★ 雷丹 洪滔 伍慶華 羅小泉,4 陳來,4 劉志勇,4（.江西中醫(yī)藥大學實驗動物科技中心 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院 南昌 0004；.江西中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院 南昌 0004；4.江西省中藥藥理學重點實驗室 南昌 0004）

生姜（Zingiberofficinale Roscoe）屬于姜科多年生草本植物姜的新鮮根狀莖部分，是人們喜歡用的調(diào)味品或菜肴，具有溫中止嘔、溫肺止咳、發(fā)散風寒等功效［1］，現(xiàn)在被列為藥食兩用的中藥材。化學成分分析顯示生姜中有多達100余種化學成分，分屬揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷三大類［2］。國內(nèi)外研究表明，生姜的主要藥理作用有止吐、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等［3-5］。近年來，網(wǎng)絡藥理學分析技術的出現(xiàn)，應用文本挖掘等方法建立生物信息關系網(wǎng)絡，解析網(wǎng)絡拓撲結(jié)構并進行中藥作用的多靶點預測，為新藥研發(fā)提供新思路［6-9］。在綜合中藥系統(tǒng)藥理學解析平臺（TCMSP）和batman數(shù)據(jù)庫的基礎上，應用網(wǎng)絡藥理學的分析技術對生姜的主要功能物質(zhì)進行細分，并結(jié)合功能成分分析作用靶點、有關生物信號路徑和疾病信息，研究了生姜的主要活性成分的功能及其發(fā)揮藥理作用的機制，為生姜的深入開發(fā)和多層次應用提供了科學依據(jù)。

1 資料獲得與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與處理軟件［10-16］數(shù)據(jù)庫（中藥系統(tǒng)藥理學分析與TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）；BATMAN-TCM線上解析數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）；UniProt蛋白質(zhì)通用數(shù)據(jù)庫（http：// www.uniprot. org/uploadlists/）；CTD數(shù) 據(jù)庫（http://ctdbase.org/）；蛋白質(zhì)互作平臺STRING V 10.5（https：//string-db.org/）；生物學信息注釋數(shù) 據(jù) 庫DAVID V 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）；cytoscape 3.7.2作圖軟件。

1.2 主要活性成分的收集和靶點獲取本研究通 過 檢 索TCMSP（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺）相關信息，對獲得的生姜所有活性成分數(shù)據(jù)庫進行了篩分選擇，其中篩分條件為：經(jīng)口服藥的生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30 %、藥物相似的類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18［10］；其中OB一般認為是評價藥物是否發(fā)揮藥效的一個參考指標［17］，DL代表發(fā)現(xiàn)成分與已知西藥的相似度，對確定中藥成分是否在機體產(chǎn)生作用具有重要參考意義［18］。采用 TCMSP 靶點預測模型對相關活性功能成分作用靶點加以預測,通過UniProt數(shù)據(jù)庫獲取有關作用點的DNA片段（基因）名稱。利用相關軟件建立生姜“活性功能成分-作用點”的關系圖，用互聯(lián)的拓撲學技術分析關系圖，并探討其主要功能活性物質(zhì)成分與作用點之間的關聯(lián)。

1.3 作用靶點-相關疾病網(wǎng)絡的構建將生姜主要功能物質(zhì)作用點的關聯(lián)基因?qū)氲紺TD數(shù)據(jù)線上解析平臺（tp：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫，得到與作用點有關的疾病信息，解析生姜在疾病治療中的作用，同時結(jié)合已發(fā)表的文獻研究生姜治療的主要疾病，選擇分析軟件Cytoscape 3.7.2（該軟件具有網(wǎng)絡拓撲屬性）軟件建立生姜作用點-疾病信息的關聯(lián)。在該關系結(jié)構中，代表靶作用的蛋白以節(jié)點表示，代表作用點的相互作用則以“邊”來表示。采用網(wǎng)絡分析功能，分析網(wǎng)絡的拓撲屬性，計算其“介數(shù)中心性（Betweennesscentrali-ty）”和“節(jié)點度值分布（Node de-greedistribution）” 參數(shù)［19-20］（節(jié)點度值反映了一個靶作用蛋白與其他靶作用蛋白的連接的多少，而介數(shù)則是經(jīng)過這一靶蛋白的路徑占最短路徑總數(shù)的比，度值和介數(shù)是量化指標，用以評價一個靶蛋白（節(jié)點）在網(wǎng)絡中的重要性，具有高的度值和介數(shù)值節(jié)點可以成為后續(xù)新藥的發(fā)現(xiàn)和靶點預測提供線索），故此最后利用該屬性分析來尋找生姜發(fā)揮藥效作用的主要功能成分。

1.4 相關靶蛋白相互作用網(wǎng)絡的建構為研究生姜主要活性功能成分有關靶作用蛋白之間的聯(lián)系，在STRING平臺上建立其相互作用靶蛋白之間的PPI網(wǎng)絡。在運行前需要進行有關設置，首先需要將物種設為人類（Homo sapiens），其次要將最低相互作用閥值設為中等置信度（Medium confidence），一般為0.4，其余參數(shù)的設置保持默認就可以了，然后通過軟件對PPI網(wǎng)絡進行拓撲屬性進行研究，繼而篩選并討論PPI網(wǎng)絡中的關鍵靶作用蛋白。

1.5 生物過程和通路分析基于上述結(jié)果，通過生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID 6.8，篩選出最多富集的生物學注釋。對生姜主要活性功能成分的靶基因采用KEGG數(shù)據(jù)庫進行路徑和基因本體GO的相關生物過程富集，以分析生姜主要活性功能成分作用點的主要代謝路徑及GO生物過程（結(jié)果中如P＜0.05則判為具有關聯(lián)性）。

2 結(jié)果

2.1 生姜化學成分篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選潛在的活性化合物，共獲得生姜的化學成分共265個，對其在體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄（ADME）過程中的性質(zhì)進行評價，最終以OB≥30%和DL≥0.18作為化合物篩分選擇的條件，結(jié)合CNKI文獻報道，共獲得10個活性功能成分，如豆甾醇、β-谷甾醇、6-姜酚、6-姜烯酚等。把靶點名稱輸入UniProt數(shù)據(jù)庫，獲得其相應人源靶點的基因名稱。其中二氫辣椒堿（Dihydrocapsaicin）、8-姜酚（8-gingerol）未在TCMSP平臺上查到相關作用靶點信息，因此共獲得生姜的主要活性功能成分8個，如表1所示。

表1 生姜主要活性成分基本信息

2.2 “活性功能成分-作用靶點”網(wǎng)絡圖分析將篩分出的8個活性功能成分和其相互作用的靶點通過軟件構建成網(wǎng)絡圖，如圖1所示。圖1包含82個節(jié)點（8個活性功能成分和74個相關作用靶點）和119條線，功能活性成分以圓圖標表示，相關作用靶點以三角形表示，活性功能成分與相關靶點之間的關系則以線條來表示。目前普遍認為度值和節(jié)點與活性功能成分的重要性呈正相關性的關系，值越大，相應的節(jié)點在活性成分靶點網(wǎng)絡圖中越重要［21］。圖1中，MOL000358（β-谷甾醇）的度值為38，表明這個活性功能成分的靶點共有38個，最大。MOL000449（豆甾醇）度值為31，MOL002467（6-姜酚）的度值為26，靶點較多的成分提示其在生姜的藥理作用中就可能起到關鍵作用。生姜在越來越多的研究中顯示具有抗炎、抗腫瘤等廣泛生理活性［22-23］；β-谷甾醇、豆甾醇對人肝癌細胞活性具有明顯的增殖抑制作用生姜揮發(fā)油研究進展，6-姜酚對人乳腺癌細胞遷移有明顯的抑制作用；生姜主要活性成分中MOL001771（B-谷甾醇）的度值為2，最低，可見，不同活性功能成分的作用靶點數(shù)量是不一樣，作用靶點的差異體現(xiàn)了其發(fā)揮藥理作用的強度不一樣。相關靶點ADRA1B、SCN5A、ADRB2、CHRM1的度值均為4，說明這些可能是生姜發(fā)揮整體藥效的關鍵靶點，作用靶點與多個有效成分具有相互作用關系，表明生姜發(fā)揮其藥理作用是多靶點協(xié)同作用的結(jié)果。

圖1 活性成分-靶點圖

2.3 “成份靶點-疾病”網(wǎng)絡圖分析通過CTD在線分析平臺分析成份與靶點有關的疾病， ACHE、BCL2L1、GBRA2、GBRA3、GBRA5、LACTBL1暫 時沒有找到相關的疾病信息，刪除這部分作用點，共獲得65個與疾病相關的點。通過軟件構建“成份作用靶點 - 疾病”網(wǎng)絡圖，包含65個靶作用點和34種相關疾病，共99個節(jié)點和2 271條線。圖中“V”代表相關疾病，相關靶點以方形圖代表， “線”代表活性功能成分與疾病靶點的關系，如圖2所示。34種有關疾病包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等?！俺煞葑饔冒悬c-疾病”網(wǎng)絡圖中度值較大的疾病包括腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血管疾病等，表明生姜的主要活性成分可能有利于治療腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等都有作用。其度值較大的靶作用點有PTGS2等，與其相關的疾病分別有41、40、40、39個，表明這些靶作用點在生姜治療的疾病中可以發(fā)揮比較大的作用，也體現(xiàn)了生姜治療疾病的多成分、多靶點的協(xié)同作用的特性。

圖2 靶點-疾病圖

2.4 靶作用蛋白PPI網(wǎng)絡分析生姜靶蛋白PPI聯(lián)系圖顯示有63個交匯節(jié)點（6個靶蛋白未參與蛋白的相互作用分析）、反應作用連線300條。經(jīng)計算，PPI 聯(lián)系圖中度值平均為10.526，介數(shù)平均為0.025。進一步把度值、介數(shù)都排序在前1/3的作用蛋白（排名前19的作用蛋白）建立交集，區(qū)分出度值高、介數(shù)大的作用蛋白共有9個，提示這些作用靶蛋白是生姜發(fā)揮治療作用的PPI關系網(wǎng)絡中的關鍵靶作用點，在該關系圖中發(fā)揮了關鍵作用。關鍵作用點及拓撲參數(shù)見表2。

表2 生姜靶蛋白PPI關系圖中的關鍵作用點及其拓撲參數(shù)

2.5 代謝通路 KEGG分析生姜主要功能功能成分中67個作用基因中有59個富集在KEGG代謝通路中，牽涉74條KEGG代謝通路，其中P≤0.05 的信號通路有65條，將相關性排序前十的生物功能如表3所示?；驍?shù)目較多的主要代謝通路有：癌癥信號通路、尿液配體-受體相互作用、乙型肝炎、Ca2+信號通路、癌中的蛋白聚糖代謝、3K-Akt信號通路、酒精性脂肪肝?。∟AFLD）、MP信號通路、視光、直腸癌、嗎啡成癮、可卡因成癮、甲狀腺激素信號通路、心肌細胞中的神經(jīng)信號、PK信號通路，另有P＞0.05的茶堿和其他因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收、ll樣受體信號通路、子宮癌、卵母細胞跨內(nèi)皮遷移、D樣受體信號通路、Tural殺傷細胞介導的細胞毒性、花生四烯酸代謝等信號通路,但這些通路在其他文獻中報道也與生姜治療疾病的過程有關。由此可見，生姜具有通過調(diào)節(jié)多條代謝通路的能力進而發(fā)揮治療疾病的作用。

表3 生姜主要活性功能成分代謝通路與相關靶基因

2.6 GO生物過程分析將上述得到的74個靶點輸入到DAVID數(shù)據(jù)庫中，通過生物學功能富集以分析其生物學過程。共得到212條生物過程，其中有顯著差異的生物過程共有159條，將排序前十的相關性生物功能列入表4所示。GO分析生姜相關靶點的生物學功能分布發(fā)現(xiàn)，主要影響的生物過程有與藥物反應、AC激活腎上腺素能受體信號通路、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、與雌二醇反應、突觸傳遞（膽堿能）、平滑肌收縮的正調(diào)控、AC抑制G蛋白偶聯(lián)乙酰膽堿受體信號通路、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體信號通路、與脂多糖反應、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等。

表4 生姜主要活性成分GO生物過程與靶基因

3 討論

網(wǎng)絡藥理學能在一定程度上反映生物大分子與化學成分之間的相互作用,通過網(wǎng)絡藥理學方法篩選出中藥更有效的活性成分,能夠為更有針對性的中藥研究提供基礎［25］。生姜是一種姜科藥食兩用的中藥,具有具有解表散寒、溫中止嘔、化痰止咳等功效,臨床常用于治療治風濕痛、腰腿痛，胃、十二指腸潰瘍，瘧疾，急性細菌性痢疾，急性睪丸炎等，還具有止吐、抗腫瘤、抗氧、抗菌、抗過敏、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用［1］。為進一步闡述中藥生姜的藥理作用及其作用機制,借助TCSMP分析平臺,以ADME的參數(shù)OB、DL為閾值,篩選出生姜中具有較好OB、DL的優(yōu)效化合物,并構建了化合物-靶點網(wǎng)絡,探索生姜的優(yōu)效化合物與靶點之間的關系,并對靶點進行了基因水平的功能注釋。為生姜的優(yōu)效化合物所對應的多靶點、多途徑的藥理作用機制提供了研究基礎。

生姜的成分復雜,通過篩選得出的分子靶標可能是生姜發(fā)揮藥理機制的關鍵物質(zhì)基礎。研究證實，生姜的主要活性成分6-姜酚和6-姜烯酚可以通過不同的機制觸發(fā)胃癌腫瘤細胞的凋亡［26］。β-谷甾醇（beta-sitosterol）是植物甾醇類成分之一，存在于某些植物藥中，具有降血脂、抗癌、抗炎癥等作用，目前β-谷甾醇已應用到醫(yī)藥行業(yè)中［27］。且β-谷甾醇、豆甾醇（Stigmasterol）還被研究表明具有抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖和誘導細胞凋亡的抗腫瘤作用［28］。姜酮（zingerone）是生姜及其制品中清除自由基的一種有效成分［29］。10-姜酚（10-gingerol）能劑量依賴性的抑制肝癌HepG2細胞的增殖，抑制Src及其下游的STAT3的激活［30］。說明生姜的優(yōu)效成分篩選方法的可行性，且生姜可通過這些優(yōu)效成分從而治療如癌癥、炎癥、心血管等疾病及發(fā)揮抗氧化作用。

化合物-靶點網(wǎng)絡中的靶點共有65個與疾病有關,進一步將生姜的靶點進行PPI分析得到9個關鍵靶點,包括TP53、CASP3、JUN、MMP9、RELA、PPARG、HSP90AA1、ACHE、MAOA等。提示生姜可能通過優(yōu)效化合物與篩選出的關鍵靶點相互作用從而對疾病起到治療作用。TP53，也稱p53，通過調(diào)節(jié)凋亡、細胞生長，影響腫瘤血管的生成等過程發(fā)揮抗癌的作用，并在基因組穩(wěn)定性中起作用［31］。CASP3（Caspase 3）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，CASP3被發(fā)現(xiàn)對于正常的大腦發(fā)育是必需的，并且在細胞凋亡中也起著典型的作用，它負責染色質(zhì)的濃縮和DNA片段化［32］。JUN是一種蛋白質(zhì)編碼基因，相關疾病有百日咳和肉瘤，途徑包括ATM途徑以及理化特性與毒性相關途徑，其編碼的蛋白c-jun，水平的周期性變化在腺上皮細胞的增殖和凋亡中具有重要意義［33］。MMP9（Matrix Metallopeptidase 9）為MMP家 族的一員，MMP家族是一類金屬蛋白酶是鈣依賴性鋅含內(nèi)肽酶，其在正常的生理過程中參與細胞外基質(zhì)的分解，例如胚胎發(fā)育、繁殖、血管生成、骨骼發(fā)育、傷口愈合、細胞遷移、學習和記憶、以及病理過程如關節(jié)炎、腦出血和轉(zhuǎn)移［34-35］。RELA，也稱為p65，是一種與REL相關的蛋白，參與NF-κB異二聚體的形成，核易位和激活，已經(jīng)研究證明RELA可調(diào)節(jié)免疫應答，并且RELA的活化與多種類型的癌癥正相關［36］。PPARG（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）是一種蛋白質(zhì)編碼基因，與其相關的疾病包括脂肪營養(yǎng)不良、家族性疾病、頸動脈內(nèi)膜—中層厚度。HSP90AA1（Heat Shock Protein 90 Alpha Family Class A Member 1）基因在大多數(shù)腫瘤中沒有改變,目前發(fā)現(xiàn)膀胱癌的改變次數(shù)最多,其次是胰腺癌,在許多腫瘤中，HSP90AA1基因是純合缺失的，這表明這些腫瘤可能具有降低的惡性程度［37-38］。ACHE（Acetylcholinesterase），也稱酰水解酶，是體內(nèi)的主要膽堿酯酶。它是一種酶的是催化的擊穿乙酰膽堿和其他一些的膽堿該函數(shù)酯作為神經(jīng)遞質(zhì)，主要存在于神經(jīng)肌肉接頭和膽堿能型化學突觸中，其活性可終止突觸傳遞，是神經(jīng)毒劑和殺蟲劑等有機磷化合物抑制的主要靶點。MAO-A是正常大腦功能的關鍵調(diào)節(jié)劑。它可通過氧化脫氨作用降解胺類神經(jīng)遞質(zhì)，例如多巴胺，去甲腎上腺素和5-羥色胺，能夠以應對諸如缺血和炎癥等應激反應［39］。說明生姜可能是調(diào)控這些核心基因或者網(wǎng)絡中的其他基因從而調(diào)控如癌癥、炎癥、心血管疾病、行為和神經(jīng)疾病等。

GO與KEGG分析提示生姜的生物功能主要富集在藥物反應、AC激活腎上腺素能受體信號通路、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、與雌二醇反應、突觸傳遞（膽堿能）、平滑肌收縮的正調(diào)控的過程。通路主要富集于癌癥信號通路、尿液配體-受體相互作用、乙型肝炎、Ca2+信號通路、癌中的蛋白聚糖代謝、3K-Akt信號通路、酒精性脂肪肝?。∟AFLD）、PK信號通路等相關通路。其中，癌癥信號通路不僅在KEGG為顯著性較高的通路，p53和RELA、HSP90AA1等癌癥相關蛋白在PPI網(wǎng)絡中也處于中心地位，且PPI網(wǎng)絡中中心靶點CASP3和MMP9是細胞凋亡和遷移通路的主要蛋白，說明生姜可能是通過調(diào)控這些靶點，從而促腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞的遷移等，而起到抗腫瘤的作用。

4 結(jié)論

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的技術與方法，描繪了生姜多種功能成分-多作用靶點的網(wǎng)絡關系，再次印證了中藥起效是通過“多成分、多靶點”作用的特點。同時這個方法可以繼續(xù)用于虛擬篩選生姜有效物質(zhì)并發(fā)現(xiàn)其作用靶點，進一步闡明生姜活性功能成分、作用靶點、影響通路之間相互作用關系，對于發(fā)現(xiàn)生姜及其活性功能成分可以通過多個作用靶點、多條代謝通路發(fā)揮藥理藥效作用，為進一步研究生姜藥理藥效機制提供理論依據(jù)。但我們這次的研究也有不足之處，目前工作僅是基于數(shù)據(jù)庫的分析，通過數(shù)據(jù)搜集獲取的資料對藥物的功效進行預測，后續(xù)要更深入了解生姜的藥效物質(zhì)還需要設計一些試驗加以驗證；此次分析的方法,也只是通過OB和DL的篩分為條件,與生姜的實際吸收情況有一定的差距,也存在著一定的限制，因為藥物的吸收利用不僅僅局限于口服，而且口服生物利用度低的成分也需要重視起來，恰恰是這些成分可能存在更廣泛的治療作用，但本研究為生姜藥用價值的進一步合理開發(fā)提供了一個思路。