肖熙鷗 林文秋 陳卓 鄒春香 金輝 鄒華芬

摘? 要：利用標記基因追蹤病原菌在植物體內(nèi)的入侵和定殖，是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用電轉(zhuǎn)化法將廣宿主載體pBBR1MCS2-Tac-EGFP導入青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000菌株中，獲得了青枯雷爾氏菌帶綠色熒光標記的轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)接試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子的抗生素抗性和綠色熒光強度有良好的遺傳穩(wěn)定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000菌株的致病力，且EGFP蛋白能夠在植物中穩(wěn)定表達。灌根法接種試驗結(jié)果表明，病原菌在第1天即完成對根系的侵染，并在第6天擴散至其他組織，隨后造成植株萎蔫。研究結(jié)果表明所獲轉(zhuǎn)化子可用于后續(xù)的病原菌侵染機理等方面的研究。

關(guān)鍵詞：青枯雷爾氏菌;綠色熒光標記;侵染動態(tài);pBBR1MCS2-Tac-EGFP載體

中圖分類號：S432.4????? 文獻標識碼：A

Wide-host Vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP Suitable for the Labeling of Ralstonia solanacearum

XIAO Xiou1，2，3， LIN Wenqiu1，2， CHEN Zhuo1， ZOU Chunxiang4， JIN Hui1，2*， ZOU huafen1

1. South Subtropical Crop Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. Key Laboratory of Tropical Fruit Biology of Ministry of Agriculture & Rural Affairs， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. College of Agronomy， Gansu Agricultural University， Lanzhou， Gansu 730070， China; 4. Guagnzhou Landscape Architecture Company， Guangzhou， Guangdong 510180， China

Abstract： It is an important method to trace the invasion and colonization of pathogens in plants by marker genes. In the present study， the wide-host vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP was transformed into the Ralstonia solanacearum GMI1000 strains by electroporation. Then the GFP expression and the GMI1000 pathogenicity were analyzed. The GMI1000-Tac-EGFP strains emitted GFP fluorescence under the 440 nm excitation light. After the susceptible eggplant was inoculated by wild type GMI1000 and GMI1000-Tac-EGFP， there was no difference between the GMI1000 and the GMI1000-Tac-EGFP in the disease index. The result suggested that GMI1000-Tac-EGFP didnt influence the pathogenicity of GMI1000. After inoculating eggplants and potatoes by GMI1000-Tac-EGFP， the eggplant root， potato root and potato stem emitted GFP fluorescence under the 440 nm excitation light. The result suggested that GMI1000-Tac-EGFP could express EGFP in the eggplant and potato. To monitor the moment of R. solanacearum cells in potato， potato was inoculated with GMI1000-Tac-EGFP. The result showed that GMI1000-Tac-EGFP invaded the root 1 d after inoculation， spreaded to the stem 6 d after inoculation. In conclusion， the wide-host vector pBBR1MCS2-Tac-EGFP is suitable for the labeling of R. solanacearum and an important tool to trace the invasion and colonization of R. solanacearum strains in plants.

Keywords： Ralstonia solanacearum; GFP marker; infection dynamic; pBBR1MCS2-Tac-EGFP vector

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.027

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）寄主范圍廣泛，能夠引起200多種植物感染青枯病[1]。青枯病是茄子和馬鈴薯等茄科作物生產(chǎn)中主要的病害之一，該病害能造成嚴重的損失，甚至可以導致絕收。在我國，除西藏、黑龍江和內(nèi)蒙古外，其余省份均有青枯菌的報道，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)，青枯病危害更為嚴重[2]。到目前為止，尚無有效的方法對其進行防控。而研究青枯菌的致病機理對防控青枯病具有重要意義。利用標記基因追蹤病原菌在植物體內(nèi)的入侵、定殖等侵染途徑，是研究病原菌致病機理的有效手段和方法[3-7]。目前在R. solanacearum中使用的標記基因有GFP[8-10]、LUX[9， 12]和GUS[13]等。標記基因在R. solanacearum中的表達主要有2種方式，一種是利用Tn5轉(zhuǎn)座子將外源基因定點插入到R. solanacearum的染色體中[14]，該方法插入的外源基因能穩(wěn)定存在于R. solanacearum染色體中，不會由于環(huán)境條件的影響而丟失，但是該方法操作較為繁瑣，且可能由于片段的插入導致R. solanacearum的基因功能喪失。Monteiro等[10]根據(jù)R. solanacearum演化型I和演化型II染色體序列特點，設(shè)計了特異引物開發(fā)了pRC系列載體，將標記基因定點插入到染色體中的假基因區(qū)域，直觀地研究了R. solanacearum在馬鈴薯、番茄中的浸染途徑。第二種方法是將含有標記基因的廣宿主質(zhì)粒轉(zhuǎn)化R. solanacearum，以游離質(zhì)粒表達標記基因，該方法操作簡單且不會由于定點插入導致R. solanacearum的基因功能喪失[11]。但是目前報道適宜R. solanacearum的載體較少。

本研究將廣宿主載體pBBR1MCS2-Tac- EGFP通過電轉(zhuǎn)化法將其導入R. solanacearum中，分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在R. solanacearum中的穩(wěn)定性以及R. solanacearum的致病力，研究結(jié)果將為進一步研究R. solanacearum在植物體內(nèi)的入侵、定殖提供適宜的標記載體工具。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

R. solanacearum菌株GMI10000（間接來源于已故法國農(nóng)科院的Philippe Prior研究員的實驗室）。廣寄主載體pBBR1MCS2-Tac-EGFP由本實驗保存，該質(zhì)粒在工程菌中具有卡拉霉素（kan）抗性，由Tac啟動子驅(qū)動EGFP的表達（圖1）。

1.2? pBBR1MCS2-Tac-EGFP電擊轉(zhuǎn)化及檢測

利用電轉(zhuǎn)化方法將pBBR1MCS2-Tac-EGFP轉(zhuǎn)化R. solanacearum GMI1000菌株。GMI1000感受態(tài)的制備和電轉(zhuǎn)化方法參考張治飛[13]的方法。電擊轉(zhuǎn)化后取100 μL的菌液涂布于含有50 mg/L卡拉霉素的NA固體培養(yǎng)基上（葡萄糖5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏3 g/L，瓊脂粉7 g/L），30 ℃培養(yǎng)48 h。

利用LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源在440 nm激發(fā)光下檢測轉(zhuǎn)化子EGFP的表達。根據(jù)EGFP最大開放閱讀框抗性基因設(shè)計引物（EGFPF：ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTT TC，EGFPR：TTATTTGTAGAGCTCA TCCATGC C）并且委托廣州天一輝遠基因科技有限公司進行合成。PCR體系為：2×PCR Mix（康為世紀）12.5 μL，EGFPF（10 μmol/L）1 μL，EGFPR（10 μmol/L）1 μL，無菌水9.5 μL，菌液1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán);72 ℃ 5 min，PCR產(chǎn)物電泳檢測。將陽性克隆命名為GMI1000-Tac-EGFP。

1.3? 遺傳穩(wěn)定性評價

將GMI1000-Tac-EGFP轉(zhuǎn)接至不含卡拉霉素的NA培養(yǎng)基上，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)20次，分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000的遺傳穩(wěn)定性。在第2次、第10次和第20次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)時，將GMI1000-Tac-EGFP從平板上用無菌水沖洗，懸浮至OD600=0.8左右，然后利用Tecan Spark測定熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長為535 nm，其中Gain值設(shè)定為80。

1.4? 熒光強度測定

將GMI1000-Tac-EGFP轉(zhuǎn)接至NA液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng)至OD600=0.8左右，6 000 r/min離心10 min，收集菌液，用無菌水進行重懸浮至OD600=1.0。然后用無菌水進行4倍梯度稀釋。利用Tecan Spark測定熒光強度，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長為535 nm，其中Gain值設(shè)定為80。使用Excel軟件進行線性回歸分析。

將苗齡為20 d左右的‘隴薯7號組培苗移栽于7 cm × 7 cm的營養(yǎng)缽中，25～28 ℃培養(yǎng)20 d左右后用于人工接種GMI1000-Tac-EGFP。在接種后7 d，取馬鈴薯莖基上1 cm莖段用于R. solanacearum數(shù)量分析。將莖段在75%酒精消毒后置于0.2 mL的無菌水中浸泡1 h。取200 μL測定熒光強度，分析R. solanacearum的克隆數(shù)。同時取500 μL利用平板稀釋法統(tǒng)計菌落數(shù)，具體方法參考郜剛[15]的方法。3次生物學重復(fù)。

1.5? 致病力分析

將苗齡為20 d左右的‘隴薯7號組培苗移栽于7 cm × 7 cm的營養(yǎng)缽中，25～28 ℃培養(yǎng)20 d左右后用于人工接種。將GMI1000-Tac-EGFP和野生型GMI1000用無菌水稀釋至1×108 CFU/mL，進行傷根接種，每株接種20 mL菌液。同時以無菌水為對照。每次處理10株，3次生物學重復(fù)。接種后置于培養(yǎng)箱，28～30 ℃光照培養(yǎng)，統(tǒng)計萎蔫癥狀出現(xiàn)的時間。

1.6? 利用GMI1000-Tac-EGFP分析R. solanacearum動態(tài)侵染過程

馬鈴薯‘隴薯7號組培苗培養(yǎng)20 d后進行接種。接種后置于培養(yǎng)箱，28～30 ℃光照培養(yǎng)。在接種后每24 h利用LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源在440 nm激發(fā)下檢測EGFP表達，并且拍照記錄。

2? 結(jié)果與分析

2.1? pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉(zhuǎn)入GMI1000

本研究通過電轉(zhuǎn)化法成功地將pBBR1MCS2- Tac-EGFP轉(zhuǎn)入到GMI1000中。通過PCR在GMI1000-Tac-EGFP中擴增出750 bp左右的片段，與預(yù)期大小一致，而GMI1000中未擴增出相應(yīng)片段（圖2）。同時在LUYOR-3415RG雙波長熒光蛋白激發(fā)光源的藍光下，GMI1000-Tac-EGFP能夠發(fā)出綠色熒光，而野生型GMI1000未發(fā)出熒光（圖3）。研究結(jié)果證明pBBR1MCS2-Tac-EGFP成功轉(zhuǎn)入到GMI1000中，并且能夠在GMI1000中表達EGFP蛋白。

2.2? GMI1000-Tac-EGFP穩(wěn)定表達EGFP熒光

為進一步分析pBBR1MCS2-Tac-EGFP在GMI1000中的遺傳穩(wěn)定性，將不同移植時間的菌液涂布于平板上，培養(yǎng)觀察綠色熒光的表達情況，發(fā)現(xiàn)在移殖培養(yǎng)2次、10次和20次后，其熒光強度之間差異不顯著（圖4）。結(jié)果表明，pBBR1MCS2- Tac-EGFP載體能夠在GMI1000中穩(wěn)定遺傳。

2.3? EGFP熒光值與GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量線性相關(guān)

與平板稀釋法相比，利用EGFP熒光定量分析細菌的克隆數(shù)具有高效快捷的優(yōu)點。圖5結(jié)果表明，在4.0×106～1.0×109 CFU/mL的范圍內(nèi)，EGFP的熒光強度值與GMI1000-Tac-EGFP的數(shù) 量呈線性相關(guān)關(guān)系，R2為0.9954。當GMI1000- Tac-EGFP稀釋至約9.0×105 CFU/mL時，EGFP熒光值接近于無菌水的熒光值，此時EGFP的熒光強度較弱，未能進行有效檢測。因此在4.0×106～1.0×109 CFU/mL范圍內(nèi)，可以利用EGFP熒光值計算R. solanancearum的數(shù)量。

根據(jù)EGFP熒光值與GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量的線性關(guān)系，統(tǒng)計得到GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量為9.75×108 CFU/g，而平板計數(shù)法統(tǒng)計得到的數(shù)量為8.95×108 CFU/g（圖6）。雖然利用EGFP熒光值估算的GMI1000-Tac-EGFP數(shù)量大于平板計數(shù)法統(tǒng)計得到的數(shù)量，但是二者差異不顯著。因此可以利用EGFP熒光值計算R. solanancearum的數(shù)量。

2.4? pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000致病力

通過致病力試驗，發(fā)現(xiàn)GMI1000-Tac-EGFP和GMI1000接種馬鈴薯6 d后，葉片開始出現(xiàn)萎蔫狀（圖7），而無菌水對照葉片正常。結(jié)果表明，pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影響GMI1000的致病力。

2.5? R. solanacearum侵染馬鈴薯動態(tài)變化過程

通過GFP熒光能夠動態(tài)直觀地觀察R. so

lanacearum在馬鈴薯中的動態(tài)變化過程（圖8A）?！]薯7號接種1 d后，在其根部能觀察到微弱的熒光，證明在接種1 d后，R. solanacearum已經(jīng)進入到馬鈴薯根部（圖8B）。隨著培養(yǎng)時間的增加，GFP熒光強度越來越強，并且分布的部位也越來越廣，R. solanacearum在馬鈴薯植株內(nèi)不斷繁殖和擴散。接種后第4天，在馬鈴薯的莖部檢測到GFP熒光，表明R. solanacearum已經(jīng)進入到馬鈴薯莖部;接種后6 d整個莖均有GFP的分布，接種后7 d，葉片的葉脈也有GFP熒光，此時R. solanacearum在整個植株內(nèi)均有分布。在接種后5 d馬鈴薯的部分葉片出現(xiàn)萎蔫癥狀，接種后7 d整個植株萎蔫。這是由于R. solanacearum在馬鈴薯的維管束中大量積累，堵塞導管水分的運輸，最終導致馬鈴薯萎蔫。

3? 討論

利用標記基因標記病原菌是動態(tài)分析病原菌侵染植物過程的重要手段。由于GFP的發(fā)光不需要底物，能夠無損地觀察病原菌侵染植株的動態(tài)變化過程，因此在多種病原菌上得到了廣泛應(yīng)用[16-19]。目前成功標記R. solanacearum的載體有pUT gfp/luxAB載體[8]、pRC系列載體[10]、pBBR1MCS-5[11]、pH7C-PpsbA載體[13]和?RSS1載體[20]等。

本研究利用電轉(zhuǎn)化法成功將pBBR1MCS2- Tac-EGFP廣寄主載體導入R. solanacearum GMI1000菌株中，并且GMI1000-Tac-EGFP能夠在馬鈴薯中穩(wěn)定表達。趙志文等[11]以pBBR1MCS-5載體為骨架構(gòu)建了pBBR1MCS5- pRipAK-GFP載體，將其轉(zhuǎn)化R. solanacearum、番茄細菌性斑點病菌和柑橘潰瘍病菌，結(jié)果表明該載體能夠在這3種病原菌中穩(wěn)定表達。同時在熒光顯微鏡下，GMI1000-Tac-EGFP整個細胞呈現(xiàn)綠色，棒狀，近橢圓形[9， 11]。標記基因是否影響病原菌對植物的致病力是標記基因能否應(yīng)用于病原菌的首要條件之一。而由于馬鈴薯組培苗較為幼嫩，在植株的根和莖稈均能檢測到強烈GFP熒光。因此以pBBR1MCS為骨架載體適宜標記R. solanacearum。

啟動子對下游基因的表達起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。目前利用在R. solanacearum上使用的標記基因主要為R. solanacearum內(nèi)源啟動子，如RipAK、hrpG、hrpB、Exopolysaccharid等基因的啟動

子[10-11， 21]，植物葉綠體PsbA啟動子[9]以及細菌的lac啟動子[11]。這些啟動子均能驅(qū)動標記基因的高效表達，而其他外源啟動子驅(qū)動標記基因在R. solanacearum中的表達尚未見報道。Tac啟動

子是一個由lac和trp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，在大腸桿菌中有高效的表達效率。在本研究中，GMI1000-Tac-EGFP在培養(yǎng)基上和植物體內(nèi)均能發(fā)出顯著的GFP熒光，證明Tac在R. solanacearum中也有較強的啟動活性，可以用于驅(qū)動外源基因在R. solanacearum的表達。而這些啟動子的表達效率的比較尚未見報道。在魚腥藻中，PsbA啟動子驅(qū)動效率與Tac啟動子無明顯差異[22]，但是在R. solanacearum中的表達效率是否有差異有待進一步的研究。

利用GFP標記R. solanacearum在植物病原菌互作中得到了應(yīng)用。首先是分析R. solanacearum在浸染植物的過程。在自然條件下R. solanacearum通過傷口等侵染植株，然后通過木質(zhì)部向地上部分運輸，并且在導管中大量繁殖，最終導致植物萎蔫[4， 12， 21]。R. solanacearum大量粘附在其根系表面，并在皮層形成浸染點，或者通過根尖、側(cè)根和根部傷口侵入植株根部（接種后1 d）;然后迅速進入根部維管束組織（接種后2～3 d），并向上浸染，進入莖部維管束組織和葉片（接種后4～5 d），導致馬鈴薯導管堵塞，最終導致表現(xiàn)出萎蔫（接種后6～7 d）[5， 13， 22-23]。本研究中，‘隴薯7號接種1 d后，在其根部能觀察到微弱的熒光，在接種后第4天馬鈴薯的莖部檢測到GFP熒光，第7天時葉片的葉脈也有GFP熒光，這與前人的研究結(jié)果基本一致[5， 13， 22-23]。其次是利用GFP熒光值分析病原菌的細胞數(shù)量。與傳統(tǒng)的平板稀釋法[23]、QPCR定量法[24]相比，該方法具有簡單、快捷、時間短和成本低等優(yōu)勢。本研究中，在4.0×106～1.0×109 CFU/mL范圍內(nèi)，EGFP的熒光強度值與GMI1000-Tac-EGFP的數(shù)量呈線性相關(guān)關(guān)系，并且熒光強度計數(shù)法與平板稀釋法二者計算的R. solanacearum克隆數(shù)之間差異不顯著，因此可以利用EGFP熒光值分析R. solanacearum的細胞數(shù)量。

參考文獻

[696]?? Allen C， Prior P， Hayward A C. Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex[M]. American Phytopathological Society Press， St. Paul， MN， U.S.A.， 2005.

[697]?? Jiang G F， Wei Z， Xu J， et al. Bacterial wilt in China： History， current status， and future perspectives[J]. Frontiers in Plant Science， 2017， 8： 1549.

[698]?? Nakazawa-NasuY， Kitanosono S， Suzuki K， et al. A new method for the selection of tomato plants resistant to bacterial wilt using bioluminescence from lux-marked Ralstonia solanacearum[J]. Japanese Journal of Phytopathology， 1999， 65（4）： 470-474.

[699]?? Hikichi Y， Nakazawa-Nasu Y， Kitanosono S， et al. The behavior of lux-marked Ralstonia solanacearum in grafted tomato cultivars resistant or susceptible to bacterial wilt[J]. Japanese Journal of Phytopathology， 1999， 65（6）： 597-603.

[700]?? CruZ Z A P， Ferreira V， Pianzzola M J， et al. A novel， sensitive method to evaluate potato germplasm for bacterial wilt resistance using a luminescent Ralstonia solanacearum reporter strain[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2014， 27（3）： 277-285.

[701]?? Wang H J， Hu J X， Lu Y， et al. A quick and efficient hydroponic potato infection method for evaluating potato resistance and Ralstonia solanacearum virulence[J]. Plant Methods， 2019， 15： 145.

[702]?? Planas-Marquès M， Kressin J P， Kashyap A， et al. Four bottlenecks restrict colonization and invasion by the pathogen Ralstonia solanacearum in resistant tomato[J]. Journal of Experimental Botany， 2019， 71（6）： 2157-2171

[703]?? Kawasaki T， Satsuma H， Fujie M， et al. Monitoring of phytopathogenic Ralstonia solanacearum cells using green fluorescent protein-expressing plasmid derived from bacteriophage RSS1[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering， 2007， 104（6）： 451-456.

[704]?? 車建美， 藍江林， 劉? 波. 轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因的青枯雷爾氏菌生物學特性[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學， 2008（11）： 3626-3635.

[705]?? Monteiro F， Solé M， van DI， et al. A chromosomal insertion toolbox for promoter probing， mutant complementation， and pathogenicity studies in Ralstonia solanacearum[J]. Molecular Plant-microbe Interactions， 2012， 25（4）： 557-568.

[706]?? 趙志文， 李艷嬌， 戶? 勛， 等. 用于植物病原細菌標記的pBB-GFP載體構(gòu)建及應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報， 2018， 34（3）： 136-141.

[707]?? Monteiro F， Genin S， van Dijk I， et al. A luminescent reporter evidences active expression of Ralstonia solanacearum type III secretion system genes throughout plant infection[J]. Microbiology， 2012， 158（Pt_8）： 2107-2116.

[708]?? 張治飛. 青枯菌的基因標記及馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)信號途徑探究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2016.

[709]?? Boucher C A， Barberis P A， Trigalet E P， et al. Transposon mutagenesis of Pseudomonas solanacearum： Isolation of Tn5-induced avirulent mutants[J]. Journal of General Microbiology， 1989， 131（9）： 2449-2457.

[710]?? 郜? 剛. 青枯菌誘導的馬鈴薯防衛(wèi)相關(guān)基因克隆與表達[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院， 2008.

[711]?? 王? 麗. 中國馬鈴著青巧茵致病力和遺傳多樣性研究[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學， 2016.

[712]? 賈娜娜， 翟立峰， 白? 晴， 等. 腐爛病菌的GFP標記及其在梨葉片組織中的侵染和擴展觀察[J]. 果樹學報， 2015， 32（6）： 1195-1200， 1316-1317.

[713]?? 劉曉妹， 楊永利， 張? 賀， 等. GFP標記杧果露水斑病病原菌及其侵染部位的確定[J]. 熱帶作物學報， 2018， 39（11）： 2235-2240.

[714]?? 胡? 展， 雷? 平， 郭照輝， 等. 生防放線菌Ahn75的熒光標記及其在水稻中的定殖[J]. 微生物學通報， 2019， 46（10）： 2612-2619.

[715]?? Wang K R， Kang L， Anand A， et al. Monitoring in planta bacterial infection at both cellular and whole‐plant levels using the green fluorescent protein variant GFPuv[J]. New Phytologist， 2007， 174（1）： 212-223.

[716]?? Didier A， Belen B， Christian B， et al. A bacterial sensor of plant cell contact controls the transcriptional induction of Ralstonia solanacearum pathogenicity genes[J]. The EMBO Journal， 2000， 19（10）： 2304-2314.

[717]?? 寧文艷， 吳先敏， 王春梅， 等. 啟動子Ptac與PsbA在魚腥藻7120中表達hG-CSF的效率比較[J]. 微生物學雜志， 2014， 34（3）： 36-41.

[718]?? Fujie M， Takamoto H， Kawasaki T， et al. Monitoring growth and movement of Ralstonia solanacearum cells harboring plasmid pRSS12 derived from bacteriophage phiRSS1[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering， 2010， 109（2）： 153-158.

[719]?? 王? 帥， 徐? 進， 許景升， 等. PMA-qPCR定量檢測青枯菌活菌方法的建立[J]. 植物保護， 2018， 44（6）： 122-128， 135.

責任編輯：謝龍蓮