牟莉，康琴，賀小峰，葉琳洋，李剛

(1.長春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春 130022；2.吉林省食品檢驗(yàn)所，長春 130023)

食品香精香料主要是改善、增加和模仿食品香氣和香味的食品添加劑，并具有組成復(fù)雜、易揮發(fā)、不穩(wěn)定等特點(diǎn)[1-4]。在分析食品香精香料成分的過程中，恰當(dāng)?shù)那疤幚矸椒▽ρ芯拷Y(jié)果會起到關(guān)鍵作用。目前在揮發(fā)性物質(zhì)的提取方法中應(yīng)用較為廣泛的有水蒸氣蒸餾法、蒸餾萃取法、靜態(tài)頂空法、減壓蒸餾法、超臨界CO2萃取法、固相微萃取法等[5-9]，每種提取方法都有著自身優(yōu)勢和不足。氣-液微萃取技術(shù)(GLME)作為一種較新穎的便攜式前處理方法，目前還未有相關(guān)報(bào)道將氣-液微萃取技術(shù)(GLME)應(yīng)用在食品的香精香料檢測的前處理技術(shù)中。利用氣-液微萃取技術(shù)(GLME)在限定的溫度范圍內(nèi)將樣品中的揮發(fā)性成分幾乎完全地吹掃捕集出來的特點(diǎn)[10-12]，將其應(yīng)用于分析食品中常用的香精香料(乙基麥芽酚、香葉醇、香豆素、丁香酚、八角茴香油)的研究。因此，在氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的優(yōu)化過程中，考察提取溫度、提取時間、冷凝溫度和氣體流速這4項(xiàng)因素，并通過單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化相結(jié)合的方法具體實(shí)現(xiàn)氣-液微萃取技術(shù)GLME應(yīng)用于食品中常用香精香料成分的研究中。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

超純水；二氯甲烷(色譜純，純度95%，TEDIA)；甲醇(色譜純，純度95%，TEDIA)；乙基麥芽酚(純度99%，百靈威)；香葉醇(純度98%，百靈威)；八角茴香油、香豆素(純度98%，百靈威)；丁香酚(純度98%，百靈威)；無水硫酸鈉(分析純，使用前在400 ℃條件下灼燒12 h，貯于干燥器中，冷卻后備用)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石英玻璃棉(使用前400 ℃活化10 h)：奧瑞斯新材料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

ME-101氣-液微萃取儀 延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制開發(fā)；GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津(SHIMADZU)公司；移液槍。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液：精確稱取5種標(biāo)準(zhǔn)品各0.1000 g置于同一個100 mL的棕色容量瓶中，利用甲醇溶解并定容至刻度，配制成1000.0 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，貯藏備用。

標(biāo)準(zhǔn)混合溶液使用液：分別精確移取儲備液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇定容，依次配制成20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

2 氣-液微萃取技術(shù)(GLME)操作條件優(yōu)化

氣-液萃取儀的工作原理：通過恒定流速的惰性氣體(N2)將置于設(shè)定溫度下加熱槽內(nèi)樣品中的揮發(fā)性目標(biāo)化合物吹掃至帶有可以調(diào)節(jié)溫度的冷凝器的樣品池內(nèi)進(jìn)行捕集，再經(jīng)過儀器的精確定容，即完成整個前處理過程。整個過程可以一體化完成對目標(biāo)化合物的定量提取，并具有耗時短、操作簡便、節(jié)約成本和便于現(xiàn)場操作等優(yōu)勢。

加標(biāo)樣品溶液的配制：向100 mL的棕色容量瓶中移取10.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備液，用超純水定容至刻度，備用。

2.1 氣-液微萃取技術(shù)(GLME)操作條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對食品香精香料回收率的影響

設(shè)定氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的操作條件：提取時間4 min、冷凝溫度-4 ℃、氣體流速2.0 mL/min。提取溫度分別為240，250，260，270，280，290，300 ℃，考察不同提取溫度對樣品加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 不同提取溫度下樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果Fig.1 The recovery rates of of samples at different extraction temperatures

由圖1可知，當(dāng)提取溫度在240～270 ℃梯度內(nèi)，5種標(biāo)準(zhǔn)品中除香豆素外樣品的加標(biāo)回收率均呈上升趨勢；當(dāng)提取溫度在280～300 ℃梯度內(nèi)，5種標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率都呈現(xiàn)出下降的趨勢。這種溫度升高而加標(biāo)回收率降低的現(xiàn)象產(chǎn)生與標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變相關(guān)，在溫度不斷升高的同時可能發(fā)生了裂解反應(yīng)或是形成了同分異構(gòu)體，因此本文中提取溫度的最佳值應(yīng)該在270 ℃左右。

2.1.2 提取時間對食品香精香料回收率的影響

設(shè)定氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的操作條件：提取溫度270 ℃、冷凝溫度-4 ℃、氣體流速2.0 mL/min，提取時間分別設(shè)為4，5，6，7，8 min。最后經(jīng)GC-MS解析，考察不同提取時間對樣品加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同提取時間下樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果Fig.2 The recovery rates of of samples at different extraction time

由圖2可知，提取時間在4～7 min階段中，5種標(biāo)準(zhǔn)品的加標(biāo)回收率均呈緩慢上升趨勢；7 min后，樣品的加標(biāo)回收率的變化基本趨于平緩，說明當(dāng)提取時間作為單一變量條件時，在提取時間達(dá)到某一臨界值后，過多的提取時間并不會對實(shí)驗(yàn)造成很大的影響，并且過長的提取時間反而會浪費(fèi)實(shí)驗(yàn)時間，即提取時間達(dá)到飽和值后，持續(xù)增加提取時間會降低氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的工作效率，因此最適提取時間選取7 min。

2.1.3 冷凝溫度對香精香料回收率的影響

設(shè)定氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的操作條件：提取溫度270 ℃、氣體流速2.0 mL/min、提取時間7 min，冷凝溫度分別設(shè)為-5，-4，-3，-2，-1，0 ℃，考察不同冷凝溫度對樣品的加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同冷凝溫度下樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果Fig.3 The recovery rates of of samples at different condensation temperatures

由圖3可知，冷凝溫度對于氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的提取影響較為顯著，當(dāng)冷凝溫度從-5 ℃升高至-2 ℃的過程中，樣品的加標(biāo)回收率增加趨勢明顯，當(dāng)冷凝溫度處于-2 ℃時，5種標(biāo)準(zhǔn)品的回收率均處于實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的最高值；當(dāng)冷凝溫度繼續(xù)升高后，回收率開始明顯降低，說明冷凝溫度需要達(dá)到一定程度時，才可以較好地完成氣相向液相的轉(zhuǎn)變，使得通過GLME提取的揮發(fā)性物質(zhì)可以盡可能地接收回來，因而選取-2 ℃為最佳冷凝溫度。

2.1.4 氣體流速對食品香精香料加標(biāo)回收率的影響

設(shè)定氣-液微萃取技術(shù)(GLME)的操作條件：提取溫度270 ℃、冷凝溫度-4 ℃、提取時間7 min，氣體流速分別設(shè)為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min，考察不同氣體流速對樣品加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同氣體流速下樣品的加標(biāo)回收率結(jié)果Fig.4 The recovery rates of of samples at different gas flow rates

由圖4可知，提取過程中當(dāng)氣體流速在1.0～2.5 mL/min的梯度范圍內(nèi)，樣品的加標(biāo)回收率顯著提高，當(dāng)氣體流速在2.5 mL/min時，樣品的加標(biāo)回收率處于峰值；而繼續(xù)提高氣體流速后回收率明顯下降，證明過快的氣體流速雖然在理論上可以增大一定的接觸面積，但是在密閉環(huán)境下過快的氣體流速使得吹掃狀態(tài)變得不穩(wěn)定，使樣品中的揮發(fā)性成分無法穩(wěn)定地被吹掃捕集，因而以2.5 mL/min作為氣-液微萃取技術(shù)(GLME)操作過程中最適宜的氣體流速。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化

采取3水平Box-Behnken的響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化氣-液微萃取技術(shù)(GLME)對提取5種食品香精香料中揮發(fā)性成分的操作條件(提取溫度A、提取時間B、氣體流速C、冷凝溫度D這4個因素)，以樣品的加標(biāo)回收率作為響應(yīng)變量，利用Design Expert 11.1.0.1軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，從而可以得到最適宜的氣-液微萃取技術(shù)(GLME)對提取香精香料中揮發(fā)性成分的操作條件。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及其響應(yīng)值Table 1 Response surface experimental data and response values

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Response surface experimental data

續(xù) 表

3 結(jié)果與討論

3.1 響應(yīng)面模型擬合

利用Design Expert 11.1.0.1軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)并處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到4個因素與樣品加標(biāo)回收率的二元多次回歸方程公式：

Y1=2.007A+9.137B+9.458C+0.667D-0.006AB+0.002AC-0.009AD+0.008BC-0.024BD+0.024CD-0.004A2-0.537B2-1.990C2-0.500D2-233.670。

(1)

Y2=2.004A+8.964B+10.120C+1.218D-0.006AB-0.001AC-0.010AD+0.008BC-0.055BD+0.024CD-0.004A2-0.529B2-1.999C2-0.489D2-214.024。

(2)

Y3=1.946A+9.468B+10.507C+0.891D-0.006AB-0.001AC-0.010AD-0.043BC-0.021BD+0.024CD-0.004A2-0.550B2-2.010C2-0.497D2-226.807。

(3)

Y4=1.979A+9.210B+10.046C+0.907D-0.006AB-0.001AC-0.010AD+0.008BC-0.024BD+0.024CD-0.004A2-0.541B2-1.985C2-0.500D2-209.803。

(4)

Y5=6.109A+27.082B+48.853C+5.221D-0.016AB-0.081AC-0.030AD+1.414BC-0.256BD-0.649CD-0.011A2-1.905B2-7.640C2-1.673D2-873.601。

(5)

其中，A為GLME操作條件中的提取溫度；B為GLME操作條件中的提取時間；C為GLME操作條件中的氣體流速；D為GLME操作條件中的冷凝溫度。由上述公式可知，A、B、C、D、AC、BC、CD對加標(biāo)樣品的回收率起協(xié)同作用。

3.2 響應(yīng)面的方差分析

在表3中，p值<0.05的交互因素有AD；在表4中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表5中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表6中，p值<0.05的交互因素有AB、AD；在表7中，p值<0.05的交互因素有BC；各響應(yīng)值的校正R2與實(shí)際R2結(jié)果表見表8。

表3 響應(yīng)面對加標(biāo)樣品中乙基麥芽酚回收率的二次模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface regression model of ethyl maltol recovery rate in samples

表4 響應(yīng)面對加標(biāo)樣品中香葉醇回收率的二次模型方差分析表Table 4 ANOVA for response surface regression model of geraniol recovery rate in samples

表5 響應(yīng)面對加標(biāo)樣品中八角茴香油回收率的二次模型方差分析表Table 5 ANOVA for response surface regression model ofstar anise oil recovery rate in samples

表6 響應(yīng)面對加標(biāo)樣品中丁香酚回收率的二次模型方差分析表Table 6 ANOVA for response surface regression model of eugenol recovery rate in samples

表7 響應(yīng)面對加標(biāo)樣品中香豆素回收率的二次模型方差分析表Table 7 ANOVA for response surface regression model ofcoumarin recovery rate in samples

表8 各響應(yīng)值的校正R2與實(shí)際R2結(jié)果Table 8 The corrected R2 and actual R2 results for each response

由表8可知，各響應(yīng)值的校正R2與實(shí)際R2之間的差值除樣品中香豆素的回收率外，其余均小于0.1；樣品中香豆素的回收率的校正R2與實(shí)際R2的差值為0.1603，<0.2；因而，可以證明響應(yīng)面模擬的模型可信度較高，所預(yù)測的氣-液微萃取技術(shù)(GLME)操作條件的各參數(shù)準(zhǔn)確性更可靠。

3.3 兩兩因素交互響應(yīng)面結(jié)果

為了將響應(yīng)面擬合的模型更直觀地展示，將通過氣-液微萃取技術(shù)(GLME)各操作參數(shù)因素(A提取溫度、B提取時間、C氣體流速和D冷凝溫度)兩兩交互作用影響對加入混標(biāo)的樣品中不同標(biāo)準(zhǔn)品的回收率(響應(yīng)值)之間所擬合的響應(yīng)面見圖5～圖9。

圖5 樣品中乙基麥芽酚的回收率因素AB交互響應(yīng)面和等高線Fig.5 The response surface and contour line of AB interaction on recovery rate of ethyl maltol in the sample

圖6 樣品中香葉醇的回收率因素AB交互響應(yīng)面示意圖Fig.6 The response surface and contour line of AB interactionon recovery rate of geraniol in the sample

圖7 樣品中八角茴香油的回收率因素AD交互響應(yīng)面示意圖

圖8 樣品中丁香酚的回收率因素AD交互響應(yīng)面示意圖

圖9 樣品中香豆素的回收率因素BC交互響應(yīng)面示意圖Fig.9 The response surface and contour line of BC interaction for recovery rate of coumarin in the sample

當(dāng)兩個因素之間交互作用越強(qiáng)，對響應(yīng)值的影響越顯著，所擬合出的響應(yīng)面越彎曲陡峭，等高線越密集，形狀越趨于橢圓化；反之亦然。由表3～表7中的F值和p值也可以相互佐證。

3.4 最優(yōu)化設(shè)計(jì)

根據(jù)響應(yīng)面模擬優(yōu)化出的最佳操作參數(shù)結(jié)果見表8，根據(jù)氣-液微萃取技術(shù)(GLME)實(shí)際操作條件的限制，需要在優(yōu)化結(jié)果的基礎(chǔ)上做出一定的微調(diào)，最終得到的最佳條件和各響應(yīng)值的結(jié)果見表9和表10。

表9 氣-液微萃取技術(shù)(GLME)各操作參數(shù)的優(yōu)化條件和實(shí)際條件Table 9 The optimized condition and actual condition for GLME operating parameters

表10 氣-液微萃取技術(shù)(GLME)在優(yōu)化條件與實(shí)際條件下提取各響應(yīng)值結(jié)果Table 10 The response value results of GLME under optimized condition and actual condition

4 結(jié)論

建立了一種氣-液微萃取技術(shù)(GLME)在食品香精香料中的應(yīng)用，以食品香精香料中常見的易揮發(fā)的特定5種物質(zhì)(乙基麥芽酚、香葉醇、八角茴香油、丁香酚、香豆素)進(jìn)行測定，對影響操作的4個因素(提取溫度、提取時間、冷凝溫度、氣體流速)進(jìn)行單因素和響應(yīng)面分析，利用Box-Behnken的響應(yīng)面設(shè)計(jì)建立四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過Design Expert 11.1.0.1軟件，優(yōu)化并根據(jù)實(shí)際情況得到最佳的氣-液微萃取技術(shù)(GLME)操作條件，提取溫度268 ℃、提取時間7 min、冷凝溫度-2 ℃和氣體流速2.5 mL/min，經(jīng)驗(yàn)證，乙基麥芽酚回收率為78.901%，香葉醇回收率為97.903%，八角茴香油回收率為79.899%，丁香酚回收率為99.904%，香豆素回收率為96.736%，各響應(yīng)值的結(jié)果均體現(xiàn)了較高的得率，為以后食品中常見香精香料成分的研究提供了理論基礎(chǔ)。