季佳華，張 瑛，王繼芬，張文芳，李佳瑞

(1.中國人民公安大學(xué)偵查學(xué)院，北京 100038； 2.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192)

芬太尼是1960年由比利時(shí)的Paul Janssen合成的一種阿片類鎮(zhèn)痛藥，主要用于臨床麻醉，其麻醉效果是嗎啡的80倍[1]，且不良反應(yīng)比嗎啡少，是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破。之后，以芬太尼為先導(dǎo)化合物衍生出更多芬太尼類化合物，相比于芬太尼，其衍生物的藥效更強(qiáng)[2]。然而，芬太尼及其衍生物具有的致幻、興奮作用被不法分子利用，將其摻入海洛因或其他毒品中出售牟利，危害巨大。2019年5月1日我國開始對芬太尼類新精神活性物質(zhì)整類列管。因此，對芬太尼類新精神活性物質(zhì)的快速篩查和檢測是毒品檢驗(yàn)鑒定工作的重要任務(wù)。

目前，關(guān)于芬太尼類新精神活性物質(zhì)的檢測主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、光譜分析法等[3-11]。Jung等[12]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法篩查生物檢材中14種芬太尼類似物，在人全血和尿液中的檢出限分別為0.01～0.1 μg/L、0.02～0.05 μg/L，尿液中日內(nèi)、日間精密度均小于10%，血液中日內(nèi)、日間精密度均小于15%。Gilbert等[13]采用氣相色譜-質(zhì)譜法對18種芬太尼衍生物進(jìn)行定性、定量分析，檢出限為0.007～0.822 mg/L，定量限為0.023～2.742 mg/L。Larabi等[14]采集了一名“丁酰芬太尼”吸食者的2份頭發(fā)(離吸食間隔1個(gè)月和1年)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對頭發(fā)中的芬太尼類似物進(jìn)行檢測，月檢材中檢出3-氟芬太尼、呋喃芬太尼和芬太尼，年檢材中檢出甲氧基乙酰芬太尼、卡芬太尼和乙酰芬太尼。Kang等[15]基于微型質(zhì)譜儀建立了一種現(xiàn)場快速檢測芬太尼化合物的方法，飲料中芬太尼化合物檢出限低至10 μg/L，塑料袋表面的芬太尼化合物檢出限低至1 ng/m2。2020年5月29日我國司法部發(fā)布并實(shí)施了《生物檢材中芬太尼等31種芬太尼類新精神活性物質(zhì)及其代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢驗(yàn)方法》[16]，對常見的芬太尼類新精神活性物質(zhì)的篩查工作形成了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法前處理繁瑣，存在檢測時(shí)間長、有機(jī)溶劑污染等問題。

實(shí)時(shí)直接分析技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用[17-19]可以在幾秒內(nèi)將多種形態(tài)樣品離子化供質(zhì)譜分析[20]。相比于傳統(tǒng)的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜具有無需前處理或者只需要簡單前處理過程、分析速度快、溶劑損耗低等特點(diǎn)?；诖?，本研究擬采用實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜技術(shù)對人全血和尿液中8種常見芬太尼進(jìn)行篩查，旨在為司法鑒定領(lǐng)域芬太尼類新精神活性物質(zhì)的快速檢測提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

實(shí)時(shí)直接分析離子源：美國Ion Sense公司產(chǎn)品；API4000QTrap 三重四極桿系統(tǒng)：美國Applied Biosystems 公司產(chǎn)品；SIGMA3-30K型高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品；MS2旋轉(zhuǎn)振蕩器：德國IKA公司產(chǎn)品。

1.2 樣品與試劑

甲醇、乙腈：均為HPLC純，中國DiKMA公司產(chǎn)品；芬太尼、奧芬太尼、戊酰芬太尼、乙酰芬太尼、異丁酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、4-氟丁酰芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品：均為1 g/L，來自公安部禁毒局國家毒品實(shí)驗(yàn)室；SKF-525內(nèi)標(biāo)(1 g/L)：中國計(jì)量科學(xué)研究院產(chǎn)品。8種芬太尼和內(nèi)標(biāo)的基本信息示于圖1。

圖1 8種芬太尼和內(nèi)標(biāo)的基本信息Fig.1 Basic information about 8 kinds of fentanyl and internal standard

1.3 樣品預(yù)處理

取0.2 mL人空白全血或空白尿液，加入0.1 mL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入0.01 mL 10 mg/L內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋30 s混勻，加入0.69 mL甲醇-乙腈溶液(1∶4，V/V)沉淀蛋白，超聲5 min，在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上層清液，供儀器分析。

1.4 離子源儀器參數(shù)及DART溫度優(yōu)化

參數(shù)設(shè)置：采用DART 12Dip-it自動(dòng)進(jìn)樣裝置，離子源出口與質(zhì)譜的距離為1.6 cm，進(jìn)樣速度0.6 mm/s，以氦氣作為離子化試劑，柵極電壓250 V，正離子模式檢測，其他離子源儀器參數(shù)默認(rèn)。

DART溫度優(yōu)化：將8種芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至100 μg/L，分別在100、150、200、250、300、350、400、450、500 ℃溫度下檢測，每種標(biāo)準(zhǔn)品在同一溫度下連續(xù)測定6次，根據(jù)不同溫度下每種芬太尼的響應(yīng)強(qiáng)度(峰面積)確定最優(yōu)溫度。

1.5 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制100 μg/L的8種芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品，通過正離子全掃描模式采集8種芬太尼的母離子信號(hào)，根據(jù)[M+H]+質(zhì)荷比結(jié)合全掃描模式下的峰形確定母離子，通過二級(jí)質(zhì)譜掃描確定子離子，選擇3組響應(yīng)較高的子離子對，在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下對各子離子對的去簇電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，其MS/MS參數(shù)列于表1。

表1 8種芬太尼的MS/MS參數(shù)Table 1 MS/MS parameters of 8 fentanyls

2 結(jié)果與討論

2.1 離子源溫度優(yōu)化

按照1.3節(jié)方法，在不同離子源溫度下檢測100 μg/L芬太尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，其峰面積隨離子源溫度的變化趨勢示于圖2。

圖2 不同溫度下8種芬太尼的峰面積Fig.2 Peak areas of 8 kinds of fentanyl at different temperatures

由圖可見，隨著離子源溫度升高，8種芬太尼的峰面積呈上升趨勢，且在450 ℃和500 ℃響應(yīng)較好，鑒于溫度過高會(huì)使化合物分解或者減少儀器使用壽命，因此將離子源的溫度設(shè)置為450 ℃。

2.2 工作曲線與檢出限

取0.2 mL人空白全血和空白尿液，分別加入0.1 mL不同濃度的8種芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2節(jié)方法處理，使上清液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為50、100、200、500、800 μg/L。根據(jù)8種芬太尼峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對濃度作圖，得到線性關(guān)系。按照上述方法配制低濃度溶液，考察8種芬太尼的檢出限，其結(jié)果列于表2。

表2 8種芬太尼的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations, correlation coefficients and limits of detection of 8 kinds of fentanyl

可見，在50～800 μg/L濃度范圍內(nèi)，8種芬太尼的相關(guān)系數(shù)(R2)在0.992 1～0.999 6之間，線性關(guān)系良好；檢出限在0.004～0.03 μg/L之間。

2.3 回收率、重復(fù)性與精密度

取0.2 mL人空白全血和空白尿液，分別加入0.1 mL不同濃度的8種芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2節(jié)方法處理，使上清液中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為100、500、1 000 μg/L，同時(shí)配制100、500和1 000 μg/L添加內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。定義A為提取前添加標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積，B為標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積/內(nèi)標(biāo)的峰面積，提取回收率=A/B×100%；按照一組6次平行進(jìn)樣，根據(jù)提取后芬太尼的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，考察重復(fù)性；精密度按照早、中、晚一日3次的日內(nèi)精密度和連續(xù)5天的日間精密度進(jìn)行考察。8種芬太尼的回收率、重復(fù)性與精密度考察結(jié)果列于表3。

表3 8種芬太尼的回收率、重復(fù)性與精密度Table 3 Recovery, repeatability and precision of 8 kinds of fentanyl

可以看出，3種濃度標(biāo)準(zhǔn)品在2種基質(zhì)中的回收率在85.08%～108.17%之間，重復(fù)性RSD在0.17%～8.41%之間，日內(nèi)、日間精密度RSD均小于14.8%。表明這8種芬太尼的檢測受人全血和尿液基質(zhì)的影響較小，日內(nèi)和日間的檢測結(jié)果相對穩(wěn)定，能夠滿足分析血液和尿液生物檢材中芬太尼類物質(zhì)的需求。

3 結(jié)論

本研究建立了實(shí)時(shí)直接分析串聯(lián)質(zhì)譜法快速篩查8種芬太尼，并在人全血和尿液中進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法線性關(guān)系良好，回收率和檢出限均符合實(shí)際檢測的基本要求，且前處理簡單、快速高效，可以為司法鑒定領(lǐng)域芬太尼類物質(zhì)的快速篩查提供有效的方法參考。

續(xù)表3