陳曉茹,黃鈞,周榮清*,張宿義,董異,王超,王小軍,吳重德,金垚

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院,四川 成都,610056) 2(四川省瀘州市瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)

作為我國獨(dú)特的酒精飲料,白酒生產(chǎn)過程主要包括大曲生產(chǎn)、發(fā)酵、蒸餾和貯存與勾兌等主要步驟[1]。大曲,被譽(yù)為“酒之骨”,既是后續(xù)發(fā)酵過程的粗酶和微生物菌劑,又是釀酒過程中必不可少的原料之一[2]。優(yōu)質(zhì)大曲為白酒提供重要的呈香物質(zhì)及風(fēng)味前體成分。隨著對(duì)大曲微生物菌群功能的深入了解[3-4],篩選及分離菌株在強(qiáng)化大曲中的應(yīng)用已是目前關(guān)注的熱點(diǎn)之一。如LI等[5]將片球菌、酵母菌等不同種屬的菌株接種到大曲坯中,提高了成曲的微生物群落豐度,改善了發(fā)酵穩(wěn)定性,接種分離株謝瓦散囊菌(Eurotiumchevalieri)強(qiáng)化大曲發(fā)酵改善了其風(fēng)味性能[6],接種短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)則使大曲液化力提高了125%[7]。基于產(chǎn)已酸乙酯能力強(qiáng)的酵母菌株及菌群對(duì)大曲群落及代謝組分影響的研究結(jié)果表明,菌株及菌群的強(qiáng)化對(duì)大曲群落及代謝組分的貢獻(xiàn)差異顯著[8]。上年陳曲接種在曲坯調(diào)控醬、清香型大曲群落及代謝的傳統(tǒng)工藝由來已久,但迄今未見陳曲強(qiáng)化濃香型大曲生產(chǎn)的報(bào)道。

本文以分離株地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)和陳曲強(qiáng)化濃香型大曲為研究對(duì)象,對(duì)其主要理化性質(zhì)、微生物群落及揮發(fā)性組分的影響規(guī)律進(jìn)行研究,旨在為濃香型大曲的定向調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 微生物及培養(yǎng)基

微生物菌株：Bacilluslicheniformis,從瀘州老窖濃香型大曲中分離,經(jīng)形態(tài)生理生化及分子生物學(xué)鑒定為地衣芽孢桿菌,保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10,牛肉膏3,NaCl 5,pH(7.4±0.2)。

1.2 主要藥品與試劑

辛酸甲酯,北京百靈威化學(xué)試劑有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純,本地化學(xué)商品試劑供應(yīng)商提供。

1.3 主要儀器和設(shè)備

TSQ9000 ΙΙ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國賽默飛世爾公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

強(qiáng)化大曲生產(chǎn)：B.licheniformis菌懸液和陳曲粉分別以7.2×106CFU/g(以菌體濕重記)和1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù))接種到大曲坯中,在瀘州老窖股份有限公司制曲中心發(fā)酵。功能菌株強(qiáng)化的大曲樣品縮寫為C,相應(yīng)地在同曲房的對(duì)照樣為B-1；陳曲強(qiáng)化的大曲樣品為S,同曲房同批次的對(duì)照樣為B-2。貯存6個(gè)月,按參考文獻(xiàn)[9]所述方法取樣,送至本實(shí)驗(yàn)室保藏于-20 ℃冰箱待分析檢測。

1.5 分析檢測方法

1.5.1 感官檢測

大曲感官評(píng)價(jià)參照文獻(xiàn)[10],在自然光下對(duì)曲塊的外觀、斷面和香味由10名專業(yè)人士組成的品評(píng)小組進(jìn)行綜合評(píng)定。

1.5.2 理化參數(shù)分析

大曲理化指標(biāo)的測定：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[11]檢測,每組樣品取3組平行樣。

1.5.3 揮發(fā)性組分測定

樣品的前處理：參考DING等[12]所述方法稍作修改。稱取樣品1.00 g于25 mL頂空瓶中,加入10 μL的辛酸甲酯(0.0 079 g/100 mL)作為內(nèi)標(biāo)。置于恒溫?cái)嚢杵髦?00 r/min、(60±1)℃預(yù)熱平衡15 min,吸附提取50 min。結(jié)束后,將SPME纖維插入GC進(jìn)樣口解吸5 min,檢測揮發(fā)性組分。

GC-MS檢測操作條件：40 ℃保持5 min,以4 ℃/min升至100 ℃不保持,再以6 ℃/min升至230 ℃保持10 min,進(jìn)樣口溫度為270 ℃。離子源溫度為300 ℃,質(zhì)譜掃描范圍為m/z35～400。

檢測質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST2017)對(duì)照進(jìn)行組分鑒定,對(duì)匹配度大于800的物質(zhì)予以分析。采用峰面積歸一化法確定揮發(fā)性組分的相對(duì)含量。

1.5.4 大曲微生物群落組成檢測

按照Fast DNA SPIN提取試劑盒提得基因組DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳測其純度,取3 μL經(jīng)NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)測定A260/A280值,檢驗(yàn)是否有RNA和蛋白質(zhì)污染。用338F和806R對(duì)細(xì)菌的16S rRNA基因高變區(qū)V3～V4區(qū)域和真菌的ITS5和ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的操作條件：25 μL,5×reaction buffer和5×GC buffer 各5 μL,0.25 μL DNA聚合酶(5 U/μL,Q5 High-Fidelity),2 μL dNTPs(2.5 mmol/L),正反引物各1 μL(10 μmol/L),2 μL DNA模板,8.75 μL ddH2O。細(xì)菌擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃預(yù)熱2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,一共25個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持5 min。真菌擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)熱3 min,95 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,共32個(gè)循環(huán),最后72 ℃保持10 min。PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠進(jìn)行目的片段純化回收。送派森諾生物科技有限公司在2×300 Illumina Miseq平臺(tái)上測序。

原始序列使用QIIME pipeline進(jìn)行處理,依據(jù)CAPORASO等[13]描述的方法去除一些低質(zhì)量序列。最后使用UCLUST把高質(zhì)量的序列聚成不同的操作性分類單元(operational taxonomic units,OTU)[14]。多樣性是指某個(gè)群落或生境內(nèi)部的物種多樣性,Chao1和Observed species指數(shù)用于反映菌群豐度,Shannon和Simpson指數(shù)用于表征菌群多樣性。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理

顯著性分析：使用IBM SPSS Statistics 19軟件對(duì)理化和風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,方法采用單因素ANOVA分析的Duncan檢驗(yàn)法(P<0.05,n=3)。冗余分析(redundancy analysis,RDA)：使用Canoco 5.0軟件尋找出微生物群落與特征風(fēng)味組分之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物組成的差異

Illumina MiSeq測序結(jié)果中高質(zhì)量有效序列的覆蓋度均大于99%,說明測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。樣品間細(xì)菌和真菌的微生物多樣性指數(shù)的差異如表1所示。2種不同強(qiáng)化方式均改變了群落的多樣性。純培強(qiáng)化提高了細(xì)菌和真菌的豐富度,細(xì)菌的多樣性無顯著變化,而真菌的多樣性增高。陳曲強(qiáng)化提高了大曲細(xì)菌的豐富度和多樣性,但降低了真菌的豐富度和多樣性。強(qiáng)化擾動(dòng)對(duì)細(xì)菌群落的豐富度影響更顯著,且陳曲強(qiáng)化則對(duì)細(xì)菌和真菌都有顯著的影響。

表1 四種大曲微生物群落α-多樣性指數(shù)

測序的OTU的細(xì)菌和真菌分別歸類到106和52個(gè)不同屬,其中豐富度>0.5%的群落組成輪廓如圖1所示。對(duì)照大曲(B-1和B-2)聚類在同簇(圖1-a),魏氏斯菌屬(Weissella)分別是31.34%和75.20%。樣品B-1的糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)、嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces)分別是23.26%、13.17%。此外,曾報(bào)道的是優(yōu)勢細(xì)菌的乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和芽胞桿菌屬(Bacillus)在2個(gè)樣品中比例類似。C曲中Bacillus的豐度是88.28%,而在S曲中Kroppenstedtia、海洋桿菌屬(Oceanobacillus)的豐度分別是48.02%和14.76%,曾報(bào)道是特香型大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌[15],且前者在白酒釀造中的作用報(bào)道甚少[16]。在古井中溫大曲中豐度高達(dá)84%的枝芽胞桿菌屬(Virgibacillus)[17],在S曲中僅為8.91%。如圖1-b所示,散囊菌目(Eurotiales)是對(duì)照曲的優(yōu)勢真菌,嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)和毛霉屬(Rhizomucor)在B-1中的豐度分別是36.60%和31.68%,而曲霉屬(Aspergillus)和畢赤酵母屬(Pichia)分別是18.96%和8.62%。在B-2中Aspergillus的相對(duì)豐度是78.01%,Thermoascus和Pichia次之。在C曲中曲霉科(Aspergillaceae)的相對(duì)豐度是75.73%,而在S曲中Pichia為優(yōu)勢真菌,豐度為82.06%,該菌是賦予獨(dú)特風(fēng)味特征的主要貢獻(xiàn)者[18],且Hyphopichia(3.34%)與乙酸乙酯呈正相關(guān)[19]。

a-細(xì)菌；b-真菌C-功能菌株強(qiáng)化的大曲樣品;B-1-相應(yīng)在同曲房的對(duì)照樣；S-陳曲強(qiáng)化的大曲樣品,B-2-相應(yīng)同批次的對(duì)照樣

2.2 強(qiáng)化方式對(duì)大曲感官和理化性質(zhì)的影響

依據(jù)大曲相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)該實(shí)驗(yàn)中的4種大曲從外觀、斷面和香味3個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。傳統(tǒng)大曲B-1和B-2類似,菌絲生長較好,只有單純的曲香味。C曲樣有一些雜菌菌斑,酸味重,且有刺鼻的焦香味,這可能與樣品中吡嗪類含量高有關(guān)。而S曲樣的色澤均衡,同時(shí)香味濃郁無刺鼻味。

如表3所示,C曲的淀粉酶、糖化酶和酯化酶的活力較對(duì)照的低,而S曲與相應(yīng)的對(duì)照無顯著的差異,這與S曲樣中有更高豐度的高溫放線菌科(Thermoactinomycetaceae)有關(guān),有研究報(bào)道[20]該菌能產(chǎn)高溫淀粉酶能促進(jìn)原料的糖化和液化。S曲的酯化力顯著高于相應(yīng)的對(duì)照,可能與其酯含量及后續(xù)白酒中酯類組分含量正相關(guān)的作用[21]。C曲的酸度高于相應(yīng)的對(duì)照曲,但S曲則相反,可能與接種的Bacillus降解蛋白質(zhì)等組分能力較強(qiáng),并且有益產(chǎn)酸細(xì)菌如Lactobacillus、Weissella和明串珠菌屬(Leuconostoc)等的繁殖有關(guān)[22]。相比對(duì)照,強(qiáng)化發(fā)酵大曲的發(fā)酵力降低,可能與其真菌豐度增高,淀粉等底物水解率減少,且淀粉降解與降解物代謝能力等多邊發(fā)酵失衡有關(guān)[23]。大曲中的發(fā)酵力、糖化力和液化力間的平衡關(guān)系是維系大曲的釀造學(xué)特性的重要參數(shù),較這些參數(shù)的高低更能揭示其大曲對(duì)白酒產(chǎn)率和品質(zhì)的貢獻(xiàn)[24]。

表2 不同大曲感官特征比較

表3 不同方式強(qiáng)化大曲和傳統(tǒng)大曲理化性質(zhì)表

2.3 揮發(fā)性組成的異同

從這些樣品中檢出的揮發(fā)成分?jǐn)?shù)量與含量因大曲類型不同而異。檢出揮發(fā)成分在50～90種,C曲的總量為(920 152.11±2 029.47)μg/kg,S曲則為(11 719.55±159.47)μg/kg,相應(yīng)的對(duì)照樣品分別是(3 586.40±851.16)μg/kg和(5 185.45±907.95)μg/kg。這些成分根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)特征分為8類不同組,包括酯、醇、酸、醛、吡嗪、酮、酚和其他類。

接入Bacillus使C曲的醇和吡嗪類顯著提高,含量高達(dá)14 349.60 μg/kg,占總揮發(fā)性的71.21%。吡嗪類中主要由四甲基吡嗪、三甲基吡嗪和2,3-二甲基吡嗪等組分,分別較對(duì)照樣品增加了5 422.57%、1 042.85%和684.43%,醇類也提高了5.41倍,主要是2,3-丁二醇含量增高所致。該成分具有濃郁的果香[25],賦予白酒入口香甜、綿長的特色[26]。酯類成分則降至(3 692.24±624.63)μg/kg。

C-功能菌株強(qiáng)化的大曲樣品;B-1-相應(yīng)在同曲房的對(duì)照樣；S-陳曲強(qiáng)化的大曲樣品;B-2-相應(yīng)同批次的對(duì)照樣

接入陳曲強(qiáng)化的S曲樣則使酯類成分含量增至(5 111.21±309.76)μg/kg,己酸乙酯增高106.50%。類似C曲,吡嗪類的含量也增高了,四甲基吡嗪高達(dá)(2 143.44±321.92)μg/kg,是主要的共獻(xiàn)者,該成分可賦予白酒堅(jiān)果、焦香味等芳香特色[25]。同時(shí),僅在S曲中檢出石竹烯和杜香醇,賦予其辛香、樟腦香、木香[27]及桃香味[28]等獨(dú)特風(fēng)味。

2.4 揮發(fā)性與微生物的相關(guān)性

RDA解析群落中優(yōu)勢種屬與特征風(fēng)味組分相關(guān)性的結(jié)果如圖3所示。C曲中吡嗪類、醇類及芳香族組分與Bacillus呈顯著的正相關(guān),尤其是四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、1,3-二甲基苯和1,2,4-三甲基苯是分離株強(qiáng)化的優(yōu)勢揮發(fā)性成分。類似曾報(bào)道的結(jié)果[29],分離株強(qiáng)化,增高了其豐度,相應(yīng)的優(yōu)勢成分的含量顯著提高。相反地,陳曲強(qiáng)化濃香型大曲的酯、醇、酸等優(yōu)勢組分含量均衡增高,吡嗪的含量也增加。這些組分與根霉屬(Rhizopus)[30]、Pichia[15]等豐度呈正相關(guān),如異戊酸和己酸乙酯,這與2個(gè)種屬的相應(yīng)的酸的分泌能力和產(chǎn)酯能力較強(qiáng)有關(guān)。S曲豐度較高的kroppenstedtia、Oceanobacillus具備產(chǎn)石竹烯和杜香醇等能力,所以與其豐度呈正相關(guān)。石竹烯和杜香醇雖在白酒釀造中被檢出,但對(duì)白酒風(fēng)味的特征貢獻(xiàn)待深入研究[16]。此外,對(duì)照曲中的Aspergillus的豐度較高,且與3-辛酮、1-辛烯-3-醇和棕櫚酸乙酯呈正相關(guān)。

圖3 基于微生物群落與風(fēng)味代謝物的冗余分析

3 結(jié)論

分離功能菌株和優(yōu)質(zhì)陳曲強(qiáng)化大曲發(fā)酵,對(duì)大曲理化性質(zhì)、微生物群落多樣性及揮發(fā)性組分的影響差異顯著。分離功能菌株強(qiáng)化提高了細(xì)菌和真菌的豐度,但使細(xì)菌多樣性降低,真菌多樣性增高,理化參數(shù)降低,顯著提高了功能菌的目標(biāo)產(chǎn)物的含量。優(yōu)質(zhì)陳曲強(qiáng)化大曲發(fā)酵,提高細(xì)菌的豐富度和多樣性,但降低了真菌的豐富度和多樣性,但理化性質(zhì)幾乎相同,主要揮發(fā)成分的組成亦類似,但含量顯著提高,且新檢出了石竹烯和杜香醇等獨(dú)特芳香成分。由此可見功能菌強(qiáng)化主要提高了目標(biāo)代謝組分的含量,改變大曲群落及理化性質(zhì),而陳曲強(qiáng)化發(fā)酵的大曲理化等各種參數(shù)與傳統(tǒng)大曲相似性更高,為白酒釀造提供了更多的可能性。