)果；B：iPRFe組Transwell結(jié)果；C：對照組和iPRFe組hSCAPs細(xì)胞遷移結(jié)果分析；***：與對照組相比，P<0.001

A：不同培養(yǎng)液培養(yǎng)hSCAPs茜素紅染色結(jié)果；B：茜素紅染色結(jié)果的礦化水平分析，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

A：ALP表達(dá)水平；B：DMP1表達(dá)水平；C：DSPP表達(dá)水平；D：OCN表達(dá)水平；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

hSCAPs是基于內(nèi)源性細(xì)胞歸巢模式牙髓再生治療中的主要干細(xì)胞來源之一，存在于未發(fā)育完全的恒牙根尖周組織中，是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的成體間充質(zhì)干細(xì)胞。與其他牙源性干細(xì)胞相比，hSCAPs的增殖率高于人牙髓干細(xì)胞和人牙周膜干細(xì)胞[7-8]?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1、TGFβ1等趨化因子可促進(jìn)hSCAPs的遷移，在基于細(xì)胞歸巢再生的根管治療中均可能得到臨床應(yīng)用[9-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)研究了iPRFe對hSCAPs增殖、遷移和礦化的影響，結(jié)果表明iPRF在牙髓再生中可能有較為理想的效果。

PDGF-BB是一種重要的促有絲分裂因子，對單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，促進(jìn)組織愈合。IGF1是牙體及骨組織修復(fù)的關(guān)鍵生長因子，可調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的成牙及成骨向分化[11]。TGFβ1作為骨形成和吸收的調(diào)節(jié)因子，可通過上調(diào)ALP水平促進(jìn)鈣化沉積[12]，也能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步分泌細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)成分。本實(shí)驗(yàn)中，iPRFe含有較高濃度的TGFβ1和IGF1，推測其與iPRFe促進(jìn)hSCAPs的成牙及成骨向分化有關(guān)，但PDGF-BB含量相對較低，提示hSCAPs的增殖、遷移可能還與其他生長因子相關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，iPRF能促進(jìn)hSCAPs的增殖和遷移。1、5 d時，1/8×濃度的iPRFe促增殖效果低于1/4×濃度的iPRFe，可能與VEGF、PDGF、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等生長因子含量下降有關(guān)[13]。在所選濃度中，濃度為1/4×的促增殖效果最佳，表明生長因子的含量并非越高越好，而是在一個合適的濃度的情況下，作用效果最佳。有學(xué)者猜測血小板濃縮制品濃度過高產(chǎn)生的抑制作用是因?yàn)槠洳粌H含有促進(jìn)組織愈合的生長因子，也含有一些炎癥因子，如血小板反應(yīng)蛋白、血小板因子4等，濃度過高時則會反向抑制[14]。總之，iPRF含有多種細(xì)胞因子，作用復(fù)雜多樣，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

成骨分化過程的關(guān)鍵步驟包括細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)形成以及基質(zhì)礦化[15]。在骨形成中，ALP是起關(guān)鍵作用的標(biāo)志物，并與早期細(xì)胞的成骨分化有關(guān)[16]。Chen等[17]將PRF和牙髓干細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)，成功得到牙髓牙本質(zhì)樣組織，ALP的mRNA表達(dá)水平在7、14 d均有明顯的升高。同樣本實(shí)驗(yàn)中，7、14、21 d中iPRFe組ALP的mRNA表達(dá)水平均比對照組和OM組有明顯地升高，提示iPRF早期就能促進(jìn)hSCAPs的成骨向分化。Saeed等[18]研究表明，PRF可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞的成骨分化，茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)更明顯。此實(shí)驗(yàn)中，與正常組和礦化誘導(dǎo)組相比，iPRFe組hSCAPs的茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)相對更明顯，且在14 d和21 d時，OCN的mRNA表達(dá)水平均比OM組更明顯，表明iPRF可促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。牙髓損傷和修復(fù)的機(jī)制包括干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化和第三期牙本質(zhì)的分泌[19]。成牙本質(zhì)細(xì)胞是分泌牙本質(zhì)的關(guān)鍵細(xì)胞，特異性地表達(dá)一些標(biāo)記分子，如DSPP和DMP1[20]。Chen等[17]研究PRF在體外對牙髓干細(xì)胞分化的影響中，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)7 d和14 d的DSPP的表達(dá)無差異，DMP1在7、14和21 d均持續(xù)升高，但在本研究中iPRFe組DSPP的表達(dá)從14 d開始較OM組有明顯升高，可能是由于細(xì)胞種類不同；而DMP1的表達(dá)趨勢與本研究一致，表明iPRF能夠促進(jìn)hSCAPs的成牙向分化。因此，iPRF可以促進(jìn)hSCAPs的成牙/成骨向分化。

綜上所述，本研究證明了iPRF能促進(jìn)hSCAPs的增殖、遷移和成骨/成牙向分化，為可注射型富血小板纖維蛋白應(yīng)用于牙髓再生提供了一定的前期基礎(chǔ)，但具體的機(jī)制以及應(yīng)用于體內(nèi)牙髓再生的效果仍需進(jìn)一步探究。