高志壕

四川省巴中市中醫(yī)院檢驗科 636600

胰島素瘤是最常見的功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasia,pNEN)，起源于胰島β細胞，表現(xiàn)為大量胰島素陣發(fā)性分泌導致低血糖反復發(fā)作，根據(jù)典型whipple三聯(lián)征(反復發(fā)作的低血糖癥狀、發(fā)作時血糖<2.8mmol/L、供糖后癥狀迅速緩解)聯(lián)合激素水平測定診斷并不難。但胰島素瘤患者常伴發(fā)精神失常、癲癇發(fā)作、意識障礙等中樞神經(jīng)精神癥狀甚至以此為首發(fā)、主要表現(xiàn)，此種患者不僅極易誤診為癲癇、癔癥、腦血管病等其他疾病[1]，長期的高胰島素、低血糖狀態(tài)還會導致智力低下甚至不可逆癡呆[2]，嚴重影響生活質(zhì)量。目前胰島素瘤的主流治療手段是外科手術，大部分胰島素瘤都是良性腫瘤，但其幾乎都有惡變潛能，故而早期發(fā)現(xiàn)、治療是非常重要的。胰島素瘤的病因及發(fā)病機制仍不清楚，推測可能是一個復雜多基因疾病。近年來隨著基因芯片及高通量測序等現(xiàn)代生物技術的蓬勃發(fā)展，利用生物信息學分析大數(shù)據(jù)可以從理論上初步揭示許多腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機制。本研究選擇GEO數(shù)據(jù)庫中的胰島素瘤相關基因表達譜芯片數(shù)據(jù)集，依托生物信息學探討胰島素瘤分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源 以“insulinoma”為關鍵詞，物種限定為“homo sapiens”,研究類型選擇“expression profiling by array”，在基因表達綜合數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫檢索，得到由Anguraj Sadanandam等在2016年1月更新的數(shù)據(jù)集GSE73338。該數(shù)據(jù)集來源于英國倫敦癌癥研究所，采用18.5K human oligo microarrays obtained from the Ohio State University Cancer Center平臺，內(nèi)含97個數(shù)據(jù)樣本，其中17個胰島素瘤組織、4個正常胰島組織、63個非功能性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織、5個正常胰腺組織、7個已轉移的胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織、1個未明確分類的功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤組織，剔除非功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等組別資料，僅分析17例胰島素瘤及4例正常胰島對照組織數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)集共包含15 961個基因的表達數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達基因的篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫自帶數(shù)據(jù)分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)比較胰島素瘤患者組與正常胰島組織基因表達，下載原始數(shù)據(jù)后按照adj.P.value<0.01 且差異倍數(shù)(Fold change,FC)≥4的標準篩選差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs)，并繪制火山圖分析差異基因分布。

1.3 基因本體論與信號通路分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對DEGs進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(FDR<0.05,P值<0.05認為有統(tǒng)計學意義)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡分析、Hub基因篩選 利用基因、蛋白質(zhì)相互作用關系String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫在線分析DEGs的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)。借助Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網(wǎng)絡圖，通過CytoHubba插件的MNC算法獲取得分最高的前10個基因(Hub基因)。

2 結果

2.1 DEGs的篩選結果 本研究選擇基因轉錄譜芯片GSE73338，以校正后Padj<0.01,|log2FC|≥2為篩選標準篩選出胰島素瘤相關DEGs共319個，其中包括140個上調(diào)基因和179個下調(diào)基因。然后以logFC為橫坐標，以校正后P值的負對數(shù)-log10(adj.P.Val)為縱坐標，對DEGs進行可視化，得到火山圖(圖1)。

圖1 胰島素瘤DEGs的火山圖

2.2 GO、KEGG分析 GO分析結果顯示，DEGs在生物過程中主要涉及炎癥反應、細胞對TNF/IL1反應、細胞增殖負調(diào)控、中性粒細胞趨化正調(diào)控、細胞遷移的正調(diào)控，分子功能主要涉及蛋白質(zhì)結合，細胞組成主要在細胞表面和細胞外隙。KEGG通路富集分析結果顯示，DEGs主要涉及TNF信號通路、細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路、類風濕關節(jié)炎、非洲錐蟲病和瘧疾。見表1。

2.3 PPI分析、Hub基因結果 DEGs編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡圖中(已排除其中孤立的蛋白質(zhì)，“可信度”為0.4)，共包含節(jié)點蛋白 314個，邊 741條(圖2)。

圖2 DEGs的PPI網(wǎng)絡圖

表1 胰島素瘤中DEGs的GO分析和KEGG分析

依據(jù)MNC算法得分前10位基因為白介素-6(Interleukin 6,IL6)、CXC趨化因子配體8(Cysteine X chemokine ligand 8,CXCL8)、白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL1β)、β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta A4 protein, APP)、單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)、CD44(Cluster of differentiation 44)、巨噬細胞炎性蛋白-3α[chemokine (C-C motif )ligand 20,CCL20]、CXC趨化因子配體2(Cysteine X chemokine ligand 2,CXCL2)、細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM1)、血管內(nèi)皮細胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM1),見圖3。

圖3 MNC算法中排名前10名的基因

3 討論

pNEN是源于胰腺多能神經(jīng)內(nèi)分泌干細胞的一類腫瘤，依據(jù)激素分泌及相關臨床癥狀出現(xiàn)與否，pNEN可分為功能性和無功能性胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(Functional pNEN,F-pNEN；Non-functional pNEN,NF-pNEN)，其中大部分pNEN是NF-pNEN。目前關于pENE的發(fā)病機制研究多集中于NF-pNEN,而F-pNEN有著其獨特的遺傳機制。一項對胰島素瘤患者進行全外顯子測序的研究發(fā)現(xiàn)胰島素瘤常出現(xiàn)正?？截悢?shù)變異(Copy number variation, CNV)和擴增CNV，而CNV正常的胰島素瘤表現(xiàn)出較高的轉錄因子YY1(Yin-Yang1,YY1)基因突變率[3]。目前胰島素瘤的病因目前仍不清楚，本研究通過挖掘胰島素瘤患者胰島組織基因芯片數(shù)據(jù)，有助于胰島素瘤發(fā)病機制研究。

本研究通過GEO2R對GSE73338數(shù)據(jù)集進行數(shù)據(jù)挖掘，篩選出319個DEGs,包括140個上調(diào)基因和179下調(diào)基因。GO分析提示DEGs主要分布在細胞表面、外隙中，在蛋白質(zhì)結合、炎癥反應、細胞對TNF/IL1反應等生物過程中顯著富集。KEGG分析顯示DEGs主要參與TNF信號通路、細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路等相關信號通路。接著構建了DEGs編碼蛋白間的PPI網(wǎng)絡圖并利用Cytoscape軟件cytohubba插件篩選出10個Hub基因，包括IL6、CXCL8、IL1β、APP、CCL2、CD44、CCL20、CXCL2、ICAM1、VCAM1，但這些基因在胰島素瘤的發(fā)生發(fā)展機制中的作用尚未研究。

慢性炎癥與許多腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關，這主要是因為腫瘤微環(huán)境的形成。腫瘤微環(huán)境由單核細胞等炎癥細胞、多種細胞因子(趨化因子、黏附因子、炎癥因子等)和細胞外基質(zhì)等元素組成，其在瘤細胞形成、腫瘤浸潤與轉移、耐藥性誘導等諸方面發(fā)揮重要作用[4]。作為介導炎癥反應的重要成員，細胞因子(Cytokine,CK)在免疫調(diào)節(jié)、炎癥應答、細胞增殖生長、腫瘤演進等生理或病理進程中發(fā)揮著舉重若輕的作用。CK是由多種細胞(主要是單核、巨噬細胞、T細胞等免疫細胞)經(jīng)絲裂原等刺激后分泌的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱，從其發(fā)揮的生物學功能角度，CK可分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子等等。其中的趨化因子根據(jù)結構的不同又可以分為C、CC、CXC和CX3C四個亞族。白細胞介素-1β/6/8 (IL1β/6/8)在其中是比較重要的促炎細胞因子。IL1β是白介素-1家族中的一員，主要是由單核細胞產(chǎn)生，在大多數(shù)腫瘤(乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤、肺癌等)中表達上調(diào)，通過激活MAPK和NF-KB信號轉導通路發(fā)揮促炎、促腫瘤生長和轉移等功能[5]。IL6可由IL1β和腫瘤壞死因子激活，它不僅是TNF信號通路的參與者，同時也在JAK/STAT和MAPK通路活化中起到關鍵作用，而IL6/STAT3通路對胰腺疾病進展具有調(diào)控作用[6]。CXCL8是腫瘤微環(huán)境內(nèi)的顯著調(diào)節(jié)因子，常常被稱為IL8，不僅可以直接作用腫瘤細胞使其增生，同時還參與腫瘤血管生成、阻滯細胞凋亡、促細胞間及細胞和基質(zhì)間黏附等促進腫瘤發(fā)生發(fā)展甚至轉移[7]。研究發(fā)現(xiàn)CXCL8在結直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等腫瘤中高表達，同時還能預示胰腺癌患者預后[8]。簡而言之，IL1β、IL6/8在腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織，這與腫瘤的分期和浸潤轉移程度相關。而CCL2和CCL20都是趨化因子CC亞族中的成員，其中CCL2通過結合CC類趨化因子受體2募集單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞，從而參與炎癥和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明CCL2在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達，且與腫瘤分級、轉移及浸潤程度密切相關[9]。CCL20，它是通過結合細胞表面的CCR6發(fā)揮信號傳導作用。Rubie C等檢測慢性胰腺炎、胰腺囊腺瘤、胰腺癌組織中CCL20的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)CCL20在胰腺癌中顯著高表達[10]。本研究中發(fā)現(xiàn)在胰島素瘤組織中IL1β、IL6/8、CCL2和CCL20表達水平顯著下調(diào)，這可能是因為納入的標本幾乎都是良性胰島素瘤組織。

APP是一種具有多種生物學功能的跨膜蛋白，除了因酶活性障礙導致β-淀粉樣蛋白在大腦中過度沉積促使阿爾茲海默癥的發(fā)生，研究證明它也能介導細胞間或細胞與基質(zhì)間的粘連作用。已有研究發(fā)現(xiàn)APP在胰腺癌細胞及其細胞上清中高表達[11]。ICAM1和VCAM1都是比較重要的細胞黏附因子，隸屬于免疫球蛋白超家族的成員，可以通過介導腫瘤細胞與細胞外基質(zhì)的黏附促進腫瘤細胞侵襲和轉移。正常情況下在血管內(nèi)皮表達量很低，而在腫瘤細胞中呈現(xiàn)高表達[12-13]。CD44有標準型CD44s和變異型CD44v兩種形式，前者主要在造血細胞、基質(zhì)細胞中表達，后者在上皮和腫瘤細胞中表達。CD44通過與透明質(zhì)酸結合促進細胞間及細胞與基質(zhì)黏附，研究表明CD44與腫瘤發(fā)生、侵襲及轉移密切相關[14]。CD44、APP、ICAM1和VCAM1基因均參與細胞間或細胞與基質(zhì)間的黏附過程，但其可能在胰島素瘤發(fā)生發(fā)展甚至惡變進程中發(fā)揮重要的作用，具體作用機制還需進一步驗證。

查閱PubMed等相關數(shù)據(jù)庫，截至2021年1月12日，對GSE73338基因芯片進行數(shù)據(jù)挖掘的文獻有2篇，1篇來自中山大學第一附屬醫(yī)院團隊[15]，他們分別對WHO不同分級的pNEN、良惡性的pNEN、轉移與否的pNEN和伴隨MEN1基因突變與否的pNEN進行了生物信息學分析，主要是探討pNEN的分期分級、侵襲和轉移背后的分子機制。另一篇則來自湖北省十堰市太和醫(yī)院[16]，他們對GSE7338中17個胰島素瘤和8個胰腺組織進行了差異基因篩選、GO、KEGG分析、Hub基因篩選，共獲得了1 632個DEGs(1 117個上調(diào)、514個下調(diào))，分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)DEGs與胰島素分泌密切相關，下調(diào)差異基因富集于胰腺分泌，同時發(fā)現(xiàn)7個Hub基因，分別是：GCG、GCGR、PLCB1、 CaSR、 F2R 、GRM1和GRM5。該研究所得差異基因數(shù)量眾多，富集分析，Hub基因篩選和本研究結果不一致，主要是因為它納入的8個胰腺組織包含本研究的3個正常胰島對照，對照不同，研究結果自然有差異。本研究可與之互為補充，從而更好地理解胰島素瘤的發(fā)生機制。

綜上，本研究通過生物信息學對GEO數(shù)據(jù)庫中胰島素瘤相關基因數(shù)據(jù)集進行挖掘，篩選出319個DEGs并對它們進行GO、KEGG和PPI分析，最終篩選出10個核心基因，但要想明確它們在胰島素瘤發(fā)病機制中的作用還需要臨床資料結合免疫組化等實驗的進一步驗證。