李少鵬，夏 婷，張竹君，趙宇軒，耿貝貝，任紅萌，牛思思，喬長晟，余君偉，王 敏*

（1.天津科技大學 省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室 生物工程學院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.寧夏中寧枸杞產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100；4.杞源堂（寧夏）生物科技有限公司，寧夏 中衛(wèi) 755100）

枸杞（Lycium barbarum）是茄科、枸杞屬植物，其果實是歷史悠久的藥食兩用物品[1]。寧夏是我國枸杞的發(fā)源地和主要生產(chǎn)地，且寧夏中寧枸杞更是因其高品質被載入新中國藥典。中醫(yī)藥用記載枸杞具有強筋健骨、清肝明目、潤肺滋腎、益氣補虛等功能[2]。枸杞中不僅含有糖類、蛋白質等營養(yǎng)物質，而且含有枸杞多糖、甜菜堿、氨基酸、多酚、黃酮等多種生物活性成分[3-4]。這些營養(yǎng)及活性物質賦予了枸杞提高人體免疫功能、抗氧化、改善新陳代謝、預防腫瘤、延緩衰老等功效[5-6]。因其優(yōu)質的保健價值被列入我國衛(wèi)生部藥食同源物品。

寧夏枸杞種植面積大，產(chǎn)量高，其藥效和營養(yǎng)價值上均居國內前列，但目前主要以干果形式出售，產(chǎn)業(yè)多樣化相對單一，枸杞加工轉化率不足，嚴重阻礙了寧夏枸杞的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。為了縮短原料處理周期、降低成本，克服枸杞不宜儲存、加工轉化率低的問題，將枸杞加工果酒，提高果酒品質和產(chǎn)品價值，增強市場競爭力，提高枸杞深加工產(chǎn)品市場份額。目前枸杞果酒的生產(chǎn)分為發(fā)酵型和配制型兩種，其中傳統(tǒng)發(fā)酵型枸杞酒多以枸杞干果為原料經(jīng)發(fā)酵得到枸杞酒，家庭自釀、小企業(yè)小規(guī)模生產(chǎn)居多，發(fā)展緩慢。OUYANG X等[7]對枸杞酒的發(fā)酵過程進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵參數(shù)為初始糖度22%、初始酸度3.6 g/L、酵母接種量0.02%、發(fā)酵溫度20 ℃，浸漬48 h，所釀制的枸杞果酒表現(xiàn)出最佳的枸杞果香和感官特征。汪琢等[8]研究了枸杞藍莓酒的釀造工藝，結果表明在發(fā)酵溫度24 ℃、二氧化硫添加量40 mg/L、酵母接種量0.08%、發(fā)酵時間8 d的最佳發(fā)酵參數(shù)下，得到一款枸杞藍莓果酒。董賽君等[9]對枸杞果酒低溫發(fā)酵工藝進行研究，其最佳發(fā)酵參數(shù)為初始pH值6.0、初始糖度16%、接種量0.7%、發(fā)酵溫度18 ℃時，枸杞果酒酒體呈金黃色且酸甜可口。目前枸杞果酒的釀造主要集中于干枸杞及相關復合原料的工藝研究，而有關新鮮枸杞果酒工藝及營養(yǎng)功能成分報道還相對較少。

本研究選用寧夏中寧新鮮枸杞為主要原料，制備枸杞果酒，通過單因素試驗和響應面分析優(yōu)化枸杞果酒的發(fā)酵工藝參數(shù)，并對枸杞果酒的營養(yǎng)與功能成分進行分析，以期提高枸杞的附加值，推動枸杞深加工產(chǎn)品的開發(fā)與創(chuàng)新。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞（特級，固酸比為6.84，總糖為155.83 g/L）：寧夏中寧縣；釀酒活性干酵母（RW）：安琪酵母股份有限公司；白砂糖、檸檬酸（均為食品級）：日照金禾博源生化有限公司；果膠酶（酶活4 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術有限公司；福林酚（分析純）：索萊寶生物科技有限公司；沒食子酸標準品（純度≥98%）：上海哈靈生物科技有限公司；蘆丁標準品（純度≥98%）：西安森卓生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ZWF-110X50水浴鍋：上海智城分析儀器制造有限公司；JD-322榨汁機：浙江金達電熱電器有限公司；JHGXT-4582ATC手持糖度折光儀：池州九華光學儀器有限公司；FA-A分析天平：北京世紀科信科學儀器有限公司；LHS-150生化培養(yǎng)箱：萊特（南通）科學儀器有限公司；Sense酶標儀：東樂自然基因生命科學公司；DKZ-1恒溫水浴鍋：濟南來寶醫(yī)療器械有限公司；UV-765分光光度計、DL7M-12L離心機：渡揚精密儀器（上海）有限公司；1260-Infinity高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；S-433D氨基酸自動分析儀：賽卡姆（北京）科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞果酒加工工藝流程及操作要點

枸杞→破碎勻漿→酶解→成分調整→滅菌→酵母活化→酒精發(fā)酵→過濾→陳釀→成品

破碎勻漿：將新鮮無病害的枸杞放入榨汁機中，按質量比加入5倍的純凈水進行破碎，得到枸杞果漿。

酶解：在枸杞果漿中按質量比加入0.02%的果膠酶，于45 ℃水浴鍋中保溫4 h，充分酶解，隨后升溫至85 ℃滅酶10 min。

成分調整：用白砂糖調整枸杞果漿的初始糖度為試驗設定值，并用檸檬酸調整pH值為6。

酵母活化：稱取釀酒活性干酵母，按質量比加入9倍的無菌水，在37 ℃水浴鍋中活化20 min，制備酵母活化液。

酒精發(fā)酵：在調整好成分的枸杞果漿中接種酵母活化液于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵5 d，每天同一時間取樣，測定酒精度，直至酒精度不再增加，結束發(fā)酵。

陳釀：將發(fā)酵酒液轉移到儲酒罐中，置于4 ℃儲存28 d，使枸杞果酒味道協(xié)調，風味更加突出，得到枸杞果酒。

1.3.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

初始糖度分別為23°Bx、25°Bx、27°Bx、29°Bx、31°Bx的枸杞果漿經(jīng)巴氏滅菌（65 ℃，30 min）后，分別接種0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%（V/V）的酵母活化液進行發(fā)酵，控制發(fā)酵溫度分別為16 ℃、19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃，初始pH值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，發(fā)酵時間為5 d。分別考察初始糖度、酵母菌接種量、發(fā)酵溫度、初始pH值對枸杞果酒品質的影響。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計

在單因素試驗結果基礎上，選取初始糖度（A）、酵母菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）、初始pH值（D）4個影響因素，以感官評分（Y）為響應值，進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計，隨后通過響應面分析確定枸杞果酒發(fā)酵的最優(yōu)工藝參數(shù)。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests design

1.3.4 分析檢測

（1）理化指標的測定

蛋白質測定：采用國標GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法；脂肪測定：采用國標GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》中索氏抽提法；總糖測定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中直接滴定法；還原糖測定：采用國標GB 5009.7—2016《食品安全國家標準食品中還原糖的測定》中直接滴定法；初始糖度測定：采用手持折光儀測定；酒精度測定：采用國標GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中酒精計法。

（2）功能成分的測定

總多酚含量的測定[10]：在波長765 nm處測定吸光度值（A765nm），以沒食子酸含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線，可得回歸方程：y=0.007 7x+0.081 5（相關系數(shù)R2=0.995 5）。利用標準曲線回歸方程計算樣品中總多酚含量，結果以mg沒食子酸當量（gallic acid equivalent，GAE）/mL表示。

總黃酮含量的測定[11]：在波長510 nm處測定吸光度值（A510nm），以蘆丁含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，可得回歸方程：y=0.248 9x+0.044 4（相關系數(shù)R2=0.999 6）。利用標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量，結果以mg蘆丁當量（rutin equivalen，RE）/mL表示。

多糖含量的測定[12]：取適量枸杞果酒樣品經(jīng)40 ℃旋蒸后，加入4倍體積的無水乙醇，靜置12 h，隨后以8 000 r/min離心10 min，收集沉淀物，加入蒸餾水復溶，向復溶液中加入Sevage試劑（三氯甲烷與正丁醇按照4∶1的體積比例混合而成），振蕩攪拌，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，重復6～7遍，直至蛋白質去除干凈，最后一次上清液經(jīng)截留分子質量為8～14 kDa的透析袋在流水中透析72 h，收集袋內溶液，待測。葡萄糖標準曲線的繪制[13]：在波長490 nm處測定吸光度值（A490nm），以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，可得回歸方程：y=3.537 5x+0.103 9（相關系數(shù)R2=0.993 0）。利用標準曲線回歸方程計算樣品中多糖含量，結果以mg/mL表示。

甜菜堿含量的測定：采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 2947—2016《枸杞中甜菜堿含量的測定》中高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）測定。

氨基酸的測定：采用國標GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》。

（3）微生物指標的測定

菌落總數(shù)、大腸桿菌和致病菌分別按照國標GB4789.2—2016《食品安全國家標準菌落總數(shù)測定》、GB 4789.3—2016《食品安全國家標準大腸菌群計數(shù)》和GB 29921—2013《食品安全國家標準食品中致病菌限量》測定。

（4）感官評價

邀請10名專業(yè)品酒師組成一個枸杞果酒感官評定小組，依據(jù)國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的標準對本試驗的枸杞果酒的色澤（1～15分）、澄清度（1～15分）、香氣（1～30分）和滋味（1～40分）4個方面進行感官評定，果酒樣品總分為4項得分之和，滿分100分，枸杞果酒感官評價標準見表2。

表2 枸杞果酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of wolfberry fruit wine

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用GraphPad Prism 8.0.1進行數(shù)據(jù)處理和制圖，采用DesignExpert8.0.6進行Box-Behnken試驗設計和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 初始糖度對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響

發(fā)酵液中初始糖度與發(fā)酵結束后酒精度的高低以及感官評價的好壞有密切的聯(lián)系。初始糖度對枸杞果酒的影響結果如圖1所示，隨著發(fā)酵液中初始糖度在23～31°Bx范圍內的增加，酒精度不斷增加，感官評分卻呈先上升后下降趨勢。當初始糖度在23～27°Bx時，酒精度和感官評分不斷增加；當初始糖度為27°Bx時，感官評分達到最大值，為90分，酒精度為12.12%vol；當初始糖度＞27°Bx之后，感官評分下降，這主要是因為發(fā)酵液中的初始糖度過高，發(fā)酵液的滲透壓增大，造成酵母活力下降，不利于其生長與發(fā)酵。雖然酵母在初始糖度27～31°Bx范圍內仍能利用糖生成酒精，但是效率降低，導致發(fā)酵不徹底，殘?zhí)呛窟^高，口感下降[14-15]。綜合考慮，選擇最適初始糖度為27°Bx。

圖1 初始糖度對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine

2.1.2 酵母菌接種量對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響

酵母接種量對枸杞果酒的影響如圖2所示，隨著酵母接種量在0.10%～0.30%范圍內的增加，酒精度和感官評分呈先上升后下降趨勢。當酵母接種量為0.10%～0.20%時，酒精度和感官評分隨之增高；當酵母接種量為0.20%時，枸杞果酒的酒精度和感官評分達到了最大值，分別為12.14%vol，91分；當酵母接種量＞0.20%之后，枸杞果酒的酒精度和感官評分降低，其原因是發(fā)酵液中酵母菌在發(fā)酵前期大量繁殖，消耗了大量營養(yǎng)物質，產(chǎn)生抑制酵母菌的代謝廢物，導致酒精度和口感降低[16]。綜合考慮，選擇最適酵母接種量為0.20%。

圖2 酵母接種量對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine

2.1.3 發(fā)酵溫度對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響

發(fā)酵溫度對枸杞果酒的影響如圖3所示，隨著發(fā)酵溫度在16～28 ℃范圍內的升高，酒精度和感官評分均呈先上升后下降趨勢。當發(fā)酵溫度為16～22 ℃時，酒精度和感官評分隨之提高；當發(fā)酵溫度為22 ℃時，酒精度和感官評分達到最大值，分別為12.08%vol，90分；當發(fā)酵溫度高于22 ℃之后，酒精度和感官評分隨之下降。發(fā)酵溫度過低時，酵母菌繁殖速率和活性都會降低，發(fā)酵產(chǎn)生的酒精會減少，導致酒體寡淡無味，口感不足。而發(fā)酵溫度過高時，也不利于酵母的生長繁殖以及代謝，生成的酒精含量不足，還會導致酒體成分的揮發(fā)和損失，風味口感欠佳。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine

2.1.4 初始pH值對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響

酵母菌在不同的初始pH值條件下，其酶促反應速率和對營養(yǎng)物質的吸收及菌體代謝能力是不一樣的，因此發(fā)酵產(chǎn)生酒精的能力也會改變[17]。初始pH值對枸杞果酒的影響如圖4所示，隨著初始pH值在4.0～6.0范圍內的增加，酒精度和感官評分先上升后下降。當初始pH值為4.0～5.0時，酒精度和感官評分隨之提高；當初始pH值為5.0時，酒精度和感官評分達到最大值，分別為12.22%vol，91分；當初始pH值＞5.0之后，酒精度和感官評分隨之下降。初始pH值＜5.0時，酵母菌繁殖速率和活性都會降低，產(chǎn)生的酒精就會減少，導致酒體寡淡，口感不足。而發(fā)酵液中初始pH值＞5.0之后，酵母菌代謝過于旺盛，生長繁殖速率加快，發(fā)酵液中的大量糖分被消耗，最后生成的酒精含量不足，影響口感[18]。因此，選擇最適初始pH值為5.0。

圖4 初始pH值對枸杞果酒酒精度和感官評分的影響Fig.4 Effect of initial pH on alcohol content and sensory score of wolfberry fruit wine

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

基于以上單因素試驗結果，選取初始糖度（A）、酵母接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）和初始pH值（D）的優(yōu)選水平進行Box-Behnken試驗設計與響應面分析，以感官評分（Y）作為響應值，運用多元二次回歸方程模擬最佳發(fā)酵工藝參數(shù)[19-20]，Box-Behnken試驗設計及結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

將表3的數(shù)據(jù)運用Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合分析，得到各個單因素與響應值感官評分（Y）之間的二次回歸方程：

由表4可知，感官評分（Y）回歸模型極顯著（P＜0.000 1），失擬性檢驗結果不顯著（P值=0.050 3＞0.05）。此外，決定系數(shù)R2=0.932 1，調整決定系數(shù)R2adj=0.864 2，說明通過此試驗模擬得到的二次回歸方程擬合程度高，誤差小，能比較準確地預測和分析結果[21]。表4顯著性檢驗結果顯示，模型中一次項A、C和二次項A2、B2、C2、D2對感官評分的影響均極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC、BC影響顯著（P＜0.05）。由表4中各因素F值可知，影響感官評分的4個因素順序為：初始糖度（A）＞發(fā)酵溫度（C）＞初始pH值（D）＞酵母接種量（B）。

2.2.2 響應面交互作用分析

響應面是對二元回歸方程中各影響因素立體三維的形象描繪，響應面的傾斜角度越大、等高線排列越密集，說明兩個因素之間的交互作用越顯著[22-23]。

由圖5可知，隨著初始糖度（A）、酵母接種量（B）和發(fā)酵溫度（C）之間交互變化時，感官評分呈現(xiàn)出相應的變化趨勢。此外，初始糖度和酵母接種量之間、初始糖度和發(fā)酵溫度以及發(fā)酵溫度和酵母接種量之間的響應面結果顯示有傾斜度，等高線排列較密集，說明每兩組參數(shù)之間的交互作用對感官評分有影響，而且交互作用大小排序為AC＞BC＞AB。這說明初始糖度和發(fā)酵溫度的交互作用對枸杞果酒的感官影響最為顯著，初始糖度和酵母接種量的交互作用對枸杞果酒的感官影響相對較弱

圖5 初始糖度、酵母接種量、發(fā)酵溫度交互作用對枸杞果酒感官評分影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between initial sugar content,yeast inoculum and fermentation temperature on sensory score of wolfberry fruit wine

2.3 發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化和驗證試驗

由Box-Behnken試驗設計結果可知，枸杞果酒發(fā)酵最佳工藝參數(shù)為初始糖度27.39°Bx，酵母接種量0.19%，發(fā)酵溫度22.47 ℃，初始pH值4.97。在此條件下，感官評分理論值為92.14分。根據(jù)響應面優(yōu)化結果，結合實際情況，將枸杞果酒發(fā)酵工藝調整為初始糖度27°Bx，酵母菌接種量0.20%，發(fā)酵溫度22 ℃，初始pH值5.0。根據(jù)各因素優(yōu)選結果進行3組平行驗證試驗，在此優(yōu)化條件下，釀造的枸杞果酒酒精度為（12.24±0.43）%vol，感官評分實際值為（91.80±0.63）分，與預測結果接近，說明該試驗回歸模型預測結果準確可靠。

2.4 枸杞果酒指標檢測結果

2.4.1 營養(yǎng)成分指標

枸杞果酒營養(yǎng)成分檢測結果見表5。由表5可知，還原糖含量為（1.31±0.14）g/100 mL，總糖為（2.27±0.16）g/100 mL，蛋白質為（0.62±0.04）g/100 mL，脂肪含量較低，僅為（0.10±0.01）g/100 mL。

表5 枸杞果酒營養(yǎng)成分Table 5 Nutritional ingredients of wolfberry fruit wine

2.4.2 功能成分指標

枸杞果酒功能成分檢測結果見表6。

表6 枸杞果酒功能成分Table 6 Functional ingredients of wolfberry fruit wine

由表6可知，該枸杞果酒含有豐富的功能成分，如總多酚、總黃酮、多糖和甜菜堿。其中多糖含量最高，可達到（7.17±0.01）mg/mL；總多酚含量為（1.88±0.06）mg GAE/mL；總黃酮含量為（1.63±0.03）mg RE/mL；甜菜堿含量為（2.55±0.04）mg/mL。此外，據(jù)先前文獻報道[24]，葡萄酒中的多糖含量范圍為0.282～1.600 mg/mL，與葡萄酒相比，該枸杞酒的多糖含量更高，是其4.5～25.4倍。這些活性功能成分具有抗自由基和抗氧化，提高機體免疫機能，促進機體健康等功效，這為枸杞果酒良好的保健功能和開發(fā)前景提供了數(shù)據(jù)支撐。

2.4.3 微生物指標

菌落總數(shù)≤50 CFU/mL，大腸菌群≤3 MPN/100 mL，致病菌：未檢出，各項微生物指標均符合相關國家標準[25]。

2.4.4 枸杞果酒中氨基酸含量

由表7可知，在枸杞果酒樣中共檢測到14種氨基酸，總含量高達（588.12±10.23）mg/100mL。其中6種必需氨基酸，即蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸，占總氨基酸含量的26.87%。與李沁婭等[26]測定的11種保健酒必需氨基酸種類6種、總氨基酸含量3.21～179.91mg/100 mL，唐柯等[27]測定的47款中國產(chǎn)地葡萄酒中氨基酸含量44.71～135.91 mg/100 mL，沈穎等[28]測定的不同發(fā)酵溫度下的荔枝酒氨基酸含量為34.10～41.21 mg/100 mL等相比，該枸杞果酒氨基酸含量更高。

表7 枸杞果酒中氨基酸種類及含量Table 7 Types and contents of amino acids in wolfberry fruit wine

3 結論

枸杞果酒最佳發(fā)酵工藝條件為初始糖度27°Bx、酵母菌接種量0.20%、發(fā)酵溫度22 ℃、初始pH值5.0。在此優(yōu)化條件下，枸杞果酒感官評分為91.80分，表現(xiàn)出均勻的橙紅色，酒香優(yōu)雅，酒體協(xié)調，具有枸杞典型風味。表明該模型擬合程度良好，能用此模型對枸杞果酒感官評分進行分析和預測。枸杞果酒的酒精度為12.24%vol，枸杞果酒中的營養(yǎng)成分中總糖、蛋白質、氨基酸的含量分別為（2.27±0.16）g/100 mL、（0.62±0.04）g/100 mL、（588.12±10.23）mg/100 mL；功能成分中總多酚、總黃酮、多糖和甜菜堿的含量分別為（1.88±0.06）mgGAE/mL、（1.63±0.03）mgRE/mL、（7.17±0.01）mg/mL和（2.55±0.04）mg/mL。本試驗優(yōu)化的枸杞果酒發(fā)酵工藝參數(shù)具有一定的實用價值，既能保留果酒風味，又能提高功能成分含量，可為枸杞果酒的進一步研究提供理論依據(jù)。