左璐雅 霞浦縣動物疫病預(yù)防控制中心 福建霞浦 355100

2019 年以來，福建省動物疫病預(yù)防控制中心分批次組織各建設(shè)完成病原學(xué)PCR實驗室的動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)實驗室進行非洲豬瘟檢測能力比對。2019年12月，霞浦縣動物疫病預(yù)防控制中心申請參加比對試驗，專人負責在指定時間領(lǐng)取比對試驗盲樣，試劑不作統(tǒng)一發(fā)放，按照要求在規(guī)定時間完成實驗室檢測過程，出具檢測報告?，F(xiàn)將霞浦縣獸醫(yī)實驗室參加非洲豬瘟檢測能力比對試驗的情況匯總?cè)缦隆?/p>

1 材料與方法

1.1 試劑 非洲豬瘟病毒熒光PCR快速檢測試劑盒（熒光探針法），唐山怡安生物工程有限公司生產(chǎn)，試劑盒中樣本裂解液和樣本稀釋液儲存于2～8℃，其余組分避光條件下儲存于-20±5℃。

1.2 方法

1.2.1 樣品及預(yù)處理 4份血清樣品均來自福建省動物疫病預(yù)防控制中心提供盲樣，放置于室溫（18～25℃）平衡備用。用樣本稀釋液進行5倍稀釋后，取5μL直接上樣。

1.3 熒光PCR擴增

1.3.1 擴增試劑準備 從試劑盒中取出PCR反應(yīng)液、陰性對照、陽性對照，待所有組分完全溶解后，振蕩混勻5 s，瞬時離心5 s。

1.3.2 配制反應(yīng)體系 在0.2 mLPCR管中配制反應(yīng)體系，ASFV-PCR反應(yīng)液20μL，經(jīng)預(yù)處理的樣本（或陰性/陽性對照）5μL，總體積25μL，操作完畢壓緊管蓋，瞬時離心。

1.3.3 設(shè)置反應(yīng)條件 按表1設(shè)置反應(yīng)條件。

表1 擴增反應(yīng)條件

1.3.4 熒光通道的選擇 選擇FAM通道檢測ASFV核酸。

1.4 判定

1.4.1 質(zhì)控標準 陰性對照的FAM檢測通道無S型擴增曲線。陽性對照的FAM檢測通道有典型S型擴增曲線，且Ct值≦23。陰性對照和陽性對照檢測均符合上述結(jié)果，則試驗有效，否則試驗無效。

1.4.2 結(jié)果判定 如果樣本在FAM檢測通道無典型S型擴增曲線且無Ct值，判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陰性。如果樣本在FAM檢測通道有典型S型擴增曲線，且Ct值≦23，判定為非洲豬瘟病毒核酸檢測陽性。

2 結(jié)果與分析

陽性對照Ct值為19.6，陰性對照無Ct值，判定試驗有效。4份檢測樣品中有1份為陽性，其余3份均為陰性（見表2）。

表2 非洲豬瘟檢測能力比對數(shù)據(jù)統(tǒng)計

參加該次非洲豬瘟檢測能力比對，霞浦縣獸醫(yī)實驗室的檢測能力合格，但在過程中凸顯出幾點問題值得注意和思考。

一方面是2019年以前尚未建設(shè)病原學(xué)PCR實驗室，獸醫(yī)實驗室主要承擔血清學(xué)檢測，對病原學(xué)檢測相關(guān)知識知之甚少，經(jīng)驗不足。另一方面是進行病原學(xué)試驗，對生物安全水平的要求非常高，一旦操作不規(guī)范很容易造成污染；同時，試驗結(jié)束后要認真對樣品進行無害化處理。實驗室人員要舉一反三，迅速掌握檢測技術(shù)要點。