張科，王杰

1 南京醫(yī)科大學(xué)，南京市，210029

2 江蘇省人民醫(yī)院 介入科，南京市，210029

0 引言

不可逆電穿孔（irreversible electroporation,IRE）是利用高壓脈沖電場使細(xì)胞膜出現(xiàn)不可逆性的穿孔造成細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)失衡的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。2011年，美國Angio Dynamics公司利用這一原理研發(fā)出了商業(yè)化的IRE系統(tǒng)NanoKnife?（納米刀）用于腫瘤消融。IRE消融不同于射頻和微波利用連續(xù)的高頻電流產(chǎn)生的熱量消融，而是利用上千伏的微秒級間斷高壓脈沖電場消融，不會導(dǎo)致大量的熱量積累，被稱為非熱消融。常被應(yīng)用于胰腺癌、前列腺癌、腦腫瘤等熱消融禁區(qū)，展示出不可替代的優(yōu)勢和良好的療效[2]。

目前國內(nèi)重慶、上海、天津等地相繼研發(fā)出相對成熟的IRE設(shè)備和控制系統(tǒng)[3-5]，但出于知識產(chǎn)權(quán)的保護暫不對外提供相關(guān)硬件和技術(shù)支持，而美國IRE設(shè)備價格又過于高昂。面向臨床設(shè)計的IRE系統(tǒng)功率大、體積大、不便攜且參數(shù)專為人體特定腫瘤設(shè)計，往往不適合應(yīng)用于實驗室和小動物等臨床前實驗。為此常需要自主研發(fā)實驗用機[6-7]，無疑增加了研發(fā)難度、研發(fā)成本和周期。為了滿足現(xiàn)階段擬開展IRE基礎(chǔ)研究工作人員的需求[8-9]，提出了一種過渡性的、可快速實現(xiàn)、簡易有效、低成本便攜式小型IRE測試和控制系統(tǒng)方案。該方案硬件系統(tǒng)包括一臺市售的成品小型脈沖高壓發(fā)生器、一塊Arduino開發(fā)板和一個外圍脈搏及溫度傳感器模塊。軟件平臺通過對Arduino編程實現(xiàn)心電觸發(fā)和溫度反饋功能，控制高壓脈沖按照IRE算法進行發(fā)放。進行了人肺癌細(xì)胞學(xué)體外測試，驗證了非熱IRE的發(fā)生，達(dá)到了實驗要求。

1 高壓脈沖發(fā)生器選型

實驗所用成品高壓脈沖發(fā)生器定制購自于大江方波科技公司，型號：IGBT-897G，價格只需400元左右。具體參數(shù)：功率800 W，輸入電壓：12 V DC，脈沖輸出電壓：600～1 200 V可調(diào)，最大輸出電流65 A，脈寬20 μs～2 ms可調(diào)，釋放頻率50～300 Hz可調(diào)。脈沖釋放方式：輕觸開關(guān)手動觸發(fā)。該機型前級采用高頻PWM驅(qū)動芯片將輸入的直流電逆變?yōu)榻涣麟?，?jīng)變壓器升壓后再整流濾波電容儲能，后級采用IGBT驅(qū)動芯片驅(qū)動IGBT管釋放高壓方波脈沖。具有過流保護、短路保護、過熱保護、穩(wěn)壓輸出等功能。這種結(jié)構(gòu)的高壓脈沖發(fā)生與商業(yè)化IRE設(shè)備結(jié)構(gòu)和原理類似，方波輸出效率高、機器質(zhì)量輕、功率和電流儲備充足。接實驗負(fù)載，示波器波形驗證，電壓輸出穩(wěn)定在設(shè)定值，方波波形規(guī)則，如圖1所示。頻率和脈寬參數(shù)均符合出廠預(yù)設(shè)值。

圖1 高壓方波脈沖波形Fig.1 High voltage square wave pulse waveform

2 脈沖釋放的控制

由于定制的高壓脈沖發(fā)生器和市售大部分該類小功率高壓脈沖發(fā)生器一樣，只能手按開關(guān)在出廠預(yù)設(shè)固定頻率內(nèi)連續(xù)釋放脈沖串，不僅導(dǎo)致產(chǎn)生的熱量不可控，也不符合IRE算法臨床治療中一個心電周期在R波有效安全不應(yīng)期內(nèi)釋放一個脈沖的要求[10]。因此，需要對這臺高壓脈沖源加裝熱反饋和心電觸發(fā)控制系統(tǒng)。使其能夠按照IRE算法進行釋放脈沖，同時增加溫度閉環(huán)反饋，監(jiān)測目標(biāo)區(qū)溫度實現(xiàn)超溫停止釋放脈沖。通過這種方式，可以根據(jù)需求對市面帶有手動釋放開關(guān)的、不同功率參數(shù)的成品高壓脈沖發(fā)生器實現(xiàn)控制。該控制系統(tǒng)的程序設(shè)計流程，如圖2所示。

圖2 脈沖控制程序流程Fig.2 Programme flow diagram of pulse control

選擇Arduino UNO R3開發(fā)板作為控制單元是因為其開源化的硬件和軟件平臺[11-12]。硬件內(nèi)置A/D轉(zhuǎn)換，支持豐富的外圍傳感器。Arduino IDE軟件支持相關(guān)庫文件調(diào)用和例程參考，在此基礎(chǔ)上進行二次開發(fā)，大大縮短了研發(fā)周期。

實驗選用的脈搏傳感器模塊型號為PulseSensor XD-58C。實物如圖3所示。其本質(zhì)是一種反射式光電信號傳感器。其原理是通過檢測綠色LED發(fā)出的光隨血管容積的變化，光的吸收量也發(fā)生變化，從而得到了脈搏波[13]，輸出波形如圖4所示。模塊為三線制，分別為模擬信號輸入端、5 V供電端和GND端。模擬口采集到的光電模擬信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成0～1 024之間的數(shù)值，以模塊推薦的550作為R波觸發(fā)條件，兼顧靈敏和準(zhǔn)確性。但實際上大于550的觸發(fā)時間長達(dá)數(shù)十毫秒，在此時間范圍內(nèi)，會造成多個脈沖的發(fā)放。為了精準(zhǔn)發(fā)放一個脈沖，采用Delay延時函數(shù)控制Arduino數(shù)字口觸發(fā)電平高低時間繼電高壓脈沖控制開關(guān)時間。例如，在高壓脈沖發(fā)生器釋放頻率300 Hz的條件下，即一個周期約為3.33 ms。將有效高電平時間控制在3.33 ms內(nèi)即可實現(xiàn)每次觸發(fā)釋放一個脈沖。將Arduino D13 I/O口作為高電平信號觸發(fā)輸出端，可以通過板載LED的閃爍頻率和時間長短觀察搏動周期和觸發(fā)時間，與高壓脈沖發(fā)生器受控端口通過3～50 V DC-DC固態(tài)繼電器相連，即可實現(xiàn)心電信號控制一個脈沖的發(fā)放。

圖3 光電式脈搏傳感器實物圖Fig.3 Figure of photoelectric pulse sensor

圖4 脈搏傳感器串口輸出波形Fig.4 Serial output waveform of pulse sensor

實驗選用的溫度傳感器模塊型號為YL-38，如圖5(a)所示。原理是利用一個10 kΩ NTC熱敏電阻和10 kΩ電阻串聯(lián)后利用熱敏電阻探頭上的分壓模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量，再通過 Steinhart-Hart方程轉(zhuǎn)換為溫度數(shù)值。該模塊有四個端口，分別為模擬量輸入口、數(shù)字量輸入口、5 V供電端和GND端，數(shù)字量輸入口通過模塊上LM393比較器超溫可觸發(fā)其LED點亮，可以不接。目前IRE熱效應(yīng)檢測主要采用光纖測溫設(shè)備[14]，因光纖探頭不導(dǎo)電，可以避免電磁干擾，但設(shè)備價格過于高昂。該方案溫度傳感器為防止電磁干擾造成溫度測量不準(zhǔn)和電場不均勻，需替換原有10 kΩ熱敏探頭，更換為直徑0.8 mm珠型高靈敏環(huán)氧塑封絕緣探頭（上海領(lǐng)技公司，R=10 kΩ，B=3 950，精度1%），如圖5(b)所示。引線延長加絕緣處理，如圖5(c)所示。

圖5 溫度傳感器及其替換探頭Fig.5 Temperature sensor and replacement of probe

接入Arduino寫入測溫程序，用4～100oC之間的水溶液多次測試，溫度響應(yīng)迅速，和熱電偶、電導(dǎo)率儀以及水銀溫度計測得的溫度誤差在0.5oC以內(nèi)。脈沖釋放中工作穩(wěn)定，溫度隨脈沖的發(fā)放呈鋸齒狀上升。脈沖按心率釋放時測試液溫度曲線，如圖6所示。溫度傳感器將實時采集的溫度數(shù)據(jù)反饋給Arduino，協(xié)同脈搏傳感器一同控制脈沖發(fā)放。未達(dá)溫度閾值上限時，滿足脈搏傳感器觸發(fā)條件時D13口置高電平觸發(fā)脈沖釋放。超過溫度上限時，置低電平停止觸發(fā)，待溫度降至閾值以下時再次觸發(fā)。該實驗在常溫下28oC下進行，可選擇37～40oC之間作為溫度上限，從而保證細(xì)胞不會因為熱效應(yīng)致死，便于評估IRE的殺傷效應(yīng)。

圖6 脈沖按心率釋放時測試液溫度曲線Fig.6 Temperature curve of test fluid when pulse releasedaccording to heart rate

3 細(xì)胞學(xué)體外測試驗證

將體外培養(yǎng)的人肺癌細(xì)胞A549培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液等比例混合制成細(xì)胞懸液，測得混懸液電導(dǎo)率為0.8 S/m。取400 μL混懸液加樣至48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用5 mm間距電極針放入各孔連接高壓脈沖發(fā)生器輸出端，輸入觸發(fā)電平控制端接入Arduino開發(fā)板和脈搏、溫度傳感器，各硬件之間連接，如圖7所示。

圖7 硬件連接示意圖Fig.7 Hardware connection diagram

上電后高壓脈沖發(fā)生器按照心電觸發(fā)和溫度反饋控制程序釋放脈沖，記錄電壓、脈寬、脈沖個數(shù)等數(shù)據(jù)。脈沖電場處理后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h排除部分細(xì)胞可逆性的穿孔，然后進行臺盼藍(lán)染色和活死細(xì)胞計數(shù)篩選最佳參數(shù)條件。臺盼藍(lán)活死細(xì)胞染色原理：活細(xì)胞細(xì)胞膜完整，臺盼藍(lán)染料拒染；死細(xì)胞細(xì)胞膜穿孔，染料進入細(xì)胞內(nèi)將細(xì)胞染成藍(lán)色。應(yīng)用Countstar IC1000型自動細(xì)胞計數(shù)儀實現(xiàn)對活死細(xì)胞的計數(shù)，重復(fù)測試20孔，計算細(xì)胞穿孔率的平均值。在Arduino及其傳感器控制和反饋下，高壓脈沖發(fā)生器在電壓600 V、場強1 200 V/cm，釋放100個脈寬100 μs的脈沖的參數(shù)下，95%以上的細(xì)胞出現(xiàn)非熱性的IRE，如圖8所示，(a)為處理前活細(xì)胞拒染，(b)為處理后大部分細(xì)胞穿孔被染色。

圖8 脈沖電場處理前后的細(xì)胞染色Fig.8 Cell staining before and after pulsed electric field treatment

4 結(jié)語

本實驗提出的Arduino聯(lián)合其外圍傳感器控制高壓脈沖發(fā)生器并用于IRE實驗的方案實現(xiàn)簡單，所需硬件皆為成品，易于購得，成本低廉?？刂品答伋绦蚝唵?，無需額外開發(fā)上位機軟件。經(jīng)體外實驗測試，系統(tǒng)運行平穩(wěn)，按照目前應(yīng)用于臨床的IRE算法實現(xiàn)了非熱IRE。本小型系統(tǒng)具有輕便可移動、開源易實現(xiàn)、算法可調(diào)便于二次開發(fā)等優(yōu)點，尤其適用于資源和資金缺乏的高校醫(yī)學(xué)及生物醫(yī)學(xué)工程專業(yè)研究生IRE研究入門和改進。在方案基礎(chǔ)上進一步完善和優(yōu)化，使其不但能夠應(yīng)用于不同細(xì)胞IRE參數(shù)篩選和優(yōu)化、三維細(xì)胞組織膠IRE電場量效關(guān)系研究、電化學(xué)、電熱效應(yīng)、電誘導(dǎo)免疫學(xué)、組織病理學(xué)、組織阻抗和電導(dǎo)率等IRE相關(guān)體外實驗，也能進一步安全有效地應(yīng)用于動物體內(nèi)小病灶I(lǐng)RE組織消融方面的實驗研究。