徐家佳，李菁菁，李延巖，李文政，管明婧，金宇，李林，張承武*，王孝峰，張曉宇，周順，曹蕓*

1 安徽中煙工業(yè)責(zé)任有限公司，安徽省合肥市高新區(qū)天達路9號 230088；

2 南京工業(yè)大學(xué)，先進材料研究院，江蘇省南京市浦口區(qū)浦珠南路30號 211816

帕金森?。≒arkinson’s disease, PD）是一種多發(fā)于中老年人、以運動障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)退行性疾病，最主要病理特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺（Dopamine，DA）能神經(jīng)元變性、死亡[1-4]。PD作為第二高發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，在世界范圍內(nèi)，65歲以上人群中有1%～2%的人受到PD的影響[5]；隨著人口老齡化的快速發(fā)展，我國PD患者的數(shù)量也將相應(yīng)地大大增加，據(jù)估計到2050年我國的PD患者將達到1000萬[6]。PD病程長、致殘率高，但目前尚缺乏有效的治療手段，PD不僅嚴重影響患者及其家庭的生活質(zhì)量，且已經(jīng)成為影響我國人口健康水平、阻礙經(jīng)濟持續(xù)發(fā)展的社會問題。

大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，吸煙與PD的發(fā)病率呈負相關(guān)，吸煙人群PD的發(fā)病率顯著低于非吸煙人群[7-10]，提示煙草具有對抗PD的作用，但其中的機制并不清楚。煙堿（又稱尼古丁，Nicotine）是煙草的重要成分，在離體培養(yǎng)的細胞及實驗動物的研究結(jié)果表明，煙堿是煙草中對多巴胺能神經(jīng)元起保護作用的關(guān)鍵分子[11-13]。煙堿對抗PD的分子機制已有眾多報道，目前主要的觀點認為，煙堿是通過結(jié)合煙堿型乙酰膽堿受體發(fā)揮作用，主要的分子通路為煙堿結(jié)合到受體后，激活細胞內(nèi)鈣離子釋放，后者又激活下游的眾多信號分子，包括蛋白激酶A（PKA）、細胞分裂原活化蛋白激酶（ERK）、鈣調(diào)蛋白（CaM）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）等，從而減少神經(jīng)元的凋亡，起到對多巴胺神經(jīng)元的保護作用[14-17]。但這一觀點也受到了一定質(zhì)疑，例如，煙堿型乙酰膽堿受體主要表達于神經(jīng)元，而煙堿對中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞同樣具有調(diào)控作用[18]；另外，如果按上述觀點，鈣離子是煙堿與煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合后發(fā)揮作用的重要信使分子，鈣離子抑制劑理論上可完全阻斷煙堿的保護作用，但這點并沒有實驗結(jié)果支持。因此，煙堿對于PD的對抗作用機制有待進一步闡明。

單胺氧化酶-B（Monoamine Oxidase B, MAO-B）是機體內(nèi)降解多巴胺的關(guān)鍵酶，主要表達于線粒體外膜。大量研究結(jié)果表明，MAO-B在PD患者過表達，MAO-B不僅加劇多巴胺的缺乏，且在降解多巴胺的過程中發(fā)生自身氧化產(chǎn)生過氧化氫；也有研究表明其代謝會激活線粒體電子傳遞鏈的活性，是多巴胺能神經(jīng)元死亡的誘導(dǎo)因素[19-20]。MAO-B抑制劑包括selegiline、rasagiline、safinamide等 是FDA批 準的治療PD的臨床一線藥物[21-23]，此外Pargyline作為MAO-B特異性不可逆抑制劑，可影響酪胺代謝引起血壓降低，常作為降壓藥使用[24]。目前已有研究證實吸煙者腦內(nèi)的MAO-B含量顯著低于非吸煙者，這或許是煙堿產(chǎn)生的抑制作用[25]。進而通過分子結(jié)構(gòu)比較分析，發(fā)現(xiàn)煙堿的分子結(jié)構(gòu)和已有的數(shù)十種MAO-B的抑制劑具有相似性，均屬于香豆素衍生物或（雜）芳酰胺類化合物[26]，由此推測煙堿或可通過抑制MAO-B活性對抗PD。

本文利用小分子與蛋白互作結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，分析煙堿和MAO-B的結(jié)合位點，并在MPTP誘導(dǎo)的細胞PD模型及parkin基因敲除的果蠅PD模型中[27]研究煙堿對抗PD的作用。本研究有助于明確吸煙對抗PD的分子機制，有利于PD治療方案的拓展，同時為更好地綜合利用我國豐富的煙草資源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料與實驗動物

煙堿（Nicotine），MPTP hydrochloride (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine hydrochloride)，重組單胺氧化酶B (MAO-B, Monoamine Oxidase B human )，DMSO 購于sigma公司；MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazol-3-ium bromide）購于源培生物；Amplex Red Monoamine Oxidative Assay Kit，Pargyline hydrochloride，PVDF膜購于Thermofisher；NAD+試劑盒，BCA蛋白濃度檢測試劑盒，ATP檢測試劑盒，PMSF，RIPA裂解液購于碧云天；多巴胺含量檢測試劑盒購于金霖生物；電泳凝膠配制試劑盒購于雅酶；一抗包括 JNK，P-JNK，C-PARP，ERK，TOM20，MAO-B，二抗包括 HRP anti mouse，HRP anti Rabbit，均購自CST；DMEM，F(xiàn)BS胎牛血清購自BI；果蠅培養(yǎng)基，Parkin null果蠅由新加坡國立神經(jīng)研究所贈予。

1.2 實驗方法和條件

1.2.1 小分子-蛋白相互作用理論模型計算方法

利用Grid軟件構(gòu)建MAO-B蛋白具有FAD活性空腔的除水蛋白模型（使用來自于PDB官網(wǎng)（http://www1.rcsb.org/）的MAO-B蛋白結(jié)構(gòu)，編碼PDB code: 2BK3, 2VRL and 4A7A），利用AutoDock（1.5.6）軟件將煙堿和Pargyline（Pargyline hydrochloride）結(jié)構(gòu)導(dǎo)入作為配體。將蛋白模型和配體結(jié)構(gòu)均處理為.pdbqt格式，在Grid軟件中確定蛋白活性空腔的三維box，長寬高數(shù)值為42/52/46，中心位置為36.739/31.292/12.149，同時確保配體的所有單鍵均可旋轉(zhuǎn)。在Pymol（2.3.2）軟件中確定結(jié)合空間，進行cmd演算，計算出配體對蛋白的能量值，能量最低的為最穩(wěn)定構(gòu)象。在模型中使用的MAO-B蛋白模型活性空腔的氨基酸序列為 Tyr60, Gln65, Val82, Glu84,Leu88, Leu171, Cys172, Ile198, Ile199, Ser200, Thr201,Glu207, Thr314, Ile316, Tyr326, Leu328, Met341,Phe343, Tyr398 and Tyr435，煙堿與Pargyline的活性位點均為N。

1.2.2 體外純蛋白抑制率檢測

將煙堿均勻稀釋于PBS溶液中分別配制成1μmol/L，10 μmol/L，100 μmol/L的 溶 液 待 用。配制Pargyline的10 μmol/L的PBS溶液待用。配 制MAO-B蛋 白50 μg/mL的PBS溶 液 待 用。根 據(jù)Amplex Red Monoamine Oxidase Assay Kit（Thermofisher Invitrogen）提供的檢測試劑和檢測方法，將MAO-B底物 benzylamine與馬血清以及amplex red探針配制成工作液待用。在buffer溶液中分別加入煙堿/ Pargyline、MAO-B蛋白，使煙堿最終濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L，Pargyline的最終濃度為1 μmol/L，MAO-B的最終濃度為10μg/mL，將混合溶液置于37℃的搖床上振蕩1 h后，等體積加入工作液，繼續(xù)在37℃搖床振蕩1 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液轉(zhuǎn)移至黑色384孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。利用酶標儀（Synergy HTX）檢測各組溶液的熒光強度。檢測條件為激發(fā)光波長542 nm，接收發(fā)射波長570～700 nm。該試劑盒檢測原理為MAO-B會與其底物benzylamine反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，amplex red探針可檢測過氧化氫含量轉(zhuǎn)化為熒光信號。當(dāng)溶液中含有抑制MAO-B活性的物質(zhì)存在時，產(chǎn)生的過氧化氫減少，熒光信號減弱，即可通過反應(yīng)后溶液的熒光強度間接判斷MAO-B蛋白活性的抑制率。

1.2.3 MTT法檢測藥物毒性和細胞活力

將3×104個細胞均勻接種于96孔板中，共6行11列，每列設(shè)為1組。置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細胞密度達到60%左右時，每組加入含有不同濃度神經(jīng)毒性藥物MPTP的培養(yǎng)基，最終濃度分 別 為0、0.1、1、10、25、50、100、250、500、1000 μmol/L，另設(shè)一列空白組。每組所含DMSO含量均為0.1%，孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL,避光孵育4 h，出現(xiàn)藍紫色結(jié)晶。輕輕吸去培養(yǎng)液，每孔加入200 μL DMSO溶液，用酶標儀振蕩1 min使結(jié)晶完全溶解分散均勻后檢測波長452 nm處的吸光度，按以下公式計算每組的細胞存活率：

細胞存活率=（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）

細胞活力檢測實驗中將毒性物質(zhì)替換為不同濃度的煙堿，檢測方法同上。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 細胞中 NAD+/NADH 0水平檢測

將1.2×106個細胞均勻接種在6孔板中，當(dāng)細胞密度達到60%左右時，每孔加入含有相同濃度MPTP（100 μmol/L），不同濃度煙堿的培養(yǎng)基，最終濃度分別為0、0.1、1、10、100 μmol/L，Pargyline作為陽性對照藥物濃度為10 μmol/L。24 h后，收集各組細胞，用NAD+/NADH檢測試劑盒（碧云天）提供的試劑和方法處理細胞。具體為，每孔用200μL酸性提取液在冰上裂解細胞，10000 g 4℃離心10 min，取上清，加入等體積堿性提取液，充分混合后10000 g 4℃離心10 min，取上清10 μL用于蛋白濃度測定（BCA蛋白濃度試劑盒），另取50 μL上清分別按序加入試劑盒提供的檢測試劑，混勻后，用酶標儀檢測570 nm處的吸光度，按以下公式計算每組細胞中NAD+含量：

NAD+含量（nmol/mg）=（A測定-A對照-0.099）×V50/（V10×Cprotein）

實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細胞中ATP水平檢測

細胞接種及給藥方式同1.2.4，每孔用200 μL ATP裂解液冰上充分裂解細胞后12000 g 4℃離心15 min，取上清10 μL檢測蛋白濃度，收集剩余得到樣品液。將ATP標準品分別稀釋成5 μmol/L，1 μmol/L，0.5 μmol/L，0.1 μmol/L，0.05 μmol/L，0.01 μmol/L。將ATP標準液和樣品液加入白色96孔板中，每孔20 μL，每組設(shè)3個復(fù)孔。每孔加入100 μL檢測工作液，迅速用酶標儀通過化學(xué)發(fā)光通道檢測RLU值。繪制標準曲線，計算出各樣品組的ATP含量以及蛋白濃度，通過比例可以算出每mg蛋白中所含有ATP的量。

1.2.6 Western-Blot檢測細胞中蛋白水平

細胞接種及給藥方式同1.2.4，每孔用200 μL含有1%蛋白酶抑制劑（PMSF）的細胞裂解液（RIPA）冰上充分裂解細胞后12000 g 4℃離心5 min，取上清10 μL檢測蛋白濃度，另取160 μL上清加入40 μL 5×上樣緩沖液（loading buffer），充分混勻后100℃加熱10 min，得到樣品液。根據(jù)各組樣品的蛋白濃度換算出各組上樣量（電泳蛋白上樣量為30 μg），公式為：v=1.25×30/c（對應(yīng)蛋白濃度）。

配制合適濃度的SDS-PAGE凝膠，根據(jù)計算出的上樣量將樣品加入各凝膠泳道中，用1×上樣緩沖液補齊每一泳道的樣品總體積。加滿電泳液，80 V恒壓電泳15 min，120 V恒壓電泳約60 min使目標條帶分子量完全分開。取出膠塊，用甲醇活化過的PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為恒流300 mA 45 min，冰浴。將PVDF膜置于5% BSA封閉液中室溫搖床封閉1 h，用目標蛋白的一抗稀釋液在4℃下?lián)u床孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min。用一抗相同種屬的二抗稀釋液室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。將配制好的ECL顯色工作液均勻鋪滿PVDF膜，用凝膠成像儀進行曝光成像，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

細胞處理步驟同1.2.4，胰酶消化，離心收集細胞后，以緩沖液：Annexin V：PI=100：1：1的比例配制工作液，重懸細胞，避光37℃孵育30 min后PBS洗滌3次，以PBS重懸細胞，用流式細胞儀（貝德曼C6）檢測細胞凋亡情況。

1.2.8 HPLC檢測不同細胞組分中煙堿含量

利用細胞線粒體分離試劑盒（碧云天）對細胞（前處理同1.2.4）進行線粒體提取和分離。對分離后的組分進行蛋白印跡實驗檢測組分純度。各組分的細胞裂解液取200 μL，加入1 mL乙酸乙酯，振蕩混勻10 min，離心后取800 μL上清，揮干，用8：2甲醇水200 μL復(fù)溶，離心取180 μL上清，得到待測樣品溶液。配制濃度分別為2、5、10、20、50、100 ng/mL的煙堿標準溶液，選用對乙酰氨基酚為內(nèi)標物質(zhì)，建立標準曲線。用相同條件和方法檢測樣品溶液，得到樣品中煙堿的含量。高效液相色譜分析參照文獻[28]中的實驗條件，具體如下：

色譜柱型號：Thermo C18 100×2.1 mm；

流動相：10 mmoL醋酸銨：甲醇=15：85。

1.2.9 PD果蠅給藥

選取150只一日齡的野生型雄性果蠅為對照組，選取150只一日齡的帕金森疾病模型（Parkin null）雄性果蠅為疾病組，選取150只一日齡的帕金森疾病模型雄性果蠅為治療組。對照組與疾病組均給予正常食物，治療組給予含有10 μmol/L煙堿的食物。每一組果蠅分為3管平行組，每小組50只。每天更換食物并記錄生存率。

果蠅行為學(xué)檢測：各組果蠅培養(yǎng)到50天時，進行爬行實驗。將每組果蠅隨機取出30只存活果蠅，轉(zhuǎn)移至帶有刻度的透明長管中，兩頭用棉花塞緊，饑餓處理2 h后，將管子豎直放置，果蠅從底端開始往上爬行，記錄1 min內(nèi)能爬過20 cm高度的果蠅數(shù)量并記錄。每組果蠅重復(fù)爬行3次，每次爬行后間隔5 min。最后計算出各組果蠅的爬行率。

1.2.10 果蠅大腦中的多巴胺含量檢測

每組取10只果蠅用CO2麻醉，在顯微鏡下用手術(shù)級鑷子剝離出完整的果蠅大腦，置于120 μL PBS中，用超聲細胞粉碎儀破碎組織（冰浴，超聲2 s，暫停2 s，共15次），10000 g 4℃離心15 min，取100 μL上清即為待測樣品溶液。使用多巴胺檢測試劑盒（金霖生物）提供的檢測試劑和方法，配制一系列濃度梯度（1000 pg/mL，333.33 pg/mL，111.11 pg/mL，37.04 pg/mL，12.35 pg/mL）的多巴胺標準品，把標準品和待測樣品溶液加入試劑盒提供的96孔板中，每孔50μL，先后用試劑盒提供的檢測工作液A、B于37℃各孵育1 h后，吸去孔中溶液，每孔加入90 μL底物溶液，37℃避光顯色后加入50 μL終止液。隨即用酶標儀檢測450 nm波長處的吸光度，建立標準曲線，計算出各組果蠅大腦中多巴胺含量。

1.2.11 果蠅大腦中的ATP含量檢測

每組取10只果蠅用CO2麻醉，在顯微鏡下用手術(shù)級鑷子剝離出完整的果蠅大腦，置于120 μL PBS中，用超聲細胞粉碎儀破碎組織（冰浴，超聲2 s，暫停2 s，共15次），10000 g 4℃離心15 min，取100 μL上清即為待測樣品溶液。使用同1.2.5所述相同試劑盒的相同檢測方法對每組果蠅大腦裂解液進行檢測，分析方法同上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，采用單因素方差分析檢驗組間差異，利用t-test函數(shù)進行分析，檢驗水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 煙堿與MAO-B蛋白相互作用的Docking理論結(jié)果

Docking是通過研究配體與受體（生物大分子）之間的相互作用，預(yù)測兩者結(jié)合模式和親和力進而從分子層面解釋配體起作用的機制[29]。通過對煙堿、Pargyline與MAO-B蛋白Docking分析，分別計算出煙堿和Pargyline的活性位點與MAO-B功能域FAD反應(yīng)位點的距離。如圖1所示，在兩者最穩(wěn)定構(gòu)象中，煙堿與FAD的反應(yīng)位點間距為3.8 ?，而Pargyline與FAD的反應(yīng)位點間距為5.1 ?。結(jié)果表明煙堿具有與MAO-B蛋白結(jié)合的理論基礎(chǔ)，且反應(yīng)位點間距短于MAO-B抑制劑Pargyline。

圖1 小分子與蛋白互作用Docking模擬結(jié)果Fig.1 Docking analysis of Nicotine / MAO-B (1), Pargyline /MAO-B (2)

2.2 煙堿對MAO-B純蛋白的抑制率

Docking結(jié)果為證明煙堿可以抑制MAO-B提供了理論基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)之上，利用人工重組的人源MAO-B蛋白（Sigma），通過Amplex Red試劑盒檢測分析，驗證煙堿對MAO-B的抑制作用。如圖2(1)所示，煙堿在體外可抑制MAO-B蛋白的活性，且隨煙堿濃度增加抑制效果越來越強。由圖2(2)結(jié)果可知，當(dāng)煙堿在0～0.1 μmol/L濃度區(qū)間內(nèi)，蛋白抑制率高于Pargyline，當(dāng)濃度大于1 μmol/L時，抑制率略低于Pargyline，但可達80%及以上。以上結(jié)果證明在體外環(huán)境下，低濃度煙堿即可有效抑制MAO-B蛋白活性。

2.3 煙堿抑制細胞PD模型MAO-B的作用及對凋亡的影響

圖2 煙堿對MAO-B活性抑制作用Fig.2 The inhibitory effect of nicotine on MAO-B

圖3 煙堿在細胞PD模型中的保護作用Fig.3 The protective effect of nicotine in cellular PD model

SH-SY5Y是人神經(jīng)母細胞瘤細胞，具有多巴胺能，它表達酪氨酸羥化酶，也可產(chǎn)生多巴胺，是研究PD常用的細胞系[18]。但SH-SY5Y自身MAO-B表達量很低，本研究利用基因編輯方法成功構(gòu)建過表達MAO-B的神經(jīng)細胞系SH-SY5Y POE MAO-B。如圖3（3）所示，SH-SY5Y POE MAO-B細胞系中可以穩(wěn)定表達MAO-B蛋白。在此基礎(chǔ)上，利用誘導(dǎo)PD模型常用的神經(jīng)毒素MPTP，構(gòu)建神經(jīng)細胞的PD模型。用MTT篩選出100 μmol/L MPTP孵育24 h，作為后續(xù)細胞的PD模型條件。在此基礎(chǔ)上，研究煙堿的保護作用。如圖3（1）（2）所示，當(dāng)細胞只給予MPTP刺激時，過表達MAO-B的神經(jīng)細胞比正常的神經(jīng)細胞活力低5%左右，而當(dāng)加入不同濃度煙堿時，過表達MAO-B的細胞系活力逐漸恢復(fù)且優(yōu)于普通神經(jīng)細胞?；贛PTP的作用機制是通過破壞線粒體呼吸鏈而影響線粒體的功能，進一步分析細胞給藥前后的NAD+以及ATP水平，觀察煙堿對神經(jīng)細胞代謝水平的影響。如圖3（4）所示，在過表達MAO-B的細胞中，當(dāng)給予1 μmol/L濃度煙堿時，細胞中NAD+含量顯著升高至5.5 nmol/L與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。而給予10 μmol/L，100 μmol/L濃度煙堿時，該細胞中NAD+水平也略有上升。從圖3（5）ATP檢測結(jié)果可見，煙堿以及Pargyline對于過表達MAO-B的細胞系中ATP水平的升高促進作用優(yōu)于普通神經(jīng)細胞，檢測結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。為闡明煙堿保護多巴胺能細胞系的分子機制，通過Western-Blot法檢測過表達MAO-B細胞中凋亡蛋白水平的變化，結(jié)果如圖3(6)所示，給予MPTP刺激的細胞中P-JNK，C-PARP蛋白表達均顯著升高，而同時加入MPTP和煙堿的細胞中對應(yīng)的蛋白水平均有所下降。最后通過流式細胞術(shù)實驗檢測細胞凋亡情況，結(jié)果如圖3（7）所示，在過表達MAO-B的神經(jīng)細胞中，煙堿和Pargyline都可在一定程度上抑制由MPTP引起的凋亡。MPTP刺激細胞后，凋亡早期細胞比例由對照組的77.4%增加到84.7%，而同時加入MPTP和煙堿的細胞中，晚凋細胞比例降低至77.5%，Pargyline組也有類似的趨勢。

2.4 煙堿進入細胞后的分布

MAO-B表達于線粒體外膜，為明確煙堿是否可直接與MAO-B相互作用，通過HPLC對細胞不同組分中的煙堿含量進行檢測。首先分離細胞線粒體和胞質(zhì)組分，用蛋白印跡實驗進行驗證組分純度如圖4（1）。在此基礎(chǔ)上對各組分進行HPLC檢測，煙堿含量分布如圖4所示。當(dāng)煙堿濃度為1 μmol/L時如圖4（2），給藥后0.5 h，胞質(zhì)中濃度達到80 ng/μg，2 h后降至1.5 ng/mL，檢測結(jié)果與第一個時間點0.5 h組別相比，具有顯著性差異。而線粒體中，從給藥后0.5 h至6 h，濃度均在25 ng/μg左右，無明顯改變。當(dāng)煙堿濃度為10 μmol/L時如圖4（3），給藥后0.5 h，胞質(zhì)中濃度達到85 ng/μg，2 h后降至30 ng/μg，檢測結(jié)果與第一個時間點0.5 h組別相比，具有顯著性差異。6 h時，胞質(zhì)濃度又上升至65 ng/μg，而在線粒體組分中，濃度仍維持在25 ng/μg左右，略有下降但無明顯變化。這些結(jié)果提示，煙堿的確可以到達線粒體，這也為其抑制線粒體外膜上的MAO-B提供了空間基礎(chǔ)。

圖4 煙堿進入細胞后在不同組分中的含量分布（Myto：線粒體；Cyto：胞質(zhì)）Fig.4 Content distribution of nicotine in different cell components (Myto: Mitochondria; Cyto: Cytoplasm)

2.5 煙堿對果蠅PD模型保護作用

果蠅生命周期較短，易于養(yǎng)育，它的基因和人有將近70%的一致性，因此經(jīng)常被用作疾病模型[19]。Parkin基因缺失可導(dǎo)致家族型PD，果蠅敲除Parkin基因也可以產(chǎn)生PD相關(guān)癥狀，包括多巴胺神經(jīng)元細胞死亡、多巴胺水平下降、運動功能受損等[20]。本實驗前期研究結(jié)果也表明，MAO-B的活性在Parkin基因敲除果蠅高于正常對照[27]。為明確煙堿在動物水平對PD的對抗作用，在果蠅食物中加入煙堿，研究煙堿對Parkin基因缺陷的PD果蠅的保護作用?；谇捌谠诩毎泻Y選出煙堿給藥濃度為1 μmol/L，在果蠅實驗中，將煙堿配成在食物中終濃度為細胞給藥濃度十倍的10 μmol/L進行實驗。如圖5（1）所示，Parkin null果蠅老齡時翅膀呈現(xiàn)無法收攏的狀態(tài)，而Wild type果蠅翅膀可以正常收攏，喂食煙堿的Parkin null果蠅翅膀形態(tài)有所改善。如圖5（2）（3）（4）所示，Wild type果蠅的爬行率，大腦多巴胺含量，肌肉組織ATP含量均顯著高于Parkin null果蠅，而喂食煙堿的Parkin null果蠅相應(yīng)指標也有所改善。

圖5 煙堿對PD果蠅的保護作用Fig.5 Protective effect of nicotine on drosophila PD model

3 討論

MAO-B是帕金森發(fā)病過程中重要的致病因子[30-33]，MAO-B蛋白含有與半胱氨酸殘基共價結(jié)合的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）輔因子，并與兩個酪氨酸殘基一起形成一個活性空腔，通過兩個電子催化胺類底物的α-碳氧化。通過分析發(fā)現(xiàn)，煙堿和幾種商業(yè)化的MAO-B抑制劑（Pargyline，Selegyline，Rasagyline等）結(jié)構(gòu)類似，都屬于香豆素衍生物或（雜）芳酰胺類[26]。因此通過小分子與蛋白Docking模擬分析，發(fā)現(xiàn)煙堿可以順利進入MAO-B蛋白活性空腔；且其吡啶環(huán)上的N活性較高，可以與MAO-B蛋白FAD輔酶上的活性位點進行反應(yīng)；反應(yīng)之后的構(gòu)象能量較低，較為穩(wěn)定，這為煙堿可以抑制MAO-B蛋白活性提供了有力的理論基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上進一步利用商業(yè)試劑盒對煙堿在體外對MAO-B抑制效果進行驗證，發(fā)現(xiàn)煙堿小濃度時即可達到較明顯的抑制率，但當(dāng)濃度逐漸增大時，抑制效果趨于飽和，即使再增加濃度也無法完全抑制MAO-B的活性。推測可能是由于煙堿與MAO-B蛋白的結(jié)合方式為可逆的，最高抑制率接近90%。

在體外驗證煙堿確實具有抑制MAO-B活性的作用后，進行亞細胞器分離實驗，明確了煙堿可以分布于線粒體，為其與線粒體外膜上的MAO-B提供了空間結(jié)合的理論基礎(chǔ)。接著構(gòu)建過表達MAO-B的神經(jīng)細胞系，利用MPTP可以被MAO-B催化氧化為神經(jīng)毒性物質(zhì)MPP+的特性[31-32]，構(gòu)建了細胞PD模型。實驗結(jié)果顯示煙堿對過表達MAO-B的細胞系的保護作用要優(yōu)于普通的神經(jīng)細胞系。這間接證明了煙堿極有可能通過抑制MAO-B活性，減少對MPTP的氧化，進一步減少了MPP+和過氧化氫的產(chǎn)生，減輕了神經(jīng)毒性作用和氧化應(yīng)激作用。這在WB結(jié)果中也得到了驗證，MPTP組別中氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白P-JNK表達升高，而給予煙堿后，該蛋白表達量下降。本研究對細胞代謝標志物NAD+和ATP含量進行了檢測，結(jié)果一致證實了煙堿對過表達MAO-B細胞系的保護作用。而流式凋亡檢測結(jié)果和凋亡相關(guān)蛋白Cleaved-PARP的變化，也驗證了在低濃度煙堿（1 μmol/L，10 μmol/L）給藥條件下，可以緩解MPTP所引起的過表達MAO-B神經(jīng)細胞凋亡。最后，通過HPLC檢測了煙堿進入細胞后不同時間在線粒體和細胞質(zhì)中的分布情況，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)中的煙堿含量隨給藥濃度的增大有所增加，但在線粒體中，加大給藥濃度或是給藥時間，煙堿的含量基本保持穩(wěn)定。這可能是由于煙堿給藥半小時之內(nèi)即可到達線粒體，并于線粒體外膜上的MAO-B結(jié)合，只有結(jié)合的煙堿分子留在線粒體內(nèi)，多余的煙堿則回到胞質(zhì)中，而線粒體上MAO-B蛋白含量有限，因此線粒體中煙堿很容易達到飽和，且結(jié)合后不易被細胞代謝排出胞外。目前主流的觀點認為煙堿對抗帕金森癥的機制為結(jié)合神經(jīng)細胞外膜上的乙酰膽堿受體，激活一系列GABA能信號通路。本研究驗證了煙堿可進入細胞并到達線粒體，而MAO-B是存在于線粒體外膜上的蛋白，這為認識煙堿抑制MAO-B提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。該研究首次構(gòu)建可穩(wěn)定過表達MAO-B的多巴胺能神經(jīng)細胞系，以PD模型進行了研究，為認識煙堿對抗帕金森病的機制提供了新的思路。

最后在果蠅PD模型中進行了活體實驗[34-35]，驗證煙堿在體內(nèi)是否能發(fā)揮神經(jīng)保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在煙堿低濃度（10 μmol/L）給藥條件下，可有效緩解疾病組的肌肉狀態(tài)（從肌肉組織ATP含量和翅膀形態(tài)可見），提高大腦多巴胺含量，原因可能是煙堿抑制MAO-B活性之后可以減少對多巴胺的降解，從而提高腦內(nèi)多巴胺含量[36]。因此從多巴胺含量的變化來看，煙堿具有通過抑制MAO-B活性來發(fā)揮對抗帕金森疾病的可能性。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究從理論模擬、體外蛋白水平證實了煙堿對MAO-B的抑制作用，在細胞、實驗動物水平驗證了煙堿可能通過抑制MAO-B對抗帕金森癥表型的作用。這一保護機制不同于已報道研究結(jié)果，為充分認識煙堿對抗帕金森病的機制奠定了實驗基礎(chǔ)，為有效開發(fā)利用煙草提供了新思路。