尹樂斌，廖 聰，劉椏麗，何 平，李樂樂，楊愛蓮，劉 丹

（1.邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點實驗室，湖南 邵陽 422000）

豆清液又稱為黃漿水或大豆乳清（soybean whey），在酸沉大豆蛋白提取過程中，在等電點pH 4～5時，80%大豆蛋白沉淀成為豆腐的主要組成，而部分酸溶蛋白溶解于水中，并隨著豆腐的壓榨工藝被析出，成為豆清液[1]。豆清液蛋白大部分為大豆蛋白2S組分，含乳球蛋白、乳白蛋白、免疫球蛋白等，大豆乳清蛋白占大豆蛋白總量的6%～7%[2]，由于蛋白質(zhì)提取工藝的限制和大豆乳清蛋白的性質(zhì)，豆清液中有較多營養(yǎng)物質(zhì)未能得到有效利用。目前工廠對豆清液的處理仍多采取直接排放的方式，這不僅不符合環(huán)境保護要求，也是對資源的浪費，因此對豆清液進行高值化利用是目前的研究熱點。為解決目前豆清液所存在的問題，陸洲等[3]利用植物乳桿菌發(fā)酵豆清液獲取細菌素，尹樂斌等[4]利用豆清液制備乳酸飲料，王容等[5]利用豆清液制備酸湯類火鍋調(diào)味品。通過微生物發(fā)酵食品加工副產(chǎn)物中的相關成分并降解抗營養(yǎng)因子是一項極具前景的食品加工副產(chǎn)物深加工技術。通過建立細胞生長、產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗的發(fā)酵動力學模型，可深入了解產(chǎn)物形成機制，對發(fā)酵試驗模擬放大、條件優(yōu)化和自動化控制有重大意義[6-7]。ZHANG A H等[8]建立了包含菌體死亡、產(chǎn)物抑制、副產(chǎn)物抑制等因素的新動力學模型，用于分析丁酸梭菌（Clostridium butyricum）發(fā)酵甘油生產(chǎn)丙二醇的過程。關于發(fā)酵動力學的研究也可見于酒類發(fā)酵[9]、菜籽粕制備多肽[10]、小麥秸稈發(fā)酵生產(chǎn)抗氧化多糖[11]等。乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)可產(chǎn)生金屬離子螯合、抗氧化、抗菌、降血壓等功能肽，同時也可為自身的生長提供氨基酸[12-13]。利用微生物發(fā)酵豆清液制備多肽并開展應用研究大有潛力，然而目前鮮有關于利用乳酸菌發(fā)酵豆清液制備多肽并研究發(fā)酵體系中的代謝過程的文獻報道。

本研究利用鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、玉米乳桿菌（Lactobacilluszeae）三株乳酸菌對豆清液進行混菌發(fā)酵，以菌總量、還原糖含量、多肽含量為參數(shù)建立乳酸菌混菌發(fā)酵動力學模型，并測定發(fā)酵過程中豆清液的pH、蛋白酶酶活、鈣螯合活力，為進一步放大試驗及工業(yè)化生產(chǎn)豆清液多肽提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

豆清液（蛋白質(zhì)含量（2.36±0.05）g/100 mL，還原糖含量（1.36±0.03）g/100 mL）：湖南省邵陽市豆制品加工基地豆清發(fā)酵液點漿豆腐時收集；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）：本實驗室分離保藏。

1.1.2 化學試劑

谷胱甘肽（純度≥99%）：上海源葉生物科技公司；植酸酶（酶活50 U/mg）：美國Sigma公司；無水氯化鈣（分析純）：山東九重化工公司；3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：廈門海標科技有限公司；三氯乙酸、硼酸、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：上海阿拉丁生物科技公司；雙縮脲蛋白定量試劑盒：北京雷根生物技術公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技公司。稱取培養(yǎng)基干粉54 g加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)pH至6.4，加入2.0%瓊脂，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

PHS-3C pH計：梅特勒-托利多（上海）；DH-360恒溫培養(yǎng)箱、101-1電熱鼓風干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器公司；BA210恒溫振蕩器：蘇州捷美電子公司；VELOCITY14R臺式冷凍離心機：美國Dynamica Scientific 有限公司；UV-2006i紫外分光光度計：日本島津公司；SX-4-10型馬弗爐：天津泰斯特儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌混菌發(fā)酵豆清液

種子液的制備：將甘油凍存管中的玉米乳桿菌（Lactobacillus zeae）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）接種至MRS培養(yǎng)基中37 ℃活化2代。將活化菌種轉接至pH 6.4豆清液中37 ℃培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌濃度為108CFU/mL，得到乳酸菌種子液。

乳酸菌混菌發(fā)酵：將新鮮豆清液置于燒杯中，添加400 U/L植酸酶酶解（pH 5.0，25 ℃）1 h，在前期摸索的基礎上發(fā)酵，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（115 ℃、15 min）冷卻至40 ℃左右后將三株菌種按1∶1∶1的比例接種到加入含0.5%葡萄糖豆清液中，菌液添加量為豆清液體積的4.7%，初始pH值為6.4，溫度為40 ℃[14]，60 r/min搖床振蕩發(fā)酵36 h。每隔2 h取豆清液樣品，測定活菌數(shù)、多肽含量、還原糖含量、pH值，隔4 h測定酸性和中性蛋白酶酶活性。

1.3.2 生長曲線測定

采用稀釋平板法計數(shù)。每2 h取豆清發(fā)酵液10倍稀釋。將0.2 mL三個適當稀釋倍數(shù)的乳酸菌懸浮液接種到MRS培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后進行菌落計數(shù)以繪制乳酸菌的生長曲線。

1.3.3 分析檢測

（1）多肽含量測定

參考尹樂斌等[14]的方法并適當修改測定多肽含量。以0.5 mg/mL為梯度配制0～6 mg/mL谷胱甘肽標準溶液。標液與雙縮脲試劑以1∶4體積比混合，室溫反應0.5 h，波長540 nm處測吸光度值。以谷胱甘肽標準溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制谷胱甘肽標準曲線。

將樣品溶液與等體積10%三氯乙酸混合，靜置10 min，然后離心去除高分子蛋白。按標準曲線回歸方程計算樣品中多肽含量。

（2）蛋白質(zhì)含量測定

將發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min除菌體，參考國標GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法[15]測定蛋白質(zhì)含量。

（3）還原糖含量測定

參照王容等[5]的方法，采用分光光度法測定豆清液中還原糖含量。

（4）pH值測定

采用pH計測定混菌發(fā)酵過程中豆清液的pH值。

（5）蛋白酶活性測定

發(fā)酵液經(jīng)離心去除菌體后，按照國標GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定》福林酚法[16]測定發(fā)酵過程中酸性及中性蛋白酶活性。

（6）鈣結合量及豆清多肽-鈣螯合率測定

取發(fā)酵后的豆清液多肽液10 mL，調(diào)節(jié)pH 6.5，加入10 mmol/L氯化鈣溶液5 mL，搖勻后放入40 ℃、80 r/min搖床，螯合90 min后取出，待冷卻至室溫后在反應體系中加入3倍無水乙醇，搖勻后靜置1 h，10 000 r/min離心5 min。取沉淀物50 ℃電熱鼓風干燥，將產(chǎn)品灰化后定容至25 mL。參考國標GB 5009.92—2016《食品中鈣的測定》滴定法[17]測定樣品中的鈣結合量（每毫升豆清多肽所結合鈣含量）另取多肽液10mL與10mmol/L氯化鈣溶液5 mL，灰化后定容至25 mL，測定鈣含量后計算所得的鈣含量為反應體系中的總鈣含量，通過與螯合后的樣品鈣結合量相比，可得出鈣螯合率（鈣螯合率可反映在在發(fā)酵過程中豆清液多肽得鈣螯合活力）。根據(jù)（1）、（2）式計算出豆清多肽-鈣螯合率。

式中：H為鈣結合量，mg/mL；T為滴定酸度，即滴定用EDTA溶液相當于鈣的質(zhì)量數(shù)，mg/mL；V1為滴定時消耗EDTA溶液的體積，mL；50為樣品消化液的定容體積與滴定用待測液體積之比。

式中：A為鈣螯合率，%；V2為相同體系的多肽溶液與鈣溶液的混合溶液滴定時所消耗的EDTA的體積，mL。

1.3.4 發(fā)酵動力學方程的建立

對于發(fā)酵后期菌體濃度較大的體系，一般采用描述生長曲線為S形的Logistic模型[18]。針對本實驗情況，用Logistic方程模擬發(fā)酵體系豆清液菌體生長變化；Luedeking-Piret方程模擬多肽生成及蛋白質(zhì)消耗變化。

（1）菌體生長動力學方程

Logistic方程微分式：

求積分：

式中：CX為菌體生物量，108CFU/mL；t為時間，h；k為微生物最大比生長速率，108CFU/h；Cm為最大菌濃度，108CFU/mL；C0為初始菌濃度，108CFU/mL。

（2）產(chǎn)物生成動力學方程

發(fā)酵過程中，產(chǎn)物生成與菌體生長有部分偶聯(lián)、偶聯(lián)、非偶聯(lián)關系。本實驗采用的混合乳酸菌為部分偶聯(lián)型，當菌體處于穩(wěn)定期時，采用Luedeking-piret方程[5]。模型方程如下：

式中：P為多肽含量，mg/mL；P0為初始多肽含量，mg/mL；n1為與乳酸菌有關合成系數(shù)；n2為與菌體生長有關合成系數(shù)。

可得簡寫方程（6）式，求n1和n2及（5）式中C0，和k。

（3）基質(zhì)消耗動力學方程

發(fā)酵體系中，菌體生長、產(chǎn)物的生成、細胞活動維持的相關關系式如下：

在理想狀態(tài)下，可忽略產(chǎn)物生成的基質(zhì)消耗，將（4）式代入（7）式得（8）式：

式中：S為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；S0為初始蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL；ZX/S為底物用于菌體生長得率系數(shù)；ZP/S為底物用于產(chǎn)物合成得率系數(shù)；P為產(chǎn)多肽量，mg/mL；r1為微生物維持常數(shù)。

得簡化方程（10）式：

做菌種進入穩(wěn)定期時S～t的線性方程求r1和r2，得基質(zhì)蛋白質(zhì)消耗的動力學模型。

（4）動力學方程的驗證

將原有數(shù)據(jù)繪為散點圖，將求解方程作為趨勢線添至散點圖，得到和方程有關的P值和相關系數(shù)R2，對動力學模型進行驗證。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌混菌發(fā)酵制備多肽動力學模型

2.1.1 乳酸菌混菌發(fā)酵制備多肽體系中的代謝情況

混合乳酸菌在豆清液中發(fā)酵代謝情況見圖1。由圖1可知，發(fā)酵周期36 h，乳酸菌生長曲線為S形，蛋白消質(zhì)耗曲線則呈反S形，多肽豆清液水解蛋白質(zhì)產(chǎn)物和菌體次級代謝產(chǎn)物與菌體生長曲線部分偶聯(lián)?；旌先樗峋陌l(fā)酵過程可分為3個階段。延滯期0～4 h，菌體增長速率低，產(chǎn)物生成少，底物消耗緩慢；4～18 h為對數(shù)期，氮、碳源充足，乳酸菌生長迅速，底物快速消耗，多肽含量不斷增加，多肽含量最高時達到5.31 mg/mL；18～36 h進入穩(wěn)定期，此時乳酸菌繁殖速度下降、死亡數(shù)增加，菌體繁殖與死亡數(shù)量達到平衡，菌落總數(shù)穩(wěn)定在5×108CFU/mL左右。乳酸菌最適pH為5.5～7.0，且具有耐酸特性，但由于的乳酸菌產(chǎn)酸特性，豆清液的pH值在發(fā)酵后期較低（3.7左右），抑制了菌體生長，同時蛋白質(zhì)消耗殆盡，多肽合成速度降低。在蛋白酶和酸水解的作用下，肽鏈繼續(xù)水解，多肽開始朝轉化成氨基酸的方向進行，多肽含量趨向于小幅度降低。

圖1 乳酸菌混菌發(fā)酵制備多肽動力學曲線Fig.1 Kinetic curve of peptide preparation by mixed fermentation of lactic acid bacteria

2.1.2 發(fā)酵動力學擬合

對（4）式線性擬合得到的菌體數(shù)y隨時間x變化的方程為：y=0.353 3x-3.712 0，相關系數(shù)R2=0.991 9?？傻米畲蟊壬L速率k=0.353 3 h-1，初始菌濃度C0=0.119 2×108CFU/mL。

對菌體穩(wěn)定期多肽含量進行擬合，得產(chǎn)物P與菌體量有關的合成系數(shù)n的方程：P=0.100 4 n+3.603 7，相關系數(shù)R2=0.825 8，與菌體量有關的合成系數(shù)n1=0.020 1。將最大比生長速率k，初始菌濃度C0，菌體最大生物量Cm，與菌體量有關的合成系數(shù)n1，初始多肽濃度P0=0.895 0 mg/mL，代入（6）式并過原點線性擬合，得方程：P=0.863 8n+0.382 2，相關系數(shù)R2=0.930 8，由此得n2=0.863 8。

取菌體穩(wěn)定期蛋白質(zhì)濃度對時間擬合有：S=-0.15t+13.82，相關系數(shù)R2=0.957 0，得微生物維持常數(shù)r1=0.030 0。將最大比生長速率k，初始菌濃度C0，菌體最大生物量Cm，微生物維持常數(shù)r1，初始蛋白質(zhì)含量S0=24.25 mg/mL，代入（10）式并過原點線性擬合，得方程：S=2.774 0t+0.223 0，相關系數(shù)R2=0.988 6，由此得底物用于菌體生長得率系數(shù)r2=2.774 0。

發(fā)酵動力學模型參數(shù)值及初始條件見表1。

表1 發(fā)酵動力學模型參數(shù)值及初始條件Table 1 Parameters and initial conditions of fermentation kinetics model

將表1各參數(shù)及初始條件值代入（4）式、（5）式、（8）式分別得到菌體生長動力學模型：

多肽生成動力學模型：

蛋白消耗動力學模型：

2.1.3 模型驗證

混菌發(fā)酵過程菌體生長、多肽生成及蛋白質(zhì)消耗實驗值與模型值擬合曲線見圖2。由圖2可知，混合菌種的模型值與實驗值擬合較為理想；菌體生長、多肽生成與蛋白消耗的動力學模型Pearson相關系數(shù)R2均＞0.999；菌體生長和多肽生成動力學模型在0.01水平（雙側）顯著相關。表明該模型較好反映了實際發(fā)酵過程中的動力學行為。

圖2 菌體生長（a）、多肽產(chǎn)量（b）及蛋白質(zhì)消耗（c）實驗值與模型值擬合曲線Fig.2 Fitting curves of experimental values and model values for bacteria growth (a),polypeptide yield (b) and protein consumption (c)

2.2 發(fā)酵過程中還原糖含量變化

還原糖作為乳酸菌生長的碳源，與乳酸菌混菌發(fā)酵生產(chǎn)多肽的動力學模型也有所關聯(lián)?；旌先樗峋诙骨逡后w系中還原糖變化見圖3。由圖3可知，在延滯期，還原糖的消耗速度較低，此時體系中菌體生物量低，對碳源的總體利用量??；隨著菌體的增多和代謝的增強，在生長期還原糖消耗加快；18 h后菌體繁殖速度下降，還原糖消耗基本不變。

圖3 發(fā)酵過程中還原糖含量的變化Fig.3 Changes of reducing sugar contents during fermentation process

2.3 發(fā)酵過程中pH值變化

豆清液中蛋白質(zhì)的水解除蛋白酶和微生物的代謝作用外，酸水解也起到了重要作用。乳酸、蘋果酸、檸檬酸、酒石酸等隨著乳酸菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生，在一定時間范圍內(nèi)，隨著發(fā)酵時間延長，體系中酸度增大，pH降低[19-20]。發(fā)酵過程中pH值變化見圖4。由圖4可知，在混菌發(fā)酵體系中pH值在前16 h由初始值6.25持續(xù)下降，原因在于乳酸菌在發(fā)酵過程中將糖類物質(zhì)轉化為乳酸等有機酸，在這期間發(fā)酵液的pH值與總酸含量變化呈負相關；而在12 h后pH值一定程度下降后趨于穩(wěn)定，這與混菌發(fā)酵進入穩(wěn)定期有關。碳水化合物、脂肪可在微生物作用下形成有機酸[21]。在發(fā)酵過程中，糖類物質(zhì)可以在微生物的作用下產(chǎn)生酸類物質(zhì)，在發(fā)酵的穩(wěn)定期階段，豆清液的低pH值（3.7左右）抑制了菌體生長，隨著碳源糖類物質(zhì)的消耗，酸類物質(zhì)的產(chǎn)生受限，最終pH值穩(wěn)定在3.5左右。

圖4 發(fā)酵過程中pH值的變化Fig.4 Changes of pH value during fermentation process

2.4 發(fā)酵過程中蛋白酶活性變化

乳酸菌中的蛋白水解由不同的包膜蛋白酶（cellenvelope proteinase，CEP）引發(fā)[22]，CEP分布在菌株間的差異很大，大多數(shù)乳酸菌僅含有1種細胞包膜蛋白酶[23]。中性蛋白酶最適pH值為6.0～7.5，酸性蛋白酶最適pH值為2.5～6.0。發(fā)酵過程中蛋白酶活性變化見圖5。

圖5 發(fā)酵過程中蛋白酶活性的變化Fig.5 Changes of protease activities during fermentation process

由圖5可知，在發(fā)酵體系中，酸性蛋白酶表現(xiàn)出比中性蛋白酶更強的活性，酸性蛋白酶在4～8 h時酸性蛋白酶活性最高，為3.6 U/mL左右，中性蛋白酶在4 h表現(xiàn)出最大活性2.48 U/mL，對比發(fā)酵過程中的pH值變化，此時是適宜于中性蛋白酶條件的pH值，隨著體系中酸性增大，酸堿度不適宜于中性蛋白酶。隨著發(fā)酵pH降低，在8 h后兩種蛋白酶活性均降低，酸性蛋白酶活性下降的原因可能在于酶與底物過渡態(tài)的結合能值降低，相較酸性蛋白酶，中性蛋白酶對酸性條件更為敏感，因此酶活有更明顯的下降趨勢。

2.5 發(fā)酵過程中豆清液鈣螯合活力的變化

多肽-鈣螯合物因其特有的組裝模式和吸收機制，具有促鈣吸收、抗氧化、抑菌、免疫調(diào)節(jié)等功能，是當前研究的熱點[24]。發(fā)酵過程中鈣螯合活力的變化見圖6。由圖6可知，發(fā)酵體系中的鈣螯合活力總體趨勢為先下降再升高后降低的趨勢，這可能是由于在發(fā)酵初期，體系中多肽含量較低，而本研究意在研究多肽與鈣螯合，故不作為參考，這種現(xiàn)象可能是蛋白質(zhì)的空間結構導致；鈣螯合率在14 h達到峰值33.35%，20 h后趨于穩(wěn)定，這是因為隨著豆清液水解過程的進行，蛋白質(zhì)的不斷減少和肽的增加導致水解位點的減少和水解產(chǎn)物中充當金屬的協(xié)調(diào)結合位點的親水基團（如-OH、-COOH和-NH2基團）的暴露，這可以解釋鈣結合能力的提高，而鈣螯合活性的下降與短肽鏈的不斷降解以及金屬離子有效結合位點減少有關[25]。劉麗莉[26]利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵制備膠原多肽鰲合鈣，鈣鰲合率為47.85%，與本研究結果相近。

圖6 發(fā)酵過程中鈣螯合率的變化Fig.6 Changes of calcium chelation rate during fermentation process

2.6 相關性分析

乳酸菌混菌發(fā)酵過程中各變量相關性見表2。由表2可知，菌體濃度和發(fā)酵中的碳源還原糖及氮源蛋白質(zhì)呈極顯著負相關（P＜0.01），試驗結果與乳酸菌生長特性相符合。同時，代謝產(chǎn)物多肽與菌體濃度呈顯著正相關（P＜0.05），與蛋白質(zhì)和還原糖呈顯著負相關（P＜0.05），多肽含量與鈣螯合率呈顯著正相關（P＜0.05）。

表2 乳酸菌混菌發(fā)酵過程中各變量相關性Table 2 Correlation of various variables in the mixed fermentation process of lactic acid bacteria

3 結論

本研究分析乳酸菌混菌發(fā)酵特征，建立了描述發(fā)酵過程中菌體生長、多肽生成和蛋白質(zhì)消耗的動力學模型，經(jīng)模型驗證試驗情況良好。還原糖含量總體趨勢下降；pH值在前16 h由初始值6.25持續(xù)下降，之后穩(wěn)定在3.5左右；酸性蛋白酶在培養(yǎng)體系中表現(xiàn)出比中性蛋白酶更強的活性，在4～8 h時酸性蛋白酶最大活性（3.6 U/mL），中性蛋白酶在4 h表現(xiàn)出最大活性（2.48 U/mL）；鈣螯合活力總體趨勢為先升高后降低，在14 h達到最高值33.35%，20 h后趨于穩(wěn)定。發(fā)酵過程中各變量有一定相關性，所建立的模型可用于指導實際生產(chǎn)。利用乳酸菌發(fā)酵豆清液生產(chǎn)豆清多肽，是實現(xiàn)大豆加工副產(chǎn)物高值化利用的一種創(chuàng)新途徑，此外發(fā)酵過程中的鈣螯合活性的變化表明豆清多肽具有制備多肽-鈣螯合物的潛力，這可作為今后的研究方向。