史文閣,李一璇,NAZAROVA Sophia A.,趙 磊,郭 健,范士亮,徐勤增*

(1.自然資源部 第一海洋研究所,

自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學與技術(shù)重點實驗室,山東 青島266061；2.青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學功能實驗室,山東 青島266237；3.俄羅斯科學院動物研究所 海洋研究室,圣彼得堡199034；4.貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院,貴州 貴陽550025)

薩氏真蛇尾(Ophiura sarsii)屬于蛇尾綱(Ophiuroidea)真蛇尾目(Ophiurina)真蛇尾科(Ophiuridae)真蛇尾屬(Ophiura),主要分布于北太平洋、北極各邊緣海和北大西洋海域[1],其最南端分布海域為日本海(36°N)。有關(guān)薩氏真蛇尾的研究通常隨大型底棲生物調(diào)查而展開。Toshihiko等[2]對日本海薩氏真蛇尾體長頻率、空間分布進行了調(diào)查,發(fā)現(xiàn)大個體數(shù)量隨著水深的增加而增加。Anisimova[3]對巴倫支海南部的薩氏真蛇尾群體結(jié)構(gòu)進行了分析。Steffens等[4]發(fā)現(xiàn)拉普捷夫海薩氏真蛇尾主要分布在水深30 m以內(nèi)的海域。Ravelo[5]對楚科奇海東北部薩氏真蛇尾的年齡組成、空間分布和次級生產(chǎn)力等種群特征進行了詳細描述。Li等[6]基于線粒體COI和核基因標記ITS2片段分析了薩氏真蛇尾及其亞種淺水薩氏真蛇尾(Ophiurasarsii vadicola)的遺傳特征。目前,對北極薩氏真蛇尾群體的遺傳特征認識較少,有待深入開展研究。

線粒體控制區(qū)(Control Region,CR)具有相對其他分子標記突變較快的特點,是脊椎動物群體遺傳研究中常用的分子標記,但在其他動物中開展的研究較少。Omr等[7]發(fā)現(xiàn)棘皮動物控制區(qū)序列有突變速率快且受環(huán)境選擇小的特點,是研究棘皮動物物種內(nèi)部遺傳特征的理想分子標記。申欣等[8]研究發(fā)現(xiàn),相對于其他基因,以蛇尾為代表的棘皮動物線粒體NADH脫氫酶亞基(nad)基因具有較多的變異位點,因而nad系列基因適合作為棘皮動物系統(tǒng)發(fā)育分析的分子標記。

北極太平洋扇區(qū)白令海-楚科奇海域地質(zhì)構(gòu)造復(fù)雜,處于亞洲、北美洲和太平洋與北冰洋的交匯處,歷史上白令海峽出現(xiàn)了多次開啟與關(guān)閉的地質(zhì)變化事件[9]。此外,該區(qū)域的洋流分布復(fù)雜,主要有阿拉斯加海岸流、西伯利亞海岸流和白令海峽洋流等,使得該海域擁有比較特殊的物種遷移與基因交流現(xiàn)象[10]。本研究基于不同方式獲得了白令海、楚科奇海和巴倫支海三個海域薩氏真蛇尾樣品,選取線粒體控制區(qū),nad2和nad6三種分子標記,研究3個區(qū)域大型底棲生物優(yōu)勢種——薩氏真蛇尾的群體遺傳與連通性,并檢測在北極太平洋及大西洋扇區(qū)是否存在基因交流以及相關(guān)程度,討論不同分子標記在該種類群體進化研究中的適用性,同時揭示北極海域3個地理群體間薩氏真蛇尾的群體遺傳特征,為其遷移提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

薩氏真蛇尾來自第十次北極考察獲得的40個白令海(BL)、白令海峽至楚科奇海(R)站位海域樣本(圖1),以及俄羅斯科學院動物研究所提供的19個巴倫支海(BAS)樣本。通過阿氏網(wǎng)將白令海、楚科奇海蛇尾樣品在所處海域分兩站進行采集(BL09、BL12、R01和R04),采集到的一部分樣本使用乙醇固定,于-20℃保存；另一部分樣品用低溫海水清洗,使用液氮超低溫暫存,返回到實驗室后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80℃),長期保存。

圖1 第10次北極考察薩氏真蛇尾采樣白令海、楚科奇海與巴倫支海采樣站位Fig.1 Sampling sites of Ophiura sarsii from Bering Sea Chukchi Sea and Barents Sea

1.2 DNA提取、擴增與測序

取長約1 cm的薩氏真蛇尾腕部組織,使用兩種試劑盒:QIAamp Fast DNA Tissue試劑盒(QIAGEN公司,德國)和OMEGA Tissue DNA試劑盒(OMEGA公司,美國)用于基因組DNA提取。薩氏真蛇尾腕部組織經(jīng)液氮研磨后進行消化,其余提取步驟參照說明書。將提取后的總基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA完整性,檢測合格的DNA置于-20℃保存。將59個個體進行線粒體控制區(qū)、nad2和nad6序列擴增。

根據(jù)GenBank中薩氏真蛇尾線粒體基因組全序列(GenBank編號:MH780492),采用Oligo 7.0軟件設(shè)計用于擴增線粒體控制區(qū)、nad2和nad6區(qū)域的引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共50μL,包含雙蒸水30μL、10×PCR buffer(without Mg2+,Takara)5μL、MgCl2(25 mm,Takara)4μL、d NTP Mix(2.5 mm,Takara)4μL、每種引物(濃度10μM)2μL、牛血清蛋白溶液(BSA)0.75 μL、rTaq酶(Takara)0.25μL和模板DNA 2μL。CR的擴增程序為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán)；72℃延伸10 min,7℃保存。nad2的擴增程序為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán)；72℃延伸10 min,7℃保存。nad6的擴增程序為95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環(huán)；72℃延伸10 min,7℃保存。

表1 擴增線粒體控制區(qū),nad2和nad6分子標記的PCR引物序列Table 1 The PCR primers for amplication of CR,nad 2 and nad 6 sequences

將PCR擴增產(chǎn)物置于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測,結(jié)果顯示線粒體控制區(qū)、nad2和nad6檢測合格的條帶數(shù)分別為59、21和31條,檢測合格條帶清晰的PCR產(chǎn)物送至青島生工生物工程技術(shù)有限公司切膠純化,并利用自動測序儀進行雙向測序,測序引物即PCR擴增引物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Dnastar Lasergene v7.1軟件[11]對測序結(jié)果進行拼接。利用DnaSP 6.12.03軟件[12]分別計算線粒體控制區(qū)、nad2和nad6基因的分離位點數(shù)目(Number of Segregating,S)、單倍型數(shù)量(Number of Haplotype,H)、核酸差異數(shù)(Nucleotide Differences,K)、核苷酸多樣性(Nucleotide Diversity,PI)、單倍型多樣性(Haplotype Diversity,HD)以及群體間的基因交流值。將上述分析獲得的3個分子標記的單倍型序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,使用近緣種Ophiura lutkeni(GenBank編號:AY184223.1)的線粒體控制區(qū)、nad2和nad6序列作為外群,通過PhyloSuite v1.2.1軟件[13]中的MAFFT模塊[14]進行序列比對,G-blocks軟件[15]獲得對齊的線粒體控制區(qū)、nad2和nad6數(shù)據(jù)集。使用IQTREE軟件[16]進行最大似然法(Maximum-Likelihood,ML)系統(tǒng)發(fā)育分析,設(shè)置20 000次快速自展分析(ultrafast booststrap)。Figtree軟件(http:∥tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)進行進化樹美化。通過中介鄰接法(Median-Joining)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。Popart 4.8.4軟件[17]進行單倍型的譜系結(jié)構(gòu)分析,由于BL海域樣品較多,將BL09與BL12在單倍型網(wǎng)絡(luò)圖上做了區(qū)分。

使用Arlequin ver 3.5.2.2軟件[18]計算群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)和分子方差分析(Analysis of Molecular Variances,AMOVA),檢驗單倍型在群體間分布頻率差異,AMOVA分群將BL09與BL12定為一組,R與BAS海域各定為一組。利用Tajima'sD和Fu'sFs中性檢驗推測薩氏真蛇尾的群體歷史動態(tài)。以上分析均通過20 000次重復(fù)抽樣檢驗其顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 序列特征及遺傳多樣性

線粒體控制區(qū)序列長度為322 bp,A、T、G和C含量分別為35.4%、30.4%、14.3%和19.9%,A+T含量(65.84%)高于G+C含量(34.16%),其中A含量最高,堿基組成沒有明顯的偏向性。在59條序列中共檢測到15個單倍型,分離位點數(shù)差異為0～8。3個地理群體間線粒體控制區(qū)單倍型多樣性相差較大,其中巴倫支海海域單倍型多樣性最高(0.731±0.066),白令海峽向北至楚科奇海域單倍型多樣性最低(0.000±0.000)；巴倫支海核苷酸多樣性最高(0.005 58±0.000 063),白令海峽向北至楚科奇海域海域核苷酸多樣性最低。

nad2序列長度為598 bp,A、T、G和C含量分別為30.9%、34.4%、17.1%和17.6%,G+C含量為34.62%,其中T含量最高,堿基偏向性不明顯。在3個地理群體32條序列中,共檢測到27個單倍型,且各群體單倍型均具有較高多樣性,巴倫支海薩氏真蛇尾單倍型最高(1.000±0.250),白令海薩氏真蛇尾核苷酸多樣性(0.009 33±0.006 80)與平均核酸差異數(shù)(5.457)最高。

nad6序列長度為449 bp,A、T、G和C含量分別為45.7%、18.5%、12.0%和23.8%,G+C含量為35.86%,其中A含量最高。在3個地理群體31個序列中,共檢測到24個單倍型。3個地理群體的單倍型多樣性均較高,接近1；核苷酸多樣性相近,其中白令海域最低(0.009 02±0.005 59),巴倫支海最高(0.026 85±0.00028)(表2)。

表2 薩氏真蛇尾線粒體控制區(qū)、nad 2、nad 6標記的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity parameters of Ophiura sarsii based on CR,nad 2 and nad 6 markers

在所用的3個分子標記中,線粒體控制區(qū)的擴增效果最好,但nad2與nad6分離位點數(shù)、單倍型數(shù)量與核苷酸多樣性均高于控制區(qū),且揭示的單倍型多樣性也明顯高于控制區(qū)片段。

2.2 系統(tǒng)發(fā)生

基于最大似然法構(gòu)建的線粒體控制區(qū)單倍型系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2a),形成顯著分化的2個支系:巴侖支海群體樣本明顯聚在一起,另外3個群體交叉分布于系統(tǒng)發(fā)生樹中。線粒體控制區(qū)結(jié)果顯示,北極巴倫支海海域與白令海、楚科奇海之間的薩氏真蛇尾存在顯著的遺傳分化,而白令海與楚科奇海之間遺傳分化不明顯。線粒體控制區(qū)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖3a)顯示,3個海域薩氏真蛇尾群體間的分群結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果基本一致,巴倫支海海域聚為L2譜系,另外2個海域相互交叉形成L1譜系。

基于nad2和nad6構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2b和圖2c)與控制區(qū)樹結(jié)構(gòu)一致,巴倫支海海域聚為一支,剩余群體交叉分布。nad2和nad6單倍型圖(圖3b和圖3c)展示的群體結(jié)構(gòu)與相應(yīng)系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)構(gòu)相近,也分為L1和L2兩個譜系。

圖2 基于控制區(qū)、nad 2和nad 6序列構(gòu)建的ML樹Fig.2 ML phylogenetic tree based on CR,nad 2 and nad 6 sequences

圖3 基于控制區(qū)、nad 2和nad 6序列構(gòu)建的薩氏真蛇尾群體單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Haplotype network of Ophiura sarsii populations based on CR,nad 2 and nad 6 sequences

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

使用分化固定指數(shù)(Fst)評估3個群體間分化程度(表3),巴倫支海海域與另外2個海域間Fst指數(shù)較大(0.744 87～0.944 38),而白令海與楚科奇海海域間Fst指數(shù)均較低,且呈現(xiàn)負值(-0.070 53～-0.009 09),P值均不顯著(P為0.324 32～0.747 75,P＞0.05)。由此說明,巴倫支海薩氏真蛇尾與白令海和楚科奇海薩氏真蛇尾存在較為顯著的分化。白令海和楚科奇海之間Fst指數(shù)為負值,表明這2個海域間薩氏真蛇尾可能有較強的遺傳同質(zhì)性。AMOVA結(jié)果顯示3個海域控制區(qū)變異主要來源于群體間(表3),且P值呈極顯著的結(jié)果(P＜0.01)。

表3 基于線粒體控制區(qū)、nad 2和nad 6序列的薩氏真蛇尾群體間遺傳分化系數(shù)F st及相應(yīng)P值Table 3 F st and P-value from haplotype frequencies of Ophiura sarsii based on CR,nad 2 and nad 6 sequences

2.4 群體歷史動態(tài)

3個標記的中性檢驗結(jié)果(表4)表明白令海海域的Tajima'sD與Fu'sFs值呈現(xiàn)負值,但統(tǒng)計檢驗不顯著,巴倫支海與楚科奇海海域中性檢驗呈現(xiàn)正值或等于0,結(jié)合錯配分布呈現(xiàn)多峰分布的結(jié)果,說明3個海域之間可能不存在群體擴張事件。

表4 基于線粒體控制區(qū)、nad 2和nad 6序列的薩氏真蛇尾群體AMOVA分析結(jié)果Table 4 AMOVA analysis of Ophiura sarsii based on CR,nad 2 and nad 6 sequences

表5 基于線粒體控制區(qū)、nad 2和nad 6序列的薩氏真蛇尾群體中性檢驗值Table 5 Neutral test value of Opsiura sarsii based on CR,nad 2 and nad 6 sequences

3 討 論

遺傳多樣性的高低決定物種對環(huán)境變化的響應(yīng)能力,因此它是物種生存進化的前提,是研究區(qū)域物種遺傳多樣性的基礎(chǔ)。單倍型多樣性和核苷酸多樣性是遺傳多樣性的重要指標[19],本研究使用線粒體控制區(qū)、nad2和nad6三個標記分析了巴倫支海、楚科奇海與白令海三個海域薩氏真蛇尾群體遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳譜系分化特征。薩氏真蛇尾是北極大型底棲生物優(yōu)勢種[1],生物量高,本研究中3個海域的單倍型多樣性與核苷酸多樣性都較高,表明該種類在北極海域有較高的遺傳多樣性。

海洋環(huán)流和環(huán)境適應(yīng)性等因素會影響海洋生物分布及群體遺傳結(jié)構(gòu)[20]。底棲生物尤其是其幼蟲在冷水環(huán)境中能夠比最適環(huán)境條件下遷移更長距離[21],北極的冷水環(huán)境更適合薩氏真蛇尾幼體遷移,并且北極底棲生物分布有高度的可變性[22]。北極地區(qū)特別是白令海峽附近有復(fù)雜的洋流環(huán)境[23],可促進薩氏真蛇尾的基因交流,這也與Ershova等[24]關(guān)于白令海與楚科奇海薩氏真蛇尾生物群體呈分散狀分布的研究結(jié)果一致。此外,食物也是影響生物分布和遷移的重要因素。薩氏真蛇尾在楚科奇海呈現(xiàn)沿岸分布、部分分散的特點可能與該地區(qū)浮游植物分布格局有關(guān)[24],這可能是白令海與楚科奇海薩氏真蛇尾分化程度不明顯,形成同一個譜系的原因之一。目前,化石證據(jù)表明薩氏真蛇尾在北太平洋出現(xiàn)的時間要早于大西洋海域。北太平洋薩氏真蛇尾的化石記錄從晚中新世持續(xù)至晚更新世[25],而大西洋薩氏真蛇尾最早只記錄至更新世[26]。因此,我們推測巴倫支海的薩氏真蛇尾是由太平洋遷移而來。

Fst能夠衡量種群間遺傳分化的尺度[27],本研究表明3個海域中巴倫支海的薩氏真蛇尾與白令海和楚科奇海海域種群相比獲得的Fst值較高,表明該海域與其他海域的薩氏真蛇尾存在較明顯分化。AMOVA分析表明白令海楚、科奇海與巴倫支海海域薩氏真蛇尾變異主要來源于群體間,變異的主要來源可能是巴倫支海與另外兩個海域地理距離導(dǎo)致的遺傳差異。本研究也對3個海域的薩氏真蛇尾進行了Exact檢驗和基因流分析。Exact檢驗結(jié)果顯示三海域中單倍型在群體間分布頻率差異不顯著(P＞0.05),結(jié)合遺傳分化系數(shù)與AMOVA分析結(jié)果,說明薩氏真蛇尾在各群體內(nèi)部隨機交配。

4 結(jié) 論

本研究選取薩氏真蛇尾線粒體控制區(qū)、nad2和nad6三個標記描述北極白令海、楚科奇海、巴倫支海三個海域薩氏真蛇尾群體遺傳特征,結(jié)果表明:

①3個海域薩氏真蛇尾nad2與nad6區(qū)域分離位點多于線粒體控制區(qū),同時這2個區(qū)域揭示的單倍型多樣性也明顯高于控制區(qū)片段。

②北極地區(qū)薩氏真蛇尾的遺傳多樣性較高,群體數(shù)量較大,但本研究中的3個海域薩氏真蛇尾在各群體內(nèi)部隨機交配。

③3個海域薩氏真蛇尾分為兩個譜系,巴倫支海成為一個單獨譜系,白令海與楚科奇海成為另一個譜系。巴倫支海與其他海域的薩氏真蛇尾存在明顯的分化,而白令海與楚科奇海海域薩氏真蛇尾遺傳分化不明顯。白令海與楚科奇海薩氏真蛇尾分化程度不明顯的原因可能與兩海域浮游植物的分布有關(guān)。

本文分析了北極3個薩氏真蛇尾群體的遺傳差異,揭示了北極地區(qū)薩氏真蛇尾的群體遺傳結(jié)構(gòu),為薩氏真蛇尾在太平洋與大西洋之間的遷移提供了科學依據(jù)。