摘要 采用形態(tài)鑒定與ITS分子序列鑒定相結(jié)合的方法，對(duì)采集的一株馬勃屬野生真菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)該菌種菌絲生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，初步通過(guò)形態(tài)鑒定法鑒定為梨形馬勃，后進(jìn)一步用ITS分子序列鑒定法鑒定，分離株rDNA ITS 片段長(zhǎng)度為697 bp，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI與GenBank中已知菌種進(jìn)行BLAST比對(duì)，采用MEGA 2.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，鑒定分離菌種為網(wǎng)紋馬勃，結(jié)合形態(tài)特征，最終鑒定該菌種為網(wǎng)紋馬勃（Lycoperdon perlatum）。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，可溶性淀粉為該菌絲生長(zhǎng)的最適碳源，硝酸銨為最適氮源，7.0為最適pH，菌絲最適溫度為25 ℃。

關(guān)鍵詞 網(wǎng)紋馬勃;分離;鑒定;生物學(xué)特性

中圖分類號(hào) S-646? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）13-0120-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.029

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Identification and Biological Characteristics of a Wild Lycoperdon perlatum

ZHANG Yan

（Liaoning Provincial Institute of Poplar， Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract A wild macrofungi fruiting body was isolated by tissue isolation method， identified by morphological identification and its molecular sequence identification， and the biological characteristics of the mycelium were studied. The results showed that the strain was identified as Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers by morphological identification and ITS molecular sequence identification. The length of ITS fragment of rDNA was 697 bp. The sequencing results were registered in NCBI and compared with the known strains in GenBank by blast， the ITS sequence with similar height was downloaded and compared with cluster W. Mega 2.0 software was used to construct the system tree， and the isolated strain was identified as Lycoperdon perlatum. The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch， the suitable nitrogen source was ammonium nitrate， the suitable pH value was 7.0， and the optimum temperature was 25 ℃.

Key words Lycoperdon perlatum;Isolation;Identification;Biological characteristics

網(wǎng)紋馬勃（Lycoperdon perlatum），馬勃菌目馬勃菌科馬勃屬。夏秋季林中常見(jiàn)，幼時(shí)可食，子實(shí)體有消腫、止血、解毒作用?？膳c松樹(shù)、櫟樹(shù)、云杉等形成外生菌根，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，有必要開(kāi)展深入研究。筆者對(duì)該野生菌種進(jìn)行了鑒定，并初步研究其生物學(xué)特性，旨在為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

該林場(chǎng)距哈爾濱市108 km，地處127°30′～127°34′E，45°20′～45°25′N，年平均氣溫2.6 ℃，最低溫度在1月，為-31.9 ℃，最高溫度在7月，為32 ℃。年均降水量723.8 mm，多集中在7、8月，占全年總降水量的54%，蒸發(fā)量1 093.3 mm，無(wú)霜期120～140 d，年日照時(shí)數(shù)2 471.3 h，春季有很強(qiáng)的西南、西北氣流侵入，少雨干旱。該地區(qū)地帶性土壤為暗棕壤，有機(jī)質(zhì)含量較為豐富。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 子實(shí)體。子實(shí)體采自東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗(yàn)林場(chǎng)（圖1）。

1.2.2 培養(yǎng)基。

菌種分離及擴(kuò)繁采用PDA加富培養(yǎng)基。

1.2.3 主要試劑及引物。

選用TIANGEN-DNA secure-新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），引物ITS1/ITS4（寶生物工程有限公司）[1]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離。

將球狀子實(shí)體表面用75%乙醇棉輕輕擦拭干凈，放入超凈工作臺(tái)上，在菇柄處用手術(shù)刀切開(kāi)0.5 cm深，用手輕輕掰開(kāi)，從露出的新鮮菌肉處切取米粒大小的菌肉接入培養(yǎng)基。然后于25 ℃暗培養(yǎng)，標(biāo)記為L(zhǎng)XMB。記錄分離成功率、菌絲塊萌發(fā)時(shí)間、菌絲顏色、密度、長(zhǎng)勢(shì)[2]。

1.3.2 菌種鑒定。

1.3.2.1 形態(tài)鑒定法。

對(duì)照?qǐng)D譜等工具書(shū)，觀察子實(shí)體的形狀、顏色等形態(tài)特征，進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2.2 分子鑒定法。

刮取新鮮菌絲，使用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，并將提取的DNA溶于25 μL TE（pH 8.0）中，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

以提取DNA為模板，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用張妍等[2]的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行。將PCR產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照，依據(jù)條帶清晰情況，確定是否進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序。

將測(cè)得的序列輸入GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，比對(duì)出最為相似的已有序列，節(jié)選比對(duì)出相似序列的ITS區(qū)域，用Clustalw（BioEdit 7.0軟件）進(jìn)行多序列比對(duì)。將比對(duì)結(jié)果輸入MEGA 5.2軟件，采用N-J法構(gòu)建測(cè)得序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[3]。

1.3.3 生物學(xué)特性分析。

開(kāi)展不同碳源、氮源、pH、溫度4個(gè)單因素試驗(yàn)（表1），每處理5次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后，測(cè)量菌絲直徑，同時(shí)觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、濃密度、色澤等生長(zhǎng)指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離結(jié)果

分離第2天可見(jiàn)菌塊上長(zhǎng)出白色絨毛狀菌絲，菌絲生長(zhǎng)初期顏色潔白、菌絲整齊，待菌絲快要長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿時(shí)，菌絲較密，邊緣整齊，有束狀菌絲（圖2、3）。 在分離過(guò)程中，污染情況發(fā)生較少，可見(jiàn)組織分離是該菌種適宜的分離方法。菌絲平均生長(zhǎng)速度為0.148 cm/d，長(zhǎng)速較慢。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定。

子實(shí)體小，高2.0～3.5 cm，梨形至近球形，不孕基部發(fā)達(dá)，由白色菌絲束固定于基物上。初期包被色淡，后呈茶褐色至淺煙色，外包被形成微細(xì)顆粒狀小疣，內(nèi)部橄欖色，后變?yōu)楹稚?。孢子橄欖色，平滑，球形，直?.5～4.5 μm。初步鑒定為梨形馬勃（Lycoperdon pyriforme Schaeff.：Pers）[4-5]。

2.2.2 分子鑒定。

2.2.2.1 菌絲總DNA 提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DNA樣品條帶有降解現(xiàn)象（圖4），嘗試作為PCR反應(yīng)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.2.2.2 PCR擴(kuò)增。

經(jīng)凝膠成像檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，成功擴(kuò)增出了目的條帶，且條帶整齊明亮（圖5），目的片段大小在700 bp左右，可以進(jìn)行測(cè)序。

2.2.2.3 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列。

序列測(cè)定結(jié)果顯示，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為堿基697 bp，登錄NCBI經(jīng)Blast比對(duì)測(cè)序，結(jié)果表明，與LXMB相似性最高的菌株序列號(hào)分別為AB669511.1、FM999681.1、DQ112630.1、DQ421095.1、FM999608.1，菌種名稱分別為Uncultured ectomycorrhizal fungus（不能培養(yǎng)的外生菌根真菌）、Uncultured fungus、Lycoperdon perlatum（網(wǎng)紋灰包）、Uncultured soil fungus、Uncultured fungus，Query cover分別為99%、100%、99%、99%、99%，ident均為99%。排名靠前的多為不能培養(yǎng)的外生菌根真菌，只有一個(gè)給出種名的為網(wǎng)紋灰包及網(wǎng)紋馬勃，根據(jù)第5位往后的比對(duì)結(jié)果，菌種名絕大多數(shù)為L(zhǎng)ycoperdon perlatum（網(wǎng)紋灰包），下載相似高的29個(gè)ITS序列，用ClustalW進(jìn)行序列比對(duì)，用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，分析序列采用 Ki mura雙參數(shù)模型。EU 780685.1為外類群（outgroup），從中間生根（The tree ism idpoint rooted）。圖6只顯示用百分?jǐn)?shù)表示的大于50%的Bootstrap值，從圖6可看出，MB與所有的Lycoperdon perlatum序列聚為一支，親緣關(guān)系較近，因此將MB形態(tài)學(xué)鑒定的梨形馬勃更正為網(wǎng)紋馬勃。

經(jīng)形態(tài)鑒定與分子鑒定綜合分析，最終鑒定該菌種為網(wǎng)紋馬勃（Lycoperdon perlatum），屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）腹隔擔(dān)子菌綱（Gasteromycetes）馬勃目（Lycoperdales）馬勃科（Lycoperdaceae）馬勃屬（Lycoperdon）。

2.3 菌絲生物學(xué)特性

2.3.1 不同碳源對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響。

由表2可知，不同碳源對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響差異極顯著?？扇苄缘矸圩魈荚磿r(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，且較為健壯濃密。但加入果糖的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最旺，在6個(gè)處理中最為濃密?？梢?jiàn)，綜合可溶性淀粉與果糖作為碳源最有利于網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)。

2.3.2 不同氮源對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響。

由表3可知，4種氮源處理間差異極顯著。硝酸銨作為氮源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快、健壯、濃密，是網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源。

2.3.3 不同pH對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響。

由表4可知，不同pH對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響差異極顯著。當(dāng)pH為7.0時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快、最濃密;當(dāng)pH為6.0、6.5、7.5時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度及長(zhǎng)勢(shì)均為中等;當(dāng)pH為5.5時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最慢，長(zhǎng)勢(shì)弱且稀?？梢?jiàn)，pH為7.0時(shí)最適合網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)。

2.3.4 不同溫度對(duì)網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)的影響。

由表5可知，不同溫度處理差異極顯著，網(wǎng)紋馬勃菌絲在25 ℃時(shí)生長(zhǎng)最快，30 ℃次之，15～30 ℃時(shí)均可生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

3.1 菌種鑒定

該研究最初采用形態(tài)鑒定法鑒定菌種為梨形馬勃，但對(duì)于難以人工成功培養(yǎng)子實(shí)體的菌根菌，單純的形態(tài)鑒定法不夠準(zhǔn)確。近年來(lái)，形態(tài)鑒定輔以ITS序列分子鑒定，已被廣大研究人員廣泛應(yīng)用于大型真菌鑒定[6-11]。因此，進(jìn)一步采用ITS序列分子鑒定法，將菌種進(jìn)一步修正為網(wǎng)紋馬勃，可見(jiàn)ITS序列分子鑒定法結(jié)合形態(tài)鑒定對(duì)于鑒定難以人工培養(yǎng)成功子實(shí)體的菌根菌是非常有必要的。

3.2 生物學(xué)特性

該研究利用碳源、氮源、pH、溫度單因素試驗(yàn)初步確定了網(wǎng)紋馬勃菌絲生長(zhǎng)最適宜生長(zhǎng)條件。但總體來(lái)說(shuō)，外生菌根真菌菌絲生長(zhǎng)速度仍較慢，還需要在該試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索影響菌絲生長(zhǎng)的其他因素，以及各因素之間是否存在交互作用，進(jìn)而優(yōu)選出最優(yōu)培養(yǎng)方式。

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