王佳 褚雨霆 王沖 侯麗 郎海燕 陳科 陳信義 張雅月

摘要 目的：觀察“從脾論治方”對原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）小鼠血管活性因子的影響，探討“從脾論治方”的止血效應(yīng)機制。方法：以被動型免疫造模法建立ITP小鼠模型，以潑尼松、歸脾湯、健脾益氣方、健脾益氣攝血方為干預(yù)藥物，以ELISA檢測模型小鼠血清血管內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、血管性血友病因子（vWF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、前列腺素（PG）、前列環(huán)素（PGI2）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶3（NOS3）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）水平。結(jié)果：1）升血小板療效：注射APS后第15天（給藥第8天），模型對照組小鼠外周血血小板計數(shù)（PLT）仍顯著低于正常對照組，而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），并且明顯高于模型對照組。2）止血療效：注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向，藥物干預(yù)第6天及第8天，各觀察組出血等級明顯低于模型對照組。3）血管促凝活性因子：實驗各組VCAM-1水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對照組和潑尼松組，健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。4）血管抗凝活性因子：實驗各組TM水平明顯低于正常對照組，健脾益氣攝血組TM水平顯著低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：“從脾論治”方可以升高ITP模型小鼠外周血PLT，降低出血分級，并且可以通過上調(diào)VCAM-1、下調(diào)TM檢測值調(diào)節(jié)促凝與抗凝活性因子的動態(tài)平衡。

關(guān)鍵詞 從脾論治;原發(fā)免疫性血小板減少癥;血管活性因子;血管促凝活性因子;血管抗凝活性因子

Abstract Objective：To observe the effect of “Congpi Lunzhi Formula” on vasoactive factors in ITP mice，and to explore the hemostatic effect mechanism of “Congpi Lunzhi Formula”.Methods：The ITP mice immune model was established by means of passive immunization.Prednisone，Guipi Decoction，Jianpi Yiqi Decoction，Jianpi Yiqi Shexue Formula were used as intervention drugs，and serum ET-1，NO，NOS3，TXA2，PGI2，vWF，VCAM-1 of model mice were detected by ELISA and TM levels were detected by ELISA.Results：1）Increasing efficacy of platelet：On the 15th day after APS injection（the 8th day of administration），the PLT count in the peripheral blood of the model control group was still significantly lower than that of the normal control group，while the peripheral blood PLT of the mice in the model control group was lower than the normal control group.However，the peripheral blood PLT of mice in each administration group had no statistical difference compared with the normal control group，and was significantly higher than the model control group.2）Hemostatic effect：After injection of APS，mice in each group have different degrees of bleeding tendency.On the 6th and 8th day of drug intervention，the bleeding level of each experimental group was significantly lower than that of the model control group.3）Vascular procoagulant activity factors：the levels of VCAM-1 in each experimental group were significantly lower than those in the normal control group; the levels of VCAM-1 in the Jianpi Yiqi group and the Guipi Decoction group were significantly higher than those in the model control group and the prednisone group.The level of VCAM-1 in the Jianpi Yiqi Shexue group was significantly higher than that in the prednisone group.4）Vascular anticoagulant activity factors：the TM levels of each experimental group were significantly lower than those of the normal control group，and the TM levels of Jianpi Yiqi Shexue group were significantly lower than the model control group.Conclusion：Treatment from spleen could improve PLT count of ITP model mice，degrade the bleeding scale.Moreover，it can upregulate VCAM-1，downregulate TM，keep the dynamic balance of coagulant and anticoagulant factors.

Keywords Treatment from spleen; Immune thrombocytopenic purpura; Vasoactive factors; Vascular coagulant active element; Vascular anticoagulant active element

中圖分類號：R242文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.11.011

原發(fā)免疫性血小板減少癥（Immune Thrombocytopenic Purpura，ITP）以外周血小板破壞增多，以及骨髓生成血小板減少為主要病理表現(xiàn)，是臨床常見的血液系統(tǒng)出血性疾病。目前對于ITP發(fā)病機制尚不完全清晰，公認(rèn)的發(fā)病機制系多重因素導(dǎo)致的自身免疫功能紊亂[1-2]。根據(jù)中醫(yī)學(xué)理論，結(jié)合慢性ITP的臨床特征，其發(fā)病系脾氣虛弱，不能正常發(fā)揮統(tǒng)攝血液的功能所致[3]。因此，“從脾論治”是ITP的基本治療原則[4-5]。課題組在前期臨床與實驗研究基礎(chǔ)上，采用被動免疫造模法成功復(fù)制了ITP動物模型[6-8]。本研究利用ITP模型小鼠，選擇歸脾湯、健脾益氣攝血方、健脾益氣方和潑尼松為干預(yù)藥物，以外周血血小板計數(shù)（PLT）、出血程度分級、血管相關(guān)促凝及抗凝活性因子為檢測指標(biāo)，試圖從血管活性因子動態(tài)平衡的角度探索“從脾論治”緩解ITP出血的效應(yīng)機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

豚鼠100只（雌雄各半），體質(zhì)量250 g，許可證號：SCXK（陜）2012-001（陜西省興平市天瑞實驗動物養(yǎng)殖廠），普通環(huán)境飼養(yǎng);BALB/c小鼠160只（雌雄各半），體質(zhì)量18～22 g，許可證號：SCXK（陜）2014-002（原解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心），無特定病原體（SPF）級實驗室IVC鼠籠飼養(yǎng)。其中，40只用于抗小鼠血小板血清制備，120只用于造模并進(jìn)行療效機制研究。該研究通過倫理委員會審批（倫理審批號：XYLS2019069）。

1.1.2 藥物

實驗用中藥浸膏由西安星華藥物研究所按照中藥新藥藥學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制備并提供（批號：20140322）：健脾益氣攝血浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、阿膠、茜草、炙甘草）。健脾益氣浸膏（黃芪、黨參、茯苓、白術(shù)、炙甘草）。歸脾湯浸膏（人參、白術(shù)、當(dāng)歸、茯苓、黃芪、龍眼肉、遠(yuǎn)志、炒酸棗仁、木香、炙甘草）。潑尼松（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：28778）。

1.1.3 試劑與儀器

對硝基苯磷酸二鈉（上海晶純生化科技股份有限公司，批號：H1419017）;弗氏完全佐劑（Sigma-Aldrich，美國，批號：SLBF2619V），弗氏不完全佐劑（Sigma-Aldrich，美國，批號：SLBH7317V）;凍干酶聯(lián)A蛋白（博士德生物，批號：BST07A19B80）;疊氮化鈉（鄭州派尼化學(xué)試劑廠，批號：20140515）;二乙醇胺（天津市科密歐化學(xué)試劑有限責(zé)任公司，批號：20140110）;小鼠血清ET-1、NO、NOS3、TXA2、PGI2、vWF、VCAM-1、TM試劑盒（武漢基因美生物科技有限公司，批號：201411）。微量高速離心機（湖南長沙湘儀檢測設(shè)備有限公司，型號：H1650-W）;全波長酶標(biāo)儀（美國賽默飛科技公司，美國，型號：Multiskan GO no.51119300）;全自動動物血液分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，型號：XFA6130）。

1.2 方法

1.2.1 抗小鼠血小板血清（Anti-platelet Serum，APS）制備與效價檢測

本研究中APS的制備與效價檢測方法沿用課題組在國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（2013CB531705）“脾主運化、主統(tǒng)血等臟象理論研究”項目下的“脾不統(tǒng)血所致血小板減少性紫癜從脾論治的療效機制及規(guī)律研究”課題中使用的方法[6-8]。

1.2.2 造模與分組給藥

從120只小鼠尾靜脈取血，用全自動血液分析儀檢測PLT，隨機分為6組（正常對照組，模型對照組，潑尼松組，歸脾湯組，健脾益氣組，健脾益氣攝血組），每組20只。給予正常對照組小鼠生理鹽水腹腔注射（100 μL/20 g），其余5組1次/d腹腔注射黃芪多糖注射液（APS）（100 μL/20 g），直至實驗結(jié)束。注射APS第8天開始，除正常對照組和模型對照組外，其余4組均按照0.1 mL/10 g體積灌胃給藥，實驗結(jié)束后（注射APS第15天）進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。

1.2.3 外周血PLT檢測

分別于注射APS前、注射后48 h、第8天（開始給藥）、第12天以及第15天，從各組小鼠尾靜脈取血，用全自動血液分析儀檢測各組小鼠外周血PLT。

1.2.4 出血程度分級觀察

參照2010年衛(wèi)生部醫(yī)政司發(fā)布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》，結(jié)合動物實驗特點，將出血程度分4級[9]。0級：無出血現(xiàn)象。Ⅰ級：注射部位輕度出血，其他部位有散在出血點。Ⅱ級：注射部位明顯出血，并見有其他部位瘀斑、瘀點。Ⅲ級：注射部位嚴(yán)重出血，皮膚大量瘀斑、瘀點，或皮膚發(fā)黑或破潰。觀察時間點為注射APS第8天（用藥前）、注射APS第13天（用藥第6天）、注射APS第15天（用藥第8天）3個時間點動態(tài)觀察出血分級變化。

1.2.5 血管活性因子檢測

實驗結(jié)束后，各組隨機取12只小鼠予以斷頸處死，取腹主動脈血，稍靜置，上機560×g離心，收集血清，根據(jù)酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）試劑盒說明書，進(jìn)行各項指標(biāo)檢測。其中，6只小鼠血清用于血管促凝活性因子血管內(nèi)皮素-1（ET-1）、血栓素A2（TXA2）、血管性血友病因子（vWF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）檢測;6只小鼠血清用于血管抗凝活性因子前列腺素（PG）、前列環(huán)素（PGI2）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶3（NOS3）、血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）檢測。酶標(biāo)儀測定OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析所有數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間多重比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，計數(shù)資料則采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價測定結(jié)果

APS血清組OD值平均為0.300，空白孔OD值平均為0.163，相差約2倍（P<0.01）。

2.2 升血小板療效

注射APS前各組小鼠外周血PLT比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。注射APS后的48 h，實驗各組小鼠外周血PLT均顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示已成功建立血小板減少模型。注射APS第8天（開始給藥）到第12天，實驗各組小鼠外周血PLT仍然顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。注射后第15天（給藥第8天），模型對照組小鼠外周血PLT仍顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），證明實驗藥物可明顯提高實驗小鼠外周血PLT。其中，潑尼松組（P<0.01），健脾益氣攝血組（P<0.01），歸脾湯組（P<0.05），以及健脾益氣組（P<0.05）小鼠外周血PLT均明顯高于模型對照組，提示潑尼松與“從脾論治方”在提升ITP模型小鼠外周血PLT方面具有明顯優(yōu)勢。見表1。

2.3 止血療效

注射APS造模后小鼠出現(xiàn)不同程度出血。如圖1所示，處死小鼠腹腔中有大量出血，腹膜遍布出血點，提示造模成功。

按照觀測時間點以及出血分級標(biāo)準(zhǔn)，每組隨機觀察10只小鼠出血分級變化。給藥前（注射APS第8天），除正常對照組外，實驗各組出血程度分級分布經(jīng)非參數(shù)檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.998），提示組間具有可比性。說明注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向。藥物干預(yù)第6天，各組出血等級顯著降低，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.014）。下降幅度從大到小依次為潑尼松組（P=0.002）、健脾益氣攝血組（P=0.003）、歸脾湯組（P=0.003）、健脾益氣組（P=0.021）。藥物干預(yù)各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。藥物干預(yù)第8天，各組出血等級明顯下降，與模型對照組比較，經(jīng)非參數(shù)檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。出血等級下降幅度從大到小依次為潑尼松組（P<0.01）、健脾益氣攝血組（P<0.01）、歸脾湯組（P<0.01）、健脾益氣組（P<0.01）。藥物干預(yù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.4 血管促凝活性因子

ET-1：實驗各組與正常對照組比較，ET-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。TXA2：實驗各組與正常對照組、模型對照組比較，TXA2水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;各給藥組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。vWF：實驗各組與正常對照組比較，vWF水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。VCAM-1：實驗各組與正常對照組比較，VCAM-1水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;但是健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對照組和潑尼松組（P<0.01），健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;健脾益氣組和歸脾湯組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.5 血管抗凝活性因子

NO：實驗各組與正常對照組比較，NO水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。NOS3：除歸脾湯組外，各組檢測值與正常對照組比較均明顯下降（P<0.05），歸脾湯組NOS3水平顯著高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其余各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。PGI2：與正常對照組比較，只有健脾益氣組和歸脾湯組PGI2水平明顯下降（P<0.01），其中歸脾湯組PGI2水平顯著低于模型對照組（P<0.05）。TM：實驗各組與正常對照組比較TM水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;健脾益氣攝血組顯著低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

3 討論

從骨髓巨核細(xì)胞分化產(chǎn)生的血小板在機體止血和凝血過程中發(fā)揮著重大作用，當(dāng)ITP患者外周血小板計數(shù)低于50×109/L時，則存在出血發(fā)生的風(fēng)險，ITP出血與患者外周血PLT數(shù)量及其質(zhì)量密切相關(guān)[10]。然而在臨床實際中，許多ITP特別是慢性ITP患者，雖然外周血PLT低于50×109/L，甚至低于安全水平（30×109/L），但其出血傾向并不明顯。有些患者經(jīng)相關(guān)治療后外周血PLT依然處于較低水平，但是并沒有伴隨明顯的出血癥狀?？梢奍TP患者外周血PLT減少并不是導(dǎo)致出血的唯一因素，很可能是參與凝血機制多個環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果。

其中，血管及其血管分泌的活性因子發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[11]。血管是生物體運送血液的管道，除維持血液與組織間物質(zhì)交換外，正常血管中存在大量的活性物質(zhì)，以調(diào)控血管生理狀態(tài)。特別是血管內(nèi)皮細(xì)胞是分泌、合成和釋放血管活性物質(zhì)的重要場所，這些活性物質(zhì)具有舒縮血管、調(diào)控血管張力與促進(jìn)血液凝固的多重效果。

舒張血管活性因子與抗凝機制關(guān)系密切，主要包括前列腺素：前列腺素（PG）及其代謝后的衍生物如前列環(huán)素（PGI2）。其對血液凝固作用主要是導(dǎo)致血管舒張，抑制血小板聚集與調(diào)節(jié)血小板活化[12]。一氧化氮和一氧化氮合酶3：一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶3（NOS3）可以通過松弛平滑肌，使血管擴張，從而穿過細(xì)胞膜進(jìn)入血管腔，降低血小板的凝集和黏附性，發(fā)揮舒張血管和抗凝作用[13]。血栓調(diào)節(jié)蛋白：血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）是使凝血酶由促凝轉(zhuǎn)向抗凝的重要血管內(nèi)凝血抑制因子，主要是調(diào)節(jié)機體凝血與抗凝血動態(tài)平衡[14]。

收縮血管活性因子與凝血機制密切相關(guān)，主要包括血管內(nèi)皮素：血管內(nèi)皮素（ET）是維持血管張力的重要內(nèi)源性活性因子，具有長效收縮血管的作用。在ET系統(tǒng)的3個肽配體中，血管內(nèi)皮素-1（ET-1）收縮血管的作用最強，其對血管特別是微小血管的收縮作用有利于血液凝固和止血[15]。血栓素A2：血栓素A2（TXA2）是一強血管收縮因子，可以激活血小板、使其聚集，有利于修復(fù)組織損傷和止血[16]。血管性血友病因子：血管性血友病因子（vWF）是一種有黏附性的多聚體糖蛋白。與血小板膜GPⅠb-Ⅸ復(fù)合物及細(xì)胞內(nèi)皮下膠原結(jié)合，介導(dǎo)血小板在血管損傷部位黏附以及與因子凝血因子Ⅷ結(jié)合來有效止血[17]。此外，vWF也能結(jié)合GPⅡb-Ⅲa，參與血小板聚集過程。血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1：血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）是一種介導(dǎo)細(xì)胞間或者細(xì)胞和外基質(zhì)間相互作用的細(xì)胞黏附分子，其活性降低會導(dǎo)致血管通透性增加，組織缺血與缺氧，增加血液外滲[18]。

控制血管張力的血管舒縮活性因子是一對矛盾的統(tǒng)一體。一般認(rèn)為，血管舒張活性因子具有抗凝效應(yīng)，既是預(yù)防血栓形成的關(guān)鍵因子，也是影響血液凝固/止血的重要物質(zhì);血管收縮活性因子具有促進(jìn)凝血效應(yīng)，既是血栓形成的危險因素，也是促進(jìn)血液凝固/止血的關(guān)鍵。二者的動態(tài)平衡在不同的疾病中擔(dān)當(dāng)不同角色。當(dāng)機體發(fā)生血小板減少特別是原發(fā)免疫性血小板減少癥，紊亂的免疫機制可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管分泌、合成和釋放血管活性因子比例失調(diào)，直接或間接影響了血管舒縮與凝血功能。因此，有效的調(diào)節(jié)血管舒縮活性因子，能在ITP患者低血小板數(shù)值情況下，預(yù)防出血風(fēng)險或達(dá)到止血效果?；诖耍n題組在臨床實踐中，確立了“從脾論治”ITP的重要治則[19]，擬定了“從脾論治”的健脾益氣攝血方。前期臨床試驗證明，該方可明顯提升ITP患者外周血PLT，改善出血與相關(guān)臨床癥狀[20-21]。動物實驗也證實，該方具有提升模型小鼠外周血PLT與良好的止血效果[22-25]，并明確了部分效應(yīng)機制[26-28]。為進(jìn)一步探討“從脾論治”ITP療效機制，我們以健脾益氣攝血方（四君子湯加炙黃芪、阿膠、茜草）為標(biāo)準(zhǔn)觀察藥物，選擇健脾益氣方（四君子湯加炙黃芪）、歸脾湯原方為“從脾論治”方，觀察三方對ITP動物模型外周血PLT、出血程度分級與血管活性因子影響。經(jīng)效價檢測，證實本研究所制備的血清有效[4]。研究結(jié)果顯示：注射APS后第15天（給藥第8天），模型對照組小鼠外周血PLT仍顯著低于正常對照組，而各給藥組小鼠外周血PLT與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，并且明顯高于模型對照組;注射APS后各組小鼠均有不同程度出血傾向，藥物干預(yù)第6天及第8天，各觀察組出血等級明顯低于模型對照組，提示“從脾論治”方可有效提升ITP小鼠外周血小板數(shù)值，緩解出血癥狀。此外，造模成功后模型對照組VCAM-1和TM水平顯著降低，而健脾益氣組和歸脾湯組VCAM-1水平均顯著高于模型對照組和潑尼松組，健脾益氣攝血組VCAM-1水平明顯高于潑尼松組，健脾益氣攝血組TM水平也顯著低于模型對照組，可見“從脾論治”方可提升ITP小鼠外周血VCAM-1水平，并且降低TM檢測值。

綜上所述，“從脾論治”方除具有提升ITP模型小鼠外周血PLT、降低出血分級作用以外，其上調(diào)血管促凝活性因子VCAM-1，下調(diào)血管抗凝活性因子TM檢測值，調(diào)節(jié)促凝與抗凝活性因子的動態(tài)平衡可能是其有效止血的效應(yīng)機制之一。

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（2020-02-24收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）