丁久玲，鄭 凱，唐冬芬，席剛俊，史 俊

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有健胃、滋陰、潤(rùn)肺、明目、清熱解毒、提高免疫力等功效。低溫會(huì)抑制鐵皮石斛幼苗的成活和生長(zhǎng)，是影響其生存與分布的主要因素。因此，增強(qiáng)鐵皮石斛幼苗的抗寒能力，尋找一種有效緩解低溫傷害的方法是提高鐵皮石斛幼苗成活率及產(chǎn)量的關(guān)鍵，亦是鐵皮石斛種植和生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題之一。

硅是地殼中第二豐富的元素，大量研究表明，硅有益于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，能顯著緩解低溫脅迫對(duì)小麥、水稻、黃瓜、烏塌菜等植物［1-5］的不良影響，從而提高植物的抗寒性。硒（Se）是植物生長(zhǎng)發(fā)育中有益的營(yíng)養(yǎng)元素，參與植物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，清除脂質(zhì)過(guò)氧化物等自由基，減少脅迫對(duì)生物膜等造成的機(jī)體過(guò)氧化損傷，從而降低脅迫帶來(lái)的傷害，在植物抗逆中的作用越來(lái)越受到重視。涉及硒提高植物抗寒性的報(bào)道較少，研究表明適宜濃度的硒可以減弱低溫對(duì)草莓、蘿卜、番茄等幼苗［6-8］的傷害，提高植物的耐寒性。

鐵皮石斛的研究多集中于組培［9-11］、栽培［12-14］、藥用［15，16］等方面；目前涉及低溫脅迫的文獻(xiàn)相對(duì)較少［17，18］；對(duì)于添加硅、硒緩解鐵皮石斛低溫脅迫的報(bào)道更少，僅有張艷嫣等［19］認(rèn)為適量濃度硒可使鐵皮石斛幼苗的耐冷性增強(qiáng)。而硅和硒配合使用對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛的抗寒性是否有影響鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究基于硅和硒可有效緩解植物低溫傷害的理論知識(shí)，揭示硅和硒配合使用對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗的影響和低溫傷害的緩解作用，探討有效緩解鐵皮石斛低溫傷害的硅和硒復(fù)配劑的適宜濃度等關(guān)鍵技術(shù)難題，以期為提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和低溫脅迫下幼苗成活率等問(wèn)題提供理論指導(dǎo)，亦為鐵皮石斛大范圍推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以出瓶栽培一年的鐵皮石斛組培苗為供試材料，栽培于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)博園大棚內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用盆栽方式，從溫室栽培床上挖出生長(zhǎng)均勻、無(wú)病蟲(chóng)害的盆栽鐵皮石斛幼苗，移栽到裝有鐵皮石斛專用基質(zhì)的塑料花盆中（規(guī)格為高18 cm、底面直徑15 cm），每盆6株。置于大棚內(nèi)正常培養(yǎng)15 d，在醫(yī)用冷藏箱內(nèi)2℃低溫脅迫7 d后進(jìn)行硅和硒復(fù)配劑處理。

硅和硒均設(shè)置了4個(gè)濃度梯度，分別為0、25、50、75 mg/L和0、5、7.5、10 mg/L，采用不完全隨機(jī)設(shè)計(jì)將二者進(jìn)行復(fù)配，共12種復(fù)配劑處理，具體的濃度見(jiàn)表1。各處理均是在1/2 Hoaglang營(yíng)養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加相應(yīng)濃度的硅和硒，每個(gè)處理5次重復(fù)。硒用分析純的亞硒酸鈉（Na2SeO3），硅用分析純的九水硅酸鈉（Na2SiO3·9H2O）。復(fù)配劑以葉面噴灑的形式施入，噴施至葉片完全濕潤(rùn)為準(zhǔn)，之后置于人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)20 d。人工氣候箱設(shè)定25℃，光照度4 000 lx，12 h光培養(yǎng)/12 h暗培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察植物生長(zhǎng)狀況并正常管理。復(fù)配劑處理至一定時(shí)間后采取倒3～5片葉片，置于-75℃低溫冰箱中保存，用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

表1 硅和硒復(fù)配劑處理

1.3 測(cè)定項(xiàng)目

葉綠素含量的測(cè)定：參照《植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)》［20］中的葉綠體色素含量的測(cè)定方法進(jìn)行。脯氨酸含量（Pro）的測(cè)定：利用脯氨酸分光光度計(jì)試劑盒法，試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司（下同）提供。丙二醛含量（MDA）的測(cè)定：利用丙二醛分光光度計(jì)試劑盒法。超氧化物歧化酶（SOD）的測(cè)定：利用超氧化物歧化酶分光光度計(jì)試劑盒法。過(guò)氧化物酶（POD）的測(cè)定：利用過(guò)氧化物酶分光光度計(jì)試劑盒法。過(guò)氧化氫酶（CAT）的測(cè)定：利用過(guò)氧化氫酶分光光度計(jì)試劑盒法。

2 結(jié)果與分析

2.1 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的影響

葉綠素可以吸收、傳遞光能，其含量多少在一定程度上決定了植物對(duì)光的吸收和利用效率，常作為研究光合生理的重要指標(biāo)［21］之一。植物體內(nèi)葉綠素含量的增加可以在一定程度上提高其光合速率的轉(zhuǎn)換，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而間接提高抗逆性。從圖1可以看出，不同濃度的硅和硒復(fù)配劑處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的影響不同。其中處理G6的葉綠素含量最高，其次是G8、G7、G9和G5，這5個(gè)處理間葉綠素含量差異不顯著，但均顯著高于對(duì)照（G1）；處理G10的葉綠素含量最低，其次是G1（對(duì)照）、G11、G12和G2，這5個(gè)處理間葉綠素含量差異不顯著。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛葉綠素含量的影響為G10＜G1＜G11＜G12＜G2＜G3＜G4＜G5＜G9＜G7＜G8＜G6。復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其葉綠素含量與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較低。據(jù)此可初步判斷，低溫脅迫下硅和硒配合使用可增加鐵皮石斛葉綠素含量，且二者配合使用時(shí)適宜的濃度可使鐵皮石斛葉綠素含量顯著增加，復(fù)配劑的濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于葉綠素含量的增加，本研究認(rèn)為硅和硒復(fù)配處理G6、G7和G8可以提高低溫脅迫下鐵皮石斛的葉綠素含量，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。

圖1 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的影響

2.2 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛脯氨酸含量的影響

研究表明［22］，在低溫脅迫下，植物通過(guò)體內(nèi)Pro含量的顯著增加來(lái)緩解植物受到的傷害，從而提高其抗寒性。由圖2可知，不同濃度的硅和硒復(fù)配處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛脯氨酸含量的影響各不相同。其中處理G9的脯氨酸含量最高，其次是G8、G7，這3個(gè)處理間脯氨酸含量差異不顯著，但顯著高于對(duì)照（G1）；處理G11的脯氨酸含量最低，其次是G1、G2、G3、G10和G12，這6個(gè)處理間葉綠素含量差異不顯著。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛脯氨酸含量的影響為G11＜G1＜G2＜G3＜G10＜G12＜G6＜G5＜G4＜G7＜G8＜G9。復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其脯氨酸含量與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較低，顯著低于G9和G8，由此可說(shuō)明，低溫脅迫下硅和硒應(yīng)配合使用才可明顯提高鐵皮石斛脯氨酸含量。適宜濃度的硅和硒配合使用時(shí)才可顯著提高鐵皮石斛Pro的含量，本研究認(rèn)為硅和硒復(fù)配處理G8和G9可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的Pro含量，提高其抗寒性。

圖2 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛脯氨酸含量的影響

2.3 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛丙二醛含量的影響

植物器官在低溫逆境下，往往發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，丙二醛（MDA）是其產(chǎn)物之一，通常利用其作為脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)，反映細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度和植物對(duì)低溫逆境條件反應(yīng)的強(qiáng)弱，其含量高低與植物抗寒性強(qiáng)弱呈反比。

不同濃度的硅和硒復(fù)配劑處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛MDA含量的影響不同（圖3）。其中處理G5的MDA含量最低，其次是G6、G4、G7、G8和G9，6個(gè)處理間差異不顯著，同時(shí)，這6個(gè)處理與G2、G3和G10相比差異不顯著；處理G11的MDA含量最高，其次是G12、G1、G10、G2和G3，6個(gè)處理間MDA含量差異不顯著，均較高。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛MDA含量的影響為G5＜G6＜G4＜G7＜G8＜G9＜G3＜G2＜G10＜G1＜G12＜G11。復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其MDA含量與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較高，因此可說(shuō)明，低溫脅迫下硅和硒應(yīng)配合使用才可明顯降低鐵皮石斛MDA的含量。硅和硒配合使用可以在一定程度上降低鐵皮石斛MDA含量，但復(fù)配劑只有在濃度適宜時(shí)才可顯著提高鐵皮石斛MDA的含量，本研究認(rèn)為硅和硒復(fù)配劑處理G4、G5、G6、G7、G8和G9可以顯著降低低溫脅迫下鐵皮石斛的MDA含量，從而提高其抗寒性。

圖3 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛MDA含量的影響

2.4 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛抗氧化酶活性的影響

2.4.1 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛SOD活性的影響 氧陰離子自由基是生物氧化、電子傳遞過(guò)程中產(chǎn)生的，可參與物質(zhì)代謝、誘發(fā)細(xì)胞的一些不良反應(yīng)等。當(dāng)植物遭遇低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞中的超氧陰離子自由基積累過(guò)多，從而氧化、破壞生物大分子，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而SOD可清除超氧陰離子自由基，緩解植物受到不良的傷害。

由圖4可以看出，不同濃度的硅和硒復(fù)配劑處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛SOD活性的影響有所不同。其中處理G7和G8的SOD活性最高，其次是G4、G9、G5和G6，6個(gè)處理SOD活性差異不顯著，均較高，顯著高于其余6個(gè)處理；處理G2的SOD活性最低，其次是G1、G10、G11、G3和G12，6個(gè)處理間SOD活性差異不顯著。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛SOD活性的影響為G2＜G1＜G10＜G11＜G3＜G12＜G6＜G5＜G9＜G4＜G8＜G7。復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其SOD活性與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較低，顯著低于處理G7、G8、G4、G9、G5和G6，故認(rèn)為，低溫脅迫下硅和硒應(yīng)配合使用才可顯著增加鐵皮石斛SOD活性，從而提高其抗寒性；本研究認(rèn)為適宜濃度的硅和硒復(fù)配劑（處理G4、G5、G6、G7、G8和G9）可以顯著提高鐵皮石斛SOD活性，一定程度上清除或降低低溫脅迫造成的超氧陰離子自由基的積累，從而有效緩解鐵皮石斛受到的低溫傷害。

圖4 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛SOD活性的影響

2.4.2 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛POD活性的影響 研究表明，POD是植物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的組成部分，具有抵御組織細(xì)胞發(fā)生膜脂過(guò)氧化的作用，POD活性高低與抗寒性強(qiáng)弱密切相關(guān)［23］。由圖5可以看出，不同濃度的硅和硒復(fù)配劑處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛POD活性的影響不同。其中處理G8和G7的POD活性最高，其次是G5、G6和G9，5個(gè)處理間POD活性差異不顯著，前2個(gè)處理顯著高于對(duì)照；處理G11的POD活性最低，其次是G10、G12、G2、G3和G1，6個(gè)處理間POD活性差異不顯著，均較低。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛POD活性的影響為G11＜G10＜G12＜G2＜G3＜G1＜G4＜G9＜G6＜G5＜G7＜G8。

圖5 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛POD活性的影響

復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其POD活性與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較低，顯著低于G7和G8，稍高于處理G10、G11和G12，據(jù)此可說(shuō)明，單一使用硅和硒不能使低溫脅迫下的鐵皮石斛POD活性增加，硅和硒應(yīng)配合使用才可明顯增加鐵皮石斛POD活性，POD活性的增強(qiáng)可提高鐵皮石斛的抗寒能力，緩解低溫脅迫的傷害；硅和硒復(fù)配劑可以在一定程度上提高鐵皮石斛POD活性，但復(fù)配劑的濃度過(guò)高或過(guò)低均不利于POD活性穩(wěn)定地增大，只有在濃度適宜時(shí)才可顯著提高鐵皮石斛POD活性，本研究認(rèn)為硅和硒復(fù)配劑處理G7和G8可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的POD活性。

2.4.3 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛CAT活性的影響 CAT是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，在植物脅迫應(yīng)答以及控制細(xì)胞的氧化還原平衡等方面起著重要的作用，其作用是催化H2O2分解為H2和O2［24］。

由圖6可知，不同濃度的硅和硒復(fù)配處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛CAT活性的影響各不相同。其中處理G8的CAT活性最高，其次是G5、G7、G6、G4和G9，這6個(gè)處理間CAT活性差異不顯著，均顯著高于對(duì)照（G1）；處理G1的CAT活性最低，其次是G2、G3、G11、G10和G12，6個(gè)處理間CAT活性差異不顯著，均較低。低溫脅迫下不同濃度的硅和硒復(fù)配劑對(duì)鐵皮石斛CAT活性的影響為G1＜G2＜G3＜G11＜G10＜G12＜G9＜G4＜G6＜G7＜G5＜G8。

圖6 硅和硒復(fù)配對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛CAT活性的影響

復(fù)配劑G2和G3為單一使用硅和硒的處理，其CAT活性與對(duì)照（G1）相比差異不顯著，均較低，顯著低于G4、G5、G6、G7和G8，由此可判斷，單一使用硅和硒可使低溫脅迫下的鐵皮石斛CAT活性增加，但效果不明顯，低溫脅迫下硅和硒應(yīng)配合使用才可顯著增加鐵皮石斛的CAT活性。本研究認(rèn)為適宜濃度的硅和硒復(fù)配劑（處理G4、G5、G6、G7和G8）可顯著提高鐵皮石斛CAT的活性，提高抗寒性。

3 小結(jié)與討論

本研究表明，單一使用硅和硒可在一定程度上提高低溫脅迫下鐵皮石斛的抗寒性，但效果不明顯，硅和硒應(yīng)配合使用才可以顯著減緩鐵皮石斛的低溫傷害，具體表現(xiàn)為葉綠素含量和脯氨酸含量的增加，POD、SOD和CAT增強(qiáng)，MDA活性下降。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用時(shí)捕獲光能的重要物質(zhì)，其含量的高低在某種程度上與植物的生長(zhǎng)密切相關(guān)。硅和硒復(fù)配的濃度應(yīng)適宜，過(guò)高或過(guò)低均不利于鐵皮石斛葉綠素含量的增加，本研究認(rèn)為硅和硒復(fù)配劑濃度為25 mg/L硅+10 mg/L硒、50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒時(shí)可顯著減緩低溫脅迫下鐵皮石斛葉綠素含量的下降，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。朱佳等［25］研究了不同硅處理對(duì)低溫脅迫條件下小麥幼苗光合作用、葉綠素和可溶性糖含量的影響，表明一定量濃度的Si有助于保護(hù)低溫脅迫下小麥葉綠體膜，保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高葉綠素合成速率，使小麥維持較高的葉綠素含量。張艷嫣等［19］認(rèn)為，硒處理對(duì)低溫脅迫下鐵皮石斛幼苗葉綠素降解具有緩解效應(yīng)。故硅和硒均具有在低溫脅迫下控制鐵皮石斛體內(nèi)葉綠素含量下降的作用，本研究得出了相似的結(jié)果。硅和硒復(fù)配劑濃度為50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒、50 mg/L硅+10 mg/L硒可以顯著提高低溫脅迫下鐵皮石斛的Pro含量、顯著降低MDA含量。Pro可穩(wěn)定細(xì)胞含水量，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，通過(guò)防止細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)降低低溫脅迫對(duì)鐵皮石斛造成的傷害［17］，Pro含量的增加可有效提高鐵皮石斛的抗寒性。MDA在鐵皮石斛植物體內(nèi)含量的降低可減弱膜系統(tǒng)受損程度，進(jìn)而提高鐵皮石斛的抗寒性［17］。吳燕等［3］研究認(rèn)為，外施硅可以使低溫脅迫的烏塌菜葉片迅速積累大量的脯氨酸，從而有效緩解低溫脅迫對(duì)烏塌菜幼苗的影響。張艷嫣［26］噴施硒溶液顯著提高了低溫脅迫下鐵皮石斛體內(nèi)脯氨酸含量，MDA含量平緩降低，在一定程度上提高了植物對(duì)低溫脅迫的抵抗與適應(yīng)能力。以上研究證明，硅和硒可以使低溫脅迫條件下植物體內(nèi)的MDA含量降低、Pro含量升高，與本研究結(jié)果相一致，但這些研究均是單一使用硅和硒。本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的硅和硒配合使用，在提高鐵皮石斛抗寒性方面比單一使用硅和硒效果更佳。

POD、SOD和CAT是植物在逆境條件下酶促防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，三者相互協(xié)調(diào)配合清除H2O2，使體內(nèi)自由基維持在正常的動(dòng)態(tài)水平，減少膜脂過(guò)氧化反應(yīng)，減輕細(xì)胞膜的損傷，其活性的強(qiáng)弱直接關(guān)系著植物抵御低溫傷害的能力［27］。張彩虹等［28］和孫麗［6］分別研究了硒對(duì)低溫脅迫下番茄和草莓幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響，發(fā)現(xiàn)噴施Se有效增加了低溫脅迫下植物葉片中的SOD、POD和CAT活性，有效清除了低溫傷害產(chǎn)生的H2O2。研究表明［2-5］，使用一定濃度的硅提高了低溫脅迫下的小麥、烏塌菜、黃瓜、水稻等抗氧化酶活性。本研究將硅和硒配合使用，認(rèn)為噴施25 mg/L硅+10 mg/L硒、50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒的硅和硒復(fù)配劑時(shí)可以使低溫脅迫下鐵皮石斛的抗氧化酶活性顯著增加，從而提高了低溫脅迫下鐵皮石斛清除自由基、保護(hù)細(xì)胞膜、抵御低溫傷害的能力。

綜合考慮6個(gè)生理指標(biāo)，低溫脅迫下葉面噴施濃度為50 mg/L硅+5 mg/L硒、50 mg/L硅+7.5 mg/L硒的硅和硒復(fù)配劑時(shí)，鐵皮石斛葉綠素含量、Pro含量、POD、SOD和CAT活性均顯著增加，MDA含量顯著下降，可顯著提高鐵皮石斛抗寒性，降低低溫脅迫造成的傷害。