韓 超，李淑穎，耿玉萌，史萬玉，包永占

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001)

藥物性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)是指人體暴露于常規(guī)劑量或高劑量藥物后，因藥物本身或其代謝產(chǎn)物對肝臟的直接毒性，或人體對藥物或其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生過敏或代謝特異質(zhì)反應(yīng)而導(dǎo)致的肝臟損傷，是肝生化異常與急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)的常見原因之一[1-3]。在所有引起藥物性肝損傷的因素中，抗生素被報道的最多，研究發(fā)現(xiàn)青霉素類、氯霉素類和大環(huán)內(nèi)酯類等都是極易引起藥物性肝損傷的抗生素種類[4]。隨著有關(guān)抗生素引起肝毒性的報道越來越多，人們不僅關(guān)注抗生素對人類的肝臟毒性，也開始關(guān)注抗生素對動物的肝毒性。近年來，已有多種抗生素被報道能夠引發(fā)動物的肝毒性[5]，這其中就包括氟苯尼考。氟苯尼考是一種廣譜的動物抗生素[6]，其具有很好的抗菌作用，對多種革蘭陰性菌和陽性菌有抗菌作用。據(jù)報道，高劑量的氟苯尼考可通過抑菌作用加重肝損傷。本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)，1日齡開始給與氟苯尼考能顯著抑制雛雞早期的增重，損傷雛雞的造血功能，同時對雛雞的肝臟功能造成損傷[7]。

丹參多糖是丹參藥材中重要藥效成分之一。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖及降血脂等作用。丹參多糖作為植物多糖的一種也具有以上藥效活性[8]。近年來，有多篇報道丹參多糖對肝臟損傷有較好的緩解作用，姚瑩華等[9]發(fā)現(xiàn)，丹參多糖能降低LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷模型小鼠肝組織中MDA含量，升高GSH含量，降低血清ALT含量，從而達(dá)到緩解肝臟損傷的作用；盧艷嫻等[10]研究發(fā)現(xiàn)，丹參多糖通過開放肝竇內(nèi)皮細(xì)胞窗孔，改善肝竇微循環(huán)，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用。本實驗室對丹參多糖的保肝效果進(jìn)行了研究，前期研究發(fā)現(xiàn)，丹參多糖在體內(nèi)外均能有效抑制炎癥反應(yīng)，并通過減少炎性因子的釋放達(dá)到緩解免疫性肝損傷的效果[11-12]；丹參多糖還可以通過抑制炎癥通路TRL4/MyD88[13]、NF-κB和趨化因子CXCL-10[14-15]的活性來降低炎癥因子的釋放達(dá)到抑制炎癥反應(yīng)的作用，進(jìn)而緩解免疫性肝損傷。此外，丹參多糖能有效調(diào)控免疫性肝損傷的小鼠肝臟內(nèi)氧化應(yīng)激[15-16]，抑制肝細(xì)胞凋亡[17]，進(jìn)而緩解肝損傷。同時發(fā)現(xiàn)，丹參多糖對CCL4引起的雛雞肝臟損傷也有較好的緩解效果，丹參多糖能提高肝臟內(nèi)肝藥酶活性，降低肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激而保護(hù)肝臟細(xì)胞[18]。綜上所述，丹參多糖對多種類型的肝損傷均有不錯的緩解效果，具備開發(fā)成保肝藥物的潛質(zhì)。本試驗以肉雞為試驗對象，闡明丹參多糖對氟苯尼考導(dǎo)致的肉雞肝毒性的作用效果，這對中藥有效成分的開發(fā)、闡明抗生素毒副作用和尋求有效防治措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑1日齡羅斯308肉雞，購自河北大午公司；氟苯尼考溶液購自山東德州神牛藥業(yè)有限公司；谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等生化試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；CYP1A1和CYP2H1 ELISA試劑盒，購自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等，購自北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗分組40只1日齡的羅斯308肉雞被隨機(jī)分成A、B、C、D 4組，每組10只，A組雛雞從1日齡開始正常飲水和飼喂飼料；B組雛雞從1日齡開始往飲用水中添加0.15 g/L(獸藥典推薦劑量)的氟苯尼考(FFC)，連用5 d;C組雛雞從1日齡開始分別往飲用水中添加0.15 g/L(獸藥典推薦劑量)的氟苯尼考(FFC)和5.00 g/L的丹參多糖(SMPs)，連用5 d;D組雛雞從1日齡開始往飲用水中添加5.00 g/L的丹參多糖(SMPs)，連用5 d。5 d后，各組雛雞自由飲用自來水，正常飼喂飼料；飼養(yǎng)至42日齡，試驗雞翅下靜脈采血，并處死采取雞的肝臟。

1.3 測定增重、肝臟指數(shù)及料肉比各組1日齡雛雞記錄初始體質(zhì)量，飼喂到42日齡后再次對各組肉雞稱重，然后計算兩者差值作為各組雛雞的體質(zhì)量增加量；并在各組隨機(jī)選取10只肉雞處死，摘取其肝臟稱重計算肝指數(shù)，肝指數(shù)=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。并計算整個飼養(yǎng)期各組的料肉比，料肉比=每組肉雞總消耗飼料量(kg)/每組肉雞總增重(kg)。

1.4 雞全血中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(RGB)和血小板(PLT)的含量測定采取各組42日齡雞血液置于抗凝管，將血液與抗凝劑充分混合，利用全自動血液細(xì)胞計數(shù)儀檢測全血中WBC、RBC、RGB和PLT的含量。

1.5 檢測雛雞血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量采取各組雞血液置于促凝管，將其傾斜置于4℃冰箱1 h，然后低速離心分離得到血清。利用分光光度計測定D值，并計算各組雛雞血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量。

1.6 ELISA檢測肝組織中CYP1A1和 CYP2H1的含量將各組肉雞肝臟組織制作成10%的組織勻漿，離心后取上清液,用ELISA試劑盒檢測肝組織勻漿上清液中CYP1A1和CYP2H1的含量。

1.7 RT-QPCR檢測肝組織內(nèi)CYP1A1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平使用總RNA提取試劑盒(Promega，Beijing，China)從肝臟中提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。通過實時定量熒光PCR方法檢測肝臟中CYP1A1、CYP2H1、UGT2A1、GSTT1、Nrf2、HO-1、NQO-1、P53、CytC、Caspase-3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。引物由TaKaRa(大連，中國)設(shè)計合成(表1)。預(yù)變性處理為95℃ 120 s，擴(kuò)增進(jìn)行45個循環(huán)，包括95℃ 5 s，64℃ 30 s；然后72℃ 30 s。內(nèi)參基因為β-actin，由2-ΔΔCt計算每個基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 氟苯尼考對肉雞增重的影響由表2可知，與空白組相比，0.15 g/L的氟苯尼考能引起雛雞增重顯著下降、肝指數(shù)的顯著升高(P<0.05)；還能增加肉雞飼養(yǎng)過程中的料肉比；而與氟苯尼考組相比，5.00 g/L 的丹參多糖能顯著提高肉雞的增重(P<0.05)，顯著抑制肉雞肝臟指數(shù)的增高(P<0.05)，降低肉雞飼養(yǎng)過程中的料肉比。

表2 各組雛雞平均增重、肝臟指數(shù)和料肉比

2.2 不同劑量氟苯尼考對雞全血中WBC、RBC、RGB和PLT含量的影響由表3可知，與空白組相比，氟苯尼考均會導(dǎo)致肉雞血液中RBC的數(shù)量和RGB的含量顯著降低(P<0.05)，肉雞血液中WBC數(shù)量和PLT含量卻無顯著改變(P>0.05)。而丹參多糖能顯著緩解氟苯尼考導(dǎo)致的肉雞血液中RBC的數(shù)量和RGB含量的降低(P<0.05)。

表3 全血中各成分的計數(shù)

2.3 丹參多糖對雞血清中生化指標(biāo)含量的影響檢測肉雞血清中生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考組雞血清中MDA和NO 的含量均顯著高于空白對照組血清中MDA和NO的含量(P<0.05)，氟苯尼考組雞血清中CAT顯著低于空白對照組雞血清中CAT的含量(P<0.05)；而用丹參多糖處理后能顯著緩解氟苯尼考導(dǎo)致的肉雞血清中MDA和NO含量的升高和CAT含量的下降(P<0.05)。各組肉雞血清中ALT、AST和SOD的含量卻沒有顯著差異(P>0.05)，結(jié)果詳見表4。

表4 各組肉雞血清中生化指標(biāo)的含量

2.4 丹參多糖對肉雞肝臟內(nèi)藥物代謝酶表達(dá)的影響如圖1A所示，與空白對照組組相比，氟苯尼考組肉雞肝組織中CYP1A1含量及 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降(P<0.05)，而CYP2H1的含量及mRNA的轉(zhuǎn)錄水平卻沒有顯著性差異(P>0.05)；另外，我們檢測肝臟藥物代謝Ⅱ相反應(yīng)中關(guān)鍵酶GSTT1和UGT2A1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示氟苯尼考能顯著降低肉雞肝組織中GSTT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05)，而對UGT2A1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)；丹參多糖干預(yù)后，肉雞肝組織中GSTT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

A.各組雛雞肝組織中CYP1A1和CYP2H1的含量；B.各組雛雞肝組織中CYP1A1、CYP2H1、GSTT1和UGT2A1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

2.5 丹參多糖對雞肝組織中Nrf2 通路關(guān)鍵因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響如圖2所示，與空白對照組相比，氟苯尼考能顯著降低肝臟中Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05);而與氟苯尼考組相比，5.00 g/L的丹參多糖能顯著提高肝臟中Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平(P<0.05)；而HO-1和NQO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在各組中均沒有差異(P>0.05)。

圖2 各組雛雞肝組織中Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

據(jù)報道，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)氟苯尼考對7日齡以內(nèi)肉雞的生長性能、造血功能以及肝臟的功能均有一定的損傷作用[7]。而到42日齡時，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)的氟苯尼考仍顯著抑制肉雞的增重，而對造血功能和肝臟的功能損傷有所減輕。

本試驗結(jié)果表明，42日齡時，丹參多糖對氟苯尼考導(dǎo)致的肉雞生長抑制、肝臟功能損傷均有極好的緩解作用，基本恢復(fù)正常水平。

越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在藥物性肝損傷中扮演重要角色。肝臟是機(jī)體重要的代謝器官，肝臟內(nèi)形成很多的抗氧化系統(tǒng)，能夠在正常情況下維持肝臟的代謝。但過量的ROS會導(dǎo)致肝臟的抗氧化系統(tǒng)紊亂，造成氧化損傷[19-20]。為了檢測丹參多糖是否通過抑制肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激來緩解肝臟的損傷，本試驗檢測了氧化應(yīng)激的標(biāo)志物MDA、NO以及關(guān)鍵抗氧化酶SOD、CAT含量，結(jié)果顯示FFC誘導(dǎo)后，MDA、NO含量明顯地升高，說明機(jī)體內(nèi)還存在一定的氧化應(yīng)激；而丹參多糖干預(yù)后，肉雞肝組織中MDA和NO含量的下降表明機(jī)體的應(yīng)激防御功能被激活，進(jìn)而緩解肉雞肝細(xì)胞損傷。據(jù)報道，Nrf2信號通路作為協(xié)調(diào)因子，在抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中起到重要的作用[21]。其通過誘導(dǎo)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的組成型和誘導(dǎo)型表達(dá)，有利于改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活以及維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[22-23]。而本試驗結(jié)果表明，丹參多糖通過激活Nrf2及其下游蛋白的表達(dá)，改善了氟苯尼考誘導(dǎo)的肉雞藥物性肝損傷。此外，Nrf2作為氧化應(yīng)激中的關(guān)鍵分子，可以調(diào)控下游HO-1和NQO-1等蛋白的表達(dá)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂肪積累中起到重要的作用[24-25]，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹參多糖能夠提高HO-1和NQO-1的表達(dá)水平，說明SMPs有增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化的能力并能調(diào)控肝細(xì)胞的脂肪代謝。

藥物本身或代謝產(chǎn)物的直接肝細(xì)胞損傷，導(dǎo)致肉雞肝損傷最常見的就是抗生素、黃曲霉毒素、重金屬等，它們的代謝產(chǎn)物大多都具有肝毒性[26]。藥物在肝臟中需進(jìn)行兩步反應(yīng)，即Ⅰ相和Ⅱ相反應(yīng)。Ⅰ相反應(yīng):將藥物進(jìn)行水解、氧化、還原，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，主要的代謝酶是細(xì)胞色素 P450(CYP)，CYP1A1 及 CYP2H1 等都是導(dǎo)致藥物性肝損傷相關(guān)的關(guān)鍵性氧化酶[27]。因此，肝細(xì)胞內(nèi)肝藥酶的含量對肝臟的解毒能力有直接的關(guān)系。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：42日齡時，氟苯尼考對肉雞肝臟內(nèi)肝藥酶的活性仍有一定的抑制作用，而丹參多糖干預(yù)后能顯著恢復(fù)肝臟內(nèi)肝藥酶的活性。在Ⅱ相反應(yīng)中，谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是一組與肝臟解毒功能有關(guān)的酶，其谷胱甘肽和自由基結(jié)合，促進(jìn)有毒物質(zhì)從體內(nèi)清除，降低藥物潛在毒性，GSTs 功能障礙會導(dǎo)致急性肝損傷的發(fā)生[28]。當(dāng)肝臟嚴(yán)重?fù)p傷時，GST 和 GSH 將從 肝細(xì)胞質(zhì)中釋放到血漿中，導(dǎo)致肝細(xì)胞質(zhì)中GST 活性降低[29]。因此，臨床上對肝組織中GSTs 活性水平的監(jiān)測可能是診斷DILI 的潛在策略。我們的研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考能顯著抑制GSTT1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，說明氟苯尼考能夠抑制肝臟代謝藥物的能力，造成大量的藥物代謝物在肝臟中聚集，進(jìn)而損傷肝臟的功能。而丹參多糖能夠提高GSTT1的含量，恢復(fù)肝臟功能。除此之外，尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UDP glucuronosyl transferase，UGT)作為Ⅱ相反應(yīng)中另外一個重要的轉(zhuǎn)移酶，多項研究表示UGTs基因與藥物性肝損傷具有顯著相關(guān)性[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)各組肉雞肝組織UGT2A1的表達(dá)沒有顯著差異。這可能是42日齡時，氟苯尼考對肉雞肝臟功能損傷較輕微，沒有引起尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶活性的顯著改變。