黃群惠,黃志蕓,田文靜,李正逗,丁玲,史金涵,馬旺軍,麻玉婷,張繼,3*

1(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,甘肅 蘭州,730070)2(甘肅省特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州,730070)3(西北師范大學(xué) 新農(nóng)村發(fā)展研究院,甘肅 蘭州,730070)

蘭州百合(LiliumdavidiivarunicolorSalisb)為川百合的變種,在藥用的同時(shí),也是蘭州地區(qū)常見(jiàn)的蔬菜之一。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)由百合鱗莖提取出的百合多糖(lily polysaccharicle,LPS)是其具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫等藥用價(jià)值的重要原因,百合多糖清除自由基的能力使其成為一種較有前景的抗氧化劑[1],尤其是多糖作為一種天然產(chǎn)物副作用小、無(wú)毒性而被認(rèn)為是合成抗氧化劑的替代品[2-4]。在食品領(lǐng)域中,多糖被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和制藥工業(yè),其中,百合多糖也是受到廣泛研究的多糖之一。由于許多食品在生產(chǎn)和加工過(guò)程中多以液態(tài)形式存在,多糖在不同條件下獨(dú)特的流變性使其在食品領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用,許多天然多糖被用作膠凝劑、增稠劑和乳化劑[5-7]。

韓曉霞等[8]研究發(fā)現(xiàn)甘肅不同地區(qū)百合中的百合多糖的含量不同,為提高實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)性,本實(shí)驗(yàn)選用蘭州市七里河區(qū)產(chǎn)的本地百合進(jìn)行多糖提取。不同條件微波輔助提取百合多糖的流變特性以及體外抗氧化方面的研究尚未有明確報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)旨在探究不同功率、時(shí)間和溫度的微波輔助熱水浸提法提取百合多糖及其相關(guān)特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘭州百合,蘭州市七里河區(qū)市場(chǎng)。百合鱗片清洗晾干表面水分備用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JRA-6數(shù)顯磁力攪拌水浴鍋,金壇市杰瑞爾電器有限公司；MCR301流變儀,奧地利安東帕有限公司；EU-2600D紫外分光光度計(jì),上海昂拉儀器有限公司；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司；MG08S-2B微波實(shí)驗(yàn)儀,南京匯研微波系統(tǒng)工程有限公司；Nicolet iS10紅外光譜儀,美國(guó)Thermo公司；SCIENTZ-10 N冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 微波輔助法提取百合多糖

準(zhǔn)確稱(chēng)取新鮮百合100 g打漿,按照料液比1∶4(g∶mL)加入蒸餾水,60 ℃熱水浸提2 h,將提取液10 000 r/min離心5 min,收集上清液,在一定時(shí)間、功率、溫度下進(jìn)行微波提取,于65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,無(wú)水乙醇沉淀多糖,離心收集沉淀,Sevag法除蛋白,再醇沉后離心收集沉淀,冷凍干燥后即得到百合多糖[9-11]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

選取時(shí)間、溫度、微波功率為考察因素。設(shè)定溫度為50 ℃,微波功率為400 W,提取時(shí)間為5、15、25 min；設(shè)定溫度為50 ℃,時(shí)間為25 min,微波功率為400、600、800 W；設(shè)定提取時(shí)間為25 min,微波功率為600 W,提取溫度為50、60、70 ℃進(jìn)行微波處理。未經(jīng)微波處理的百合多糖提取液作為空白對(duì)照,每組單因素實(shí)驗(yàn)做3組平行。濃縮后冷凍干燥,共得到8種百合多糖樣品。

1.3.3 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)表征

采用紅外光譜儀對(duì)不同微波條件處理的百合多糖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的百合多糖2 mg,加入200 mg烘干至恒重的KBr,置瑪瑙研缽中研磨均勻,壓片,在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.3.4 流變學(xué)表征

在(25.0±0.1)℃下,使用流變儀的平板PP50系統(tǒng),板間距1 mm,研究流變學(xué)特性(包括流動(dòng)性能與觸變性能測(cè)定)。每次測(cè)定時(shí),將2 mL 20 mg/mL的百合多糖溶液轉(zhuǎn)移到板上,室溫孵育10 min。

1.3.4.1 流動(dòng)性能測(cè)定

采用流變儀的平板PP50系統(tǒng),測(cè)量百合多糖的黏度隨剪切速率的變化趨勢(shì),剪切速率范圍設(shè)置為0.01～100 s-1。

1.3.4.2 觸變性能測(cè)定

采用流變儀的平板PP50系統(tǒng),旋轉(zhuǎn)模式下設(shè)定3段參數(shù),第1段：剪切速率以3.12 s-1為增速?gòu)? s-1升高到100 s-1；第2段：以100 s-1作為剪切速率維持50 s；第3段：以3.12 s-1為減速?gòu)?00 s-1降低到0 s-1[12]。

1.3.5 百合多糖的體外抗氧化能力的測(cè)定

百合多糖用蒸餾水分別配制成7個(gè)濃度梯度0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1和2 mg/mL,其中未經(jīng)微波處理的百合多糖提取液作為陰性對(duì)照。再以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,用蒸餾水分別配制成與百合多糖相同的濃度梯度。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

以無(wú)水乙醇作為溶劑,將DPPH自由基配制成濃度為 0.1 mmol/L DPPH儲(chǔ)備液,且DPPH溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

測(cè)定方法：準(zhǔn)確吸取1 mL不同濃度的百合多糖溶液分別加入到3 mL 0.1 mmol/L的DPPH儲(chǔ)備液中,室溫避光反應(yīng)30 min,每組設(shè)置3個(gè)平行,測(cè)定混合溶液在517 nm處的吸光度A1,超純水做空白組,在相同條件下測(cè)定吸光值A(chǔ)0[13]。DPPH 自由基清除率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.5.2 羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定

測(cè)定方法：準(zhǔn)確吸取不同濃度的百合多糖溶液各1 mL,依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸溶液和1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液,搖勻后于37 ℃水浴30 min,測(cè)定混合溶液在510 nm處的吸光度Ai,用蒸餾水代替水楊酸測(cè)定吸光值A(chǔ)j,以超純水做空白對(duì)照A0[14]?！H清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

1.3.5.3 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant potential,FRAP)測(cè)定

準(zhǔn)確吸取不同濃度的百合多糖溶液各0.4 mL,依次加入0.2 mol/L,pH 6.6磷酸鹽緩沖液1 mL和體積分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀溶液1 mL充分混合,在 50 ℃下水浴30 min,冰浴快速冷卻后加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)10%三氯乙酸溶液充分混勻,10 000 r/min離心5 min,吸取上清液1 mL,再加入1 mL蒸餾水和1 g/L FeCl3溶液0.2 mL,充分搖勻反應(yīng)10 min,每組設(shè)置3個(gè)平行,在700 nm處測(cè)定混合溶液的吸光度,以超純水做空白組,在相同條件下測(cè)定吸光值[15]。

1.4 數(shù)據(jù)與分析

流變學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)流變儀自帶的軟件所得。所有測(cè)試重復(fù)3次取平均值，用 Origin 9.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合多糖紅外光譜分析

圖1中不同微波條件提取的百合多糖紅外光譜峰形和峰位置基本一致,但峰強(qiáng)度有差異。由圖1-a可知,微波提取時(shí)間為5 min時(shí)多糖結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相似,隨著時(shí)間延長(zhǎng),多糖的特征吸收峰越弱,說(shuō)明多糖逐漸水解,大分子鏈斷裂；由圖1-b可知,微波提取功率達(dá)到600和800 W時(shí)，對(duì)百合多糖結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較小影響,可能是由于功率達(dá)到600 W時(shí)百合多糖大分子鏈已經(jīng)解開(kāi),而功率達(dá)到800 W時(shí)對(duì)多糖的結(jié)構(gòu)影響不大；圖1-c可以觀(guān)察到微波提取溫度越高,百合多糖結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組越相似,可能是百合多糖大分子隨著溫度升高,其大分子鏈發(fā)生解開(kāi)與纏結(jié)不平衡引起其結(jié)構(gòu)改變。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.2 百合多糖的流變學(xué)特性分析

2.2.1 流動(dòng)性分析

多糖具有優(yōu)良的流變性能,在增稠劑、膠凝劑和乳化劑等方面有廣泛的應(yīng)用[20],而多糖的流變學(xué)行為受外界因素的影響[4]。圖2考察了剪切速率對(duì)百合多糖黏度的影響。在低剪切速率下可以觀(guān)察到典型的剪切變稀行為,隨著剪切速率的增加,黏度隨之降低,為假塑性流體；百合多糖在高剪切速率下易受到更大的剪切力,黏度幾乎保持不變,表明百合多糖長(zhǎng)鏈的纏結(jié)結(jié)構(gòu)在高剪切速率的影響下發(fā)生重新排列。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

如圖2-a所示,在溫度和微波功率相同的條件下,微波處理時(shí)間越長(zhǎng),百合多糖的零剪切黏度越大,可能是由于隨著微波處理時(shí)間的延長(zhǎng)促進(jìn)了多糖分子鏈的解開(kāi),多糖分子之間的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸被破壞,因此黏度下降速率更快。在圖2-b中,溫度和時(shí)間固定的條件下,功率越大,多糖的零剪切黏度越小;圖2-c中,在功率和時(shí)間相同的條件下,溫度升高,多糖的零剪切黏度減小,即黏度下降速率逐漸減慢,多糖溶液表現(xiàn)出近似于牛頓流體的特性,以上2種情況可能是由于多糖分解成小分子的糖,聚合度降低,因此其零剪切黏度較低。不同微波輔助提取百合多糖的零剪切黏度見(jiàn)表1。

表1 不同微波輔助提取百合多糖的零剪切黏度

利用 Herschel-Bulkley模型對(duì)百合多糖的流動(dòng)曲線(xiàn)進(jìn)行擬合,其方程式如公式(3)所示：

τ=τy+kn

(3)

式中：τ,剪切應(yīng)力,Pa；τy,剪切屈服應(yīng)力,Pa；,剪切速率,s-1；k,稠度系數(shù),Pa/s；n,非牛頓指數(shù),其中n=1 牛頓流體；n<1 剪切稀化；n>1 剪切增稠[21]。

由表2可知，百合多糖的流動(dòng)行為與Herschel-Bulkley模型擬合度較高，R2>0.9953。此特性的多糖可以作為性增稠劑或穩(wěn)定劑。

表2 不同微波輔助提取百合多糖的Herschel-Bulkley模型擬合參數(shù)

2.2.2 觸變性分析

多糖的觸變性是指在非破壞或剪切的條件下,多糖的形變對(duì)剪切應(yīng)力的響應(yīng)[22]。剪切速率隨時(shí)間延長(zhǎng)達(dá)到最大值,剪切速率降低再次回到初始值,形成的曲線(xiàn)呈現(xiàn)上下閉合狀態(tài)(圖3)。根據(jù)公式(4)計(jì)算不同微波條件提取百合多糖的觸變環(huán)面積,結(jié)果見(jiàn)表3。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

表3 不同微波輔助提取百合多糖的觸變環(huán)面積

(4)

式中：γ1和γ2為剪切速率,s-1；k1、k2為正向流動(dòng)指數(shù),Pa/s；n1和n2分別為流動(dòng)冪指數(shù)。

由表3中可知,不同微波輔助條件下提取的百合多糖都具有一定的觸變性。溫度和功率一定時(shí),提取時(shí)間越長(zhǎng),百合多糖的大分子長(zhǎng)鏈逐漸解開(kāi),觸變環(huán)面積越大,因此觸變性也隨之增大；溫度和時(shí)間一定時(shí),多糖的觸變環(huán)面積隨著功率的增大而減小;功率和時(shí)間一定時(shí),提取溫度越高,多糖的觸變環(huán)面積越小,這2種現(xiàn)象可能是由于微波功率過(guò)大,溫度越高,百合多糖大分子的纏結(jié)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。

2.3 百合多糖的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基[23],其最大吸收波長(zhǎng)在517 nm 處。DPPH易與抗氧化劑發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng),從而使自身被清除,吸光值減弱[24]。如圖4所示,當(dāng)百合多糖質(zhì)量濃度<0.6 mg/mL時(shí),多糖清除DPPH自由基的能力隨著濃度升高而上升,在質(zhì)量濃度>1.0 mg/mL時(shí),變化趨于平緩,此現(xiàn)象是由于氫鍵的增加所引起的。圖4-a中隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),多糖清除DPPH自由基的能力逐漸減弱,可能是由于多糖分子隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),結(jié)構(gòu)鏈解開(kāi),空氣中被氧化的部分也增多,影響其整體的抗氧化活性；如圖4-b所示,隨著提取功率增大,清除DPPH自由基能力逐漸增強(qiáng),可能是由于多糖鏈隨著功率增大更快速地釋放出來(lái),為自由基提供電子,因此清除自由基能力增強(qiáng)；如圖4-c所示,隨著溫度升高促進(jìn)了多糖分子運(yùn)動(dòng),分子間的相互作用增強(qiáng),可能是多糖大分子結(jié)構(gòu)鏈先解纏結(jié)再重新纏結(jié),因此其清除DPPH自由基能力越來(lái)越接近陰性對(duì)照組。通過(guò)圖1紅外分析百合多糖的結(jié)構(gòu)得知,在1 636和1 415 cm-1附近的較強(qiáng)吸收峰證實(shí)了糖醛酸的存在,有文獻(xiàn)報(bào)道,多糖的結(jié)構(gòu)中糖醛酸含量越高,其自由基清除能力越強(qiáng)[17,25]。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.3.2 羥基自由基(·OH)清除能力測(cè)定分析

在體內(nèi)自由基中活性最強(qiáng)的是·OH?？寡趸瘎┦峭ㄟ^(guò)把電子或質(zhì)子傳遞給自由基來(lái)清除自由基。由圖5可知,微波輔助提取對(duì)百合多糖清除·OH的影響隨濃度的增大而略微增強(qiáng),正相關(guān)趨勢(shì)沒(méi)有維生素C清除DPPH自由基的能力明顯。如圖5-a所示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),多糖清除·OH的能力逐漸減弱,可能是由于微波提取會(huì)改變多糖構(gòu)象,進(jìn)而影響了對(duì)·OH的清除能力。圖5-b和5-c可知,隨著功率的增大與溫度的升高,百合多糖清除·OH能力逐漸增強(qiáng),可能是由于多糖鏈的卷曲結(jié)構(gòu)得到伸展,通過(guò)觀(guān)察圖1-b和圖1-c中羥基峰,推測(cè)多糖鏈水解后暴露出的羥基提供更多質(zhì)子,終止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

2.3.3 鐵離子還原能力

體外抗氧化實(shí)驗(yàn)通常采用還原鐵氰化鉀的能力來(lái)判斷還原力的大小,由于百合多糖的抗氧化活性與其還原力有直接聯(lián)系,抗氧化劑可將Fe3+還原成Fe2+,百合多糖還原力越強(qiáng)就證明抗氧化性越強(qiáng)。圖6是不同微波輔助提取條件下百合多糖的還原力的變化,可以發(fā)現(xiàn)隨著維生素C或百合多糖濃度的增大,吸光度也會(huì)逐漸增大。通過(guò)圖6-a觀(guān)察,當(dāng)微波處理時(shí)間從5 min延長(zhǎng)到25 min,多糖的還原力先增強(qiáng)后減弱,植物多糖的抗氧化能力可能是多種因素的相互作用或反作用,不僅與糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)相關(guān),還與單糖組成、取代基、糖殘基和鏈構(gòu)象等因素相關(guān)[19],因此百合多糖抗氧化活性還需要進(jìn)一步研究；圖6-b是不同功率的微波處理后百合多糖的還原力,隨著功率的增大多糖還原力逐漸增強(qiáng)；圖6-c顯示隨著溫度的升高百合多糖的還原力逐漸增強(qiáng),但是陰性對(duì)照始終還原能力最弱,這種現(xiàn)象可能是微波輻射改變了多糖分子的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),其結(jié)構(gòu)鏈的解纏結(jié)和重新纏結(jié)之間不平衡,進(jìn)而影響了多糖的還原能力。

a-不同時(shí)間處理；b-不同功率處理；c-不同溫度處理

3 結(jié)論

通過(guò)改變時(shí)間,功率和溫度等微波條件提取百合多糖,紅外光譜初步表征確定了7種不同的條件提取出的百合多糖均有多糖特征吸收峰；流變特性分析出百合多糖具有剪切變稀行為,隨著剪切速率的增加,黏度隨之降低,為假塑性流體,其流動(dòng)曲線(xiàn)符合流變學(xué)Herschel-Bulkley模型,具有這種顯著剪切稀化效應(yīng)的多糖可以作為性能優(yōu)良的增稠劑或穩(wěn)定劑,可應(yīng)用于飲料工業(yè)中。同時(shí)微波提取的百合多糖還具有一定的觸變性,隨著時(shí)間延長(zhǎng)或溫度的升高,百合多糖的觸變環(huán)面積增大,即觸變性增大,隨著微波功率的增大,百合多糖的觸變性環(huán)面積減小,觸變性降低,因此百合多糖具有良好的流變特性,在食品加工中可替代食用膠。

通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)可知,百合多糖與陽(yáng)性對(duì)照維生素C相比抗氧化活性普遍偏低,多糖是一種大分子化合物,在相同濃度下抗氧化活性低于抗氧化劑維生素C屬于正常情況。不同微波條件提取的百合多糖在一定濃度下清除DPPH自由基、·OH以及還原三價(jià)鐵離子的能力均與處理時(shí)間呈負(fù)相關(guān),與功率和溫度呈正相關(guān),經(jīng)過(guò)紅外光譜分析百合多糖的結(jié)構(gòu)可以猜測(cè)多糖的體外抗氧化能力與其糖醛酸含量、單糖組成、糖殘基及大分子鏈構(gòu)象等有關(guān),因此在提取百合多糖時(shí)應(yīng)注意適當(dāng)縮短處理時(shí)間以保護(hù)多糖的結(jié)構(gòu),使其具有較好的抗氧化特性,可作為一種抗氧化、抗衰老的功能食品。