楊運良 李建勛 馬革農(nóng)

摘? 要：采用Illumina Novaseq 6000測序技術(shù)對火龍果果肉3個時期（幼果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期）的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，對獲得的Unigene進行7大數(shù)據(jù)庫注釋，共有3617個Unigene成功注釋在所有數(shù)據(jù)庫中，進一步篩選與淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)的5個酶基因并進行實時熒光定量PCR（qPCR）基因表達驗證。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)錄組測序共得到115 193條轉(zhuǎn)錄本和47 855條Unigene，N50為2000。GO功能富集分析結(jié)果表明，18 582個Unigene在GO功能注釋中被分為生物過程、細胞組成及分子功能3大類。KOG功能分類結(jié)果表明，6203個Unigene在KOG注釋中被分為25個組，其中翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶包含的Unigene最多，共854個。KEGG代謝通路注釋結(jié)果表明，6554個Unigene獲得功能注釋，共有119條代謝途徑，其中碳水化合物代謝所占比例最高。篩選出UGP2、glgC、glgA、Cluster-12747.5831、Cluster-12747.16617等5個參與淀粉和蔗糖代謝合成途徑的關(guān)鍵酶基因，qPCR檢測表達水平與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

關(guān)鍵詞：火龍果;果肉;轉(zhuǎn)錄組測序;淀粉;蔗糖

中圖分類號：S667.9????? 文獻標識碼：A

Differential Expression Analysis of Genes Related to Starch and Sucrose Metabolism Pathway in Different Developmental Stages of Dragon Fruit Pulp Based on Transcriptome

YANG Yunliang， LI Jianxun*， MA Genong

Cotton Research Institute， Shanxi Agricultural University， Yuncheng， Shanxi 044000， China

Abstract： In this study， Illumina Novaseq 6000 sequencing was used to sequence the samples from three stages of dragon fruit pulp （young fruit stage， color conversion stage and mature stage）. The unigenes obtained was annotated in seven databases. A total of 3617 unigenes were successfully annotated in all databases. Five enzyme genes related to starch and sucrose metabolism pathway were further screened and verified by quantitative Real-time PCR （qPCR）. The results showed that 115 193 transcripts and 47 855 transcripts were obtained by transcriptome sequencing and unigene N50 was 2000. The results of GO functional enrichment analysis showed that 18 582 unigenes were divided into three categories： biological process， cell composition and molecular function in GO functional annotation. The results of KOG functional classification showed that 6203 unigenes were divided into 25 group， in KOG annotation， of which post-translational modification， protein turnover and chaperone contained the most unigenes. The results of KEGG metabolic pathway annotation showed that 6554 unigenes got functional annotation， and there were 119 metabolic pathways， among which carbohydrate metabolism accounted for the highest proportion. Five key enzyme genes involved in starch and sucrose metabolism and synthesis pathway， such as UGP2， glgC， glgA， Cluster-12747.5831 and Cluster-12747.16617， were screened. The expression level of qPCR was consistent with that of transcriptome sequencing.

Keywords： dragon fruit; pulp; transcriptome sequencing; starch; sucrose

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.003

火龍果營養(yǎng)豐富，富含糖、有機酸、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素、維生素、膳食纖維等[1-2]，是我國南方重要的果樹樹種。近年來，隨著火龍果產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，用于栽培的火龍果良種較少，通過分子生物學手段進行品種遺傳改良研究具有必要性。截至目前，火龍果的全基因組測序尚未完成，遺傳信息還不清楚，與果實發(fā)育相關(guān)的基因種類和功能尚不明確，這些均阻礙了火龍果果實品質(zhì)形成機理等相關(guān)基礎(chǔ)研究的進行。淀粉和蔗糖是果實內(nèi)在品質(zhì)形成的主要因子。目前，對火龍果果實發(fā)育過程中淀粉和蔗糖代謝途徑研究較少，參與淀粉和蔗糖代謝合成的相關(guān)酶及酶基因尚未見報道，淀粉和蔗糖代謝過程是如何進行催化反應(yīng)還不清楚。探究火龍果果肉中淀粉和蔗糖合成代謝途徑的分子調(diào)控機制，對改善果實品質(zhì)具有重要的意義。

RNA測序[3]（RNA Sequencing，簡稱RNA- Seq）又稱轉(zhuǎn)綠組測序技術(shù)，具有靈敏度高、定量準確、可重復(fù)性高、檢測范圍廣、分析更可靠等特點，被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)具有獲取全部mRNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，從中挖掘功能基因和未知基因，解析基因調(diào)控狀況，揭示不同生物學過程與基因表達之間關(guān)系等方面具有獨特的優(yōu)勢[4-5]。近年來，火龍果在轉(zhuǎn)錄水平上的研究取得了一系列進展，主要集中在逆境（低溫[6]、干旱[7]、水淹[8]、鹽脅迫[9]）、火龍果果肉顏色[10-11]轉(zhuǎn)錄調(diào)控、甜菜堿[12-13]生物合成相關(guān)基因表達、病蟲害等[14]方面，然而基于火龍果果肉不同發(fā)育時期轉(zhuǎn)錄組測序方面的研究尚未見報道。

本研究以3個不同發(fā)育時期的紅肉火龍果果肉為研究對象，進行轉(zhuǎn)錄組測序研究，采用生物信息學技術(shù)方法，對得到的Unigene進行分類和功能注釋，分析差異表達基因富集的代謝通路，對參與火龍果果實發(fā)育過程中淀粉和蔗糖代謝過程的差異表達的酶基因進行篩選及qPCR驗證，旨在探索火龍果果實發(fā)育過程中關(guān)于淀粉和蔗糖代謝過程中酶的催化情況及酶基因的表達規(guī)律，為進一步實現(xiàn)人為調(diào)控火龍果果實糖分積累、提升果實品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

研究材料采自山西農(nóng)業(yè)大學（山西省農(nóng)業(yè)科學院）棉花研究所南花農(nóng)場的15株紅肉火龍果樹，樹齡為3 a，品種為‘蜜寶，生長狀況良好。通過前期對15株紅肉火龍果樹物候期觀察，于2019年7月15日開始采樣，每5 d采1次樣，共采5次樣，選取3個關(guān)鍵時期進行研究，即：2019年7月15日（幼果期，Y）、2019年7月26日（轉(zhuǎn)色期，C）、2019年7月31日（成熟期，M），每次分別在3株樹的相同部位采集果實，采樣完成后迅速返回實驗室，將3個果實逐一去皮，切片（從果實中部橫切約0.3 cm），并立即將果肉放入液氮中冷凍，在?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 總RNA提取及檢測、cDNA文庫構(gòu)建和Illumina測序

1.2.1? 總RNA提取及檢測? 使用TRNzol-A* Reagent提取火龍果果肉中的總RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳分析火龍果果肉中RNA完整性及是否存在DNA污染，NanoPhotometer spectrophotometer檢測RNA純度，Agilent 2100 bioanalyzer檢測RNA完整性，以備合格的火龍果果肉RNA進行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.2? cDNA文庫構(gòu)建、質(zhì)檢及測序? 火龍果果肉RNA檢測合格后，構(gòu)建cDNA文庫。純化后的雙鏈cDNA，經(jīng)過末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選250～300 bp左右的cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，最終獲得文庫。使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進行檢測。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序。

1.3? 測序數(shù)據(jù)分析

1.3.1? 數(shù)據(jù)質(zhì)控? 為了保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，需要對原始數(shù)據(jù)進行過濾。主要包括去除帶接頭的reads、含N的reads、低質(zhì)量reads。同時，對clean data進行Q20、Q30和GC含量計算。后續(xù)所有分析均是基于clean data進行高質(zhì)量分析。

1.3.2? 轉(zhuǎn)錄本拼接、Corset層次聚類及轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量評估? 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)使用Trinity[15]軟件對clean data進行從頭組裝獲得轉(zhuǎn)錄本。Corset[16]層次聚類，在Trinity軟件拼接基礎(chǔ)上，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本間Shared Reads將轉(zhuǎn)錄本聚合為許多cluster，再結(jié)合不同樣本間的轉(zhuǎn)錄本表達水平及H-Cluster算法，將樣本間有表達差異的轉(zhuǎn)錄本從原cluster分離，建立新的cluster，最終每個cluster被定義為“Gene”。該方法可以聚合冗余轉(zhuǎn)錄本，并提高差異表達基因的檢出率。本研究采用BUSCO[17]軟件進行轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量評估。

1.3.3? 參考序列比對? 將Trinity拼接得到的轉(zhuǎn)錄組作為參考序列（Ref），將每個樣品的clean reads往Ref上做mapping，分別過濾掉比對質(zhì)量值低于10的reads，非成對比對上的reads，比對到基因組多個區(qū)域的reads。比對采用RSEM[18]軟件，RSEM中使用到的bowtie2參數(shù)mismatch0 （bowtie2默認參數(shù)）。

1.3.4? 基因功能注釋? 基于Nr、Nt、Pfam、Swiss-Prot進行序列相似性檢索蛋白質(zhì)功能進行注釋。利用GO、KEGG、KOG數(shù)據(jù)庫分別進行

分子功能及相關(guān)代謝通路的比對預(yù)測分析。

1.4? 差異基因富集分析

本研究采用GOseq[19]和KOBAS[20]軟件對差異基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等。

1.5? 熒光定量PCR分析

根據(jù)qPCR引物設(shè)計原則，采用Beacon Designer 7.9軟件進行引物設(shè)計，設(shè)計各候選基因的qPCR引物（表1）。引物由魔獾生物科技（上海）有限公司合成。本研究以火龍果3個發(fā)育時期的果肉為材料，YLS8為內(nèi)參基因[21]，采用SYBR GREEN I檢測進行qPCR反應(yīng)，利用2?CT計算各個發(fā)育時期果肉的基因相對表達量。反應(yīng)總體系為10 μL，其中包括2×SYBR? Green Supermix 5 μL、Forward prime 0.5 μL、Reverse primer 0.5 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，39個循環(huán)。擴增完畢后，以1 ℃/4 s的速率從60 ℃逐步遞增到95 ℃，獲得溶解曲線。反應(yīng)過程中，每個樣品設(shè)置3個生物學重復(fù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 火龍果果肉轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估統(tǒng)計及拼接

本研究以‘蜜寶火龍果3個不同果肉發(fā)育時期即幼果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期為樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得508 793 664個clean reads，包含76.32 Gb的核苷酸序列，Q20、Q30堿基百分比平均值均不小于97.95%、94.02% （表2）。將clean reads進行拼接組裝，共獲得火龍果果肉Transcripts 115 193條，Unigene 47 855條（表3）。Transcripts的N50和N90分別是2164和682，Genes的N50和N90分別是2000和508（表4）。結(jié)果表明，火龍果果肉測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，可進行后續(xù)的生物信息學分析。

2.2? 火龍果3個不同果肉發(fā)育時期差異表達基因比較

‘蜜寶火龍果3個不同果肉發(fā)育時期基因表達差異，兩兩比對，結(jié)果見表5。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)色期與幼果期相比，有7226條Unigene差異基因表達，其中3371個基因上調(diào)表達，3855個基因下調(diào)表達;成熟期與幼果期相比，共有7273個差異表達基因，其中上調(diào)基因3513個，下調(diào)基因3760個;成熟期與轉(zhuǎn)色期相比，共有1635個差異表達基因，其中805個基因上調(diào)，830個基因下調(diào)。上述結(jié)果表明，火龍果果肉在成熟期的差異表達基因所占比例高于其他2個時期，說明DEGs在火龍果成熟期發(fā)育階段起著非常重要的作用。

2.3? 基因注釋和功能分類

2.3.1? 基因注釋? 獲得轉(zhuǎn)錄本后，需對轉(zhuǎn)錄本進行功能注釋，以獲得gene的功能信息。為了解火龍果果肉轉(zhuǎn)錄本的注釋情況，與7大數(shù)據(jù)庫進行比對，共有47 855個Unigene成功注釋（表6），由于火龍果的基因組信息尚未公布，缺少參考基因組信息，部分序列未能注釋。與NR數(shù)據(jù)庫進行比對獲得的基因注釋信息最高，占全部注釋序列的49.2%。與PFAM和GO數(shù)據(jù)庫比對獲得的基因注釋信息次之，占全部注釋序列均為38.82%。與KOG數(shù)據(jù)庫比對獲得的基因注釋信息最少，占全部注釋序列的12.96%。

2.3.2? 火龍果果肉發(fā)育過程中差異表達基因GO功能富集? ‘蜜寶火龍果3個不同果肉發(fā)育時期差異表達基因經(jīng)兩兩比對，18 582個Unigene在GO功能注釋中被分為3大類，且每一類注釋種類和數(shù)量各不相同。由圖1可知，生物過程主要集中在細胞過程、代謝過程和單一有機體過程。在生物過程中，多數(shù)差異基因主要參與到細胞過程、代謝過程、單一生物過程;細胞組件中，多數(shù)差異基因主要參與了細胞、細胞組成、細胞器、細胞器組成、大分子復(fù)合物、膜、膜組成;分子功能中，多數(shù)差異基因富集到綁定、催化活性。

2.3.3? 火龍果果肉發(fā)育過程中差異表達基因KOG注釋分類統(tǒng)計? 對火龍果果肉發(fā)育過程中差異表達基因進行KOG數(shù)據(jù)庫比對分析，6203個Unigene在KOG注釋中被分為25個group，結(jié)果如圖2所示。翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶包含的Unigene最多，共854個;其次是一般功能預(yù)測，Unigene 803個;翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生，Unigene 538個;細胞內(nèi)運輸，分泌和囊泡運輸，Unigene 483個;RNA加工和修飾，Unigene 450個;未知功能，Unigene 426個;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，Unigene 420個;能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，Unigene 352個;轉(zhuǎn)錄，Unigene 351個;脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝，Unigene 307個;碳水化合物轉(zhuǎn)運與代謝，Unigene 298個;氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝，Unigene 289個;最少的是細胞運動性，注釋到2個Unigene?？梢?，在火龍果果肉發(fā)育過程中，除了轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾、運輸?shù)茸罨镜纳顒油?，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，脂質(zhì)、碳水化合物及氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝占重要地位，說明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，脂質(zhì)、碳水化合物及氨基酸轉(zhuǎn)運在火龍果果肉發(fā)育過程中起到重要作用。

2.4? 火龍果果肉發(fā)育過程中差異表達基因的KEGG分類

對基因做KO注釋后，根據(jù)它們參與的KEGG代謝通路進行分類（圖3），共分為5類，分別為：細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝及有機系統(tǒng)，其中代謝占的比例最大。在細胞過程中，以運輸和分解代謝為主;在環(huán)境信息處理中，以信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所占比例最高，膜運輸所占比例最小;遺傳信息處理中，以翻譯所占比例最高，復(fù)制和修復(fù)所占比例最小;代謝中，以碳水化合物代謝所占比列最高，多糖生物合成所占比例最小;在有機系統(tǒng)中，以環(huán)境適應(yīng)為主。

2.5? 火龍果3個不同果肉發(fā)育時期差異基因（DEGs）富集的代謝通路分析

KEGG是有關(guān)Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過Pathway顯著性富集，能夠確定火龍果果肉在3個不同發(fā)育時期的差異表達基因參與的主要代謝途徑。

2.5.1? 轉(zhuǎn)色期對比幼果期? 轉(zhuǎn)色期與幼果期共有7226個差異基因（padj<0.05|&log2FoldChange|> 1），其中上調(diào)基因3371個，下調(diào)基因3855個（圖4A）。轉(zhuǎn)色期對比幼果期的差異基因共參與到119種代謝通路，其中富集于前20的KEGG代謝通路見圖5。轉(zhuǎn)色期上調(diào)的差異基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、丙酮酸代謝、光合生物的固碳作用、半乳糖代謝、過氧化物酶體、類黃酮生物合成、類胡蘿卜素生物合成中，其中與類胡蘿卜素生物合成相關(guān)的酶基因表達量均上調(diào)，包括胡蘿卜素去飽和酶、玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶、9-順-環(huán)氧羰基雙加氧酶、花椒毒素脫氫酶，推測轉(zhuǎn)色期果肉顏色形成與類胡蘿卜素生物合成有關(guān)（圖5A）。轉(zhuǎn)色期下調(diào)的差異基因主要富集在核糖體、淀粉和蔗糖代謝、苯丙素類生物合成、糖酵解/糖異生、氨基糖和核苷酸代謝、α-亞麻酸代謝、檸檬酸循環(huán)、脂肪酸生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等（圖5B）。

2.5.2? 成熟期對比幼果期? 成熟期與幼果期共有7273個差異基因（padj<0.05|&log2FoldChange|> 1），其中上調(diào)基因3513個，下調(diào)基因3760個（圖4B）。成熟期對比幼果期的差異基因共參與到119種代謝通路，其中富集于前20的KEGG代謝通路見圖6。成熟期上調(diào)的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、淀粉和蔗糖代謝、剪接體、丙酮酸代謝、光合生物的固碳作用等（圖6A）。成熟期下調(diào)的差異基因主要富集在核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙素類生物合成、糖酵解/糖異生等。隨著火龍果果實的生長發(fā)育，成熟期較幼果期的果實口感甜，這與成熟期上調(diào)的差異基因富集在淀粉和蔗糖代謝、光合生物的固碳作用、半乳糖代謝有關(guān)（圖6B）。

2.5.3? 成熟期對比轉(zhuǎn)色期? 成熟期與轉(zhuǎn)色期共有1635個差異基因（padj<0.05|&log2FoldChange|> 1），其中上調(diào)基因805個，下調(diào)基因830個（圖4C）。成熟期對比轉(zhuǎn)色期的差異基因共參與到95種代謝通路，其中富集于前20的KEGG代謝通路見圖7。成熟期上調(diào)的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、苯丙素類生物合成、淀粉和蔗糖代謝、光合生物的固碳作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、類黃酮生物合成、果糖和甘露糖代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、花青素生物合成等（圖7A）。成熟期下調(diào)的差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、半乳糖代謝、糖酵解/糖異生、光合生物的固碳作用等（圖7B）。

2.6? 火龍果果肉中淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)酶的基因統(tǒng)計及表達模式

2.6.1? 火龍果果肉中淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)的差異基因統(tǒng)計? 本研究根據(jù)火龍果在3個不同果肉發(fā)育時期基因表達水平的顯著差異，統(tǒng)計了參與淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)的酶基因個數(shù)。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)色期與幼果期比對，參與淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達基因共有80個，其中上調(diào)基因25個，下調(diào)基因55個，下調(diào)基因占69%，成熟期與幼果期比對，參與淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達基因共有76個，其中上調(diào)基因28個，下調(diào)基因48個，下調(diào)基因占63%;成熟期與轉(zhuǎn)色期比對，參與淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達基因共有15個，其中上調(diào)基因7個，下調(diào)基因8個，下調(diào)基因占53%;通過對火龍果3個不同果肉發(fā)育時期差異基因比對整體來看，淀粉和蔗糖途徑為下調(diào)基因富集的通路。

2.6.2? 火龍果果肉中淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)的酶基因的表達模式? 以DESeq2padj<0.05|log2?F?o?l?d?Change|>1為篩選條件，結(jié)合KEGG富集通路，在火龍果3個不同果肉發(fā)育時期篩選參與淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達酶基因5個（表7）。

2.7? qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的準確性，以YLS8為內(nèi)參基因，篩選出參與淀粉和蔗糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因UGP2、glgC、glgA、Cluster- 12747.5831、Cluster-12747.16617等5個，并采用RT-PCR技術(shù)對5個關(guān)鍵的酶基因在火龍果3個不同果肉發(fā)育時期進行驗證分析。結(jié)果表明，RT-PCR驗證的5個與淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)的酶基因在火龍果3個不同果肉發(fā)育時期上調(diào)或下調(diào)的變化倍數(shù)與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)不一致，但基因表達量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中基因的表達量趨勢基本一致（圖8）。即UGP2在幼果期表達量較高，隨著果肉發(fā)育表達量持續(xù)下降（圖8A）;glgC在轉(zhuǎn)色期表達量較高，幼果期次之，成熟期表達量較低（圖8B）;glgA在成熟期表達量較高，幼果期次之，轉(zhuǎn)色期表達量較低（圖8C）;Cluster-12747.5831在幼果期表達量較高，轉(zhuǎn)色期表達量較低，成熟期較轉(zhuǎn)色期的表達量略有回升（圖8D）;Cluster-12747.16617在幼果期和轉(zhuǎn)色期的表達量較高且一致，成熟期表達量最低（圖8E）。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠性較高。同時發(fā)現(xiàn)，火龍果果肉中UGP2、glgC、glgA、Cluster-12747.5831、Cluster-12747.16617表達受到明顯的發(fā)育調(diào)控。

3? 討論

本研究針對火龍果3個不同時期的果肉組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，共得到76.32 Gb測序數(shù)據(jù)，組裝后共得到115 193條轉(zhuǎn)錄本，對獲得的Unigene進行七大數(shù)據(jù)庫（NR、NT、KO、Swiss-prot、PFAM、GO、KOG）比對，共有47 855個Unigene成功注釋。KEGG代謝通路注釋結(jié)果表明，6554個Unigene獲得功能注釋，共有119條代謝途徑，其中碳水化合物代謝所占比例最高。

結(jié)合KEGG分析，關(guān)于淀粉和蔗糖代謝途徑相關(guān)酶發(fā)現(xiàn)，合成淀粉和蔗糖的代謝途徑主要2條，一條代謝途徑為：D-葡萄糖-1-磷酸在UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（UGP2）催化作用下，生成UDP-葡萄糖，UDP-葡萄糖在糖原合酶（GYS）和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（WAXY）的共同催化作用下，生成直鏈淀粉，直鏈淀粉在1，4-α-葡聚糖分支酶（GBE1）催化作用下生成淀粉;另一條代謝途徑為：D-葡萄糖-1-磷酸在葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（glgC）催化作用下，生成ADP-葡萄糖，ADP-葡萄糖在淀粉合酶（glgA）和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（WAXY）共同催化作用下，生成直鏈淀粉，直鏈淀粉在1，4-α-葡聚糖分支酶（GBE1）催化作用下生成淀粉。

本試驗篩選出了5個參與淀粉和蔗糖代謝途徑的酶基因。其中，UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶（UGP2）在一條淀粉和蔗糖代謝途徑的早期階段發(fā)揮作用，以D-葡萄糖-1-磷酸為底物，催化形成UDP-葡萄糖。UGP2的表達影響著UGP2的活性及UDP-葡萄糖生成。本研究結(jié)果顯示UGP2在火龍果果肉幼果期的表達量最高，隨著果肉發(fā)育表達量持續(xù)下降。推測在火龍果果肉幼果期生成的UDP-葡萄糖最多，隨著果肉的不斷發(fā)育成熟，生成的UDP-葡萄糖逐漸減少，成熟期最少。葡萄糖-1-磷酸腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（glgC）在另一條淀粉和蔗糖代謝途徑的早期階段發(fā)揮作用，催化D-葡萄糖-1-磷酸生成ADP-葡萄糖。glgC的表達影響著glgC的活性及ADP-葡萄糖的生成。本研究中，glgC在火龍果果肉轉(zhuǎn)色期的表達量最高，幼果期的表達量次之，成熟期的表達量較幼果期的略低。推測ADP-葡萄糖在火龍果果肉轉(zhuǎn)色期生成最多，幼果期次之，成熟期ADP-葡萄糖的生成略低于幼果期ADP-葡萄糖的生成。

淀粉合酶（glgA）在淀粉合成中起關(guān)鍵作用。glgA是一種轉(zhuǎn)糖基酶，在馬鈴薯[22]、荸薺[23]、小麥[24]等上均有研究，但在果樹上研究的較少。在火龍果果肉淀粉和蔗糖代謝過程中，ADP-葡萄糖在glgA的催化下，生成直鏈淀粉，直鏈淀粉在1，4-α-葡聚糖分支酶（GBE1）催化作用下生成淀粉。glgA的表達影響著glgA的活性及淀粉的合成。本研究表明，在火龍果果肉成熟過程中，glgA的表達量總趨勢是先降低后升高，在成熟期時表達量達到高峰。說明在火龍果3個不同果肉發(fā)育期均有淀粉的合成，其中以成熟期合成淀粉最多。

β-葡萄糖苷酶是一種水解酶，為纖維素降解過程中的限速酶[25]。在火龍果果肉淀粉和蔗糖代謝過程中，β-葡萄糖苷酶主要催化纖維糊精生成纖維二糖，纖維二糖再次在β-葡萄糖苷酶的催化作用下生成葡萄糖;另外，β-葡萄糖苷酶還可催化β-D-葡萄糖苷生成葡萄糖。Cluster-12747.5831的表達影響著β-葡萄糖苷酶的活性及葡萄糖的合成。本研究表明，Cluster-12747.5831在幼果期的表達量最高，轉(zhuǎn)色期的表達量降至最低，成熟期表達量高于轉(zhuǎn)色期的表達量。這與段朝瑞等[26]以玫瑰香葡萄果肉為研究對象，在其不同成熟時期的VvBG1（β-葡萄糖苷酶基因）的表達趨勢相似。

蔗糖合酶具有分解和合成蔗糖的作用[27]，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是植物蔗糖代謝的關(guān)鍵酶。在火龍果果肉淀粉和蔗糖代謝途徑中，蔗糖在蔗糖合酶的分解作用下生成UDP-葡萄糖、D-果糖;UDP-葡萄糖在蔗糖合酶的合成作用下生成蔗糖。Cluster-12747.16617的表達影響著蔗糖合酶的活性及蔗糖的分解和合成。張春華等[28]研究桃果實不同發(fā)育時期蔗糖合成酶基因表達情況，結(jié)果表明：花后45～65 d，蔗糖合成酶基因表達量略微提高，85 d時，表達量下降至最低，105 d時，表達量迅速提高。本研究表明，Cluster-12747.16617在火龍果果肉幼果期和轉(zhuǎn)色期的表達量最高且一致，成熟期降低。這可能是由于不同種或火龍果為非躍變型果實的的原因。推測幼果期和轉(zhuǎn)色期的果肉中以蔗糖合成為主，成熟期的果肉中以分解蔗糖為主。

綜上所述，在火龍果果肉淀粉和蔗糖代謝途徑中，5個基因在3個果肉發(fā)育時期的表達情況各不相同。UGP2、glgC在淀粉和蔗糖代謝途徑的早期階段發(fā)揮作用，為淀粉和蔗糖的合成提供中間產(chǎn)物;glgA調(diào)控淀粉的合成;Cluster-12747. 5831調(diào)控葡萄糖的合成;Cluster-12747.16617調(diào)控蔗糖的分解和合成。

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責任編輯：黃東杰