劉殿勇，張帥，許亞坤，高莉娟，楊進益，魏偉

（大連醫(yī)科大學 1.附屬大連市兒童醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116012；2.附屬大連市友誼醫(yī)院泌尿外科，遼寧 大連 116100）

腎乳頭狀細胞癌（papillary renal cell carcinoma，PRCC）是腎癌的第二常見類型，約占腎癌病例總數(shù)的15%～20%［1］。PRCC是一種異質(zhì)性疾病，其潛在的分子機制還不完全清楚［2］。此外，靶向治療對晚期PRCC患者的療效尚不確定。目前，人們對確定PRCC患者預后的最佳風險基因特征尚未達成共識［3］。因此，迫切需要尋找新的預后生物標志物和治療靶點來提高PRCC患者的生存率。

隨著高通量基因檢測技術的發(fā)展，生物醫(yī)學大數(shù)據(jù)被廣泛應用［4-5］。從單個樣本中收集大量的基因組信息，從而可以識別新的預后、預測或藥效生物標志物［6］。目前，基因表達水平的微陣列或RNA測序數(shù)據(jù)常用于通過Cox風險回歸模型構建新的預后特征。通過微陣列和測序方法以及可用的開放存取數(shù)據(jù)庫如癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA），已經(jīng)在PRCC等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)生物標志物，為在全球基因水平上篩選預后基因提供了機會［7］。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫中PRCC患者的基因表達譜數(shù)據(jù)和臨床信息，對正常人和PRCC患者的基因進行差異分析，基于差異基因篩選與患者生存顯著相關的基因，并進一步探討該基因是否能成為新的PRCC預后標志物，為PRCC患者的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人膠質(zhì)瘤細胞系SK-RC-39（中國科學院上海細胞所）。

1.1.2 主要試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（天津市灝洋生物制品科技有限責任公 司）；TRIzol試 劑、Lipofecamine 2000、cDNA-TERT和陰性對照（美國Invitrogen公司）；PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及 SYBR PCR Master Mix（寶生物工程有限公司）；MTT試劑（美國Sigma公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：細胞用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)和傳代。按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明進行cDNA轉(zhuǎn)染，誘導TERT過表達。

1.2.2 Western blotting：將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染TERT的細胞培養(yǎng)48 h后，裂解并提取蛋白，檢測TERT蛋白的表達。

1.2.3 MTT方法檢測細胞增殖：將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染TERT的細胞在96孔板中按照5×103/孔進行鋪板，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，加入MTT（5 mg/mL），隨后溶于DMSO（100 μL/孔），酶標儀檢測各孔吸光度值（490 nm波長），實驗重復3次。

1.3 生物信息學分析

通過TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//cancergenome.nih.gov）下載PRCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，包含289例PRCC患者和32例正常人。排除5例無總體生存期（overall survival，OS）的患者樣本，共有284例PRCC患者樣本納入分析?；虮磉_值以每100萬標記讀本中每千堿基外顯子的讀本數(shù)進行估算。此外，不同樣本間通過中位數(shù)法進行標準化處理。RNA-seq原始數(shù)據(jù)集用R語言edgeR包進行處理，對原始數(shù)據(jù)進行背景校正、標準化。錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discover rate，F(xiàn)DR）＜0.05視為差異有統(tǒng)計學意義。

將差異基因投入到單因素Cox風險回歸分析中，進一步利用R語言survival包繪制Kaplan-Meier曲線，通過log-rank檢驗TERT低表達和高表達2組患者的生存時間有無統(tǒng)計學差異。然后利用R語言pROC包繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，篩選出與PRCC患者OS相關的獨立預后基因。此外，將臨床病理參數(shù)（TNM分期、性別和年齡）作為協(xié)變量進行單因素和多因素Cox風險回歸分析，鑒定獨立預后風險因素。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad 7.0和SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，2組比較采用Student’st檢驗。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 初步篩選出16個生存相關差異基因

從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載PRCC患者的基因表達譜數(shù)據(jù)和臨床信息。通過對284例PRCC患者和32例正常人基因進行差異分析，采用嚴苛的標準篩選出74個差異表達的基因（log FC＞5，F(xiàn)DR＜0.05），見圖1A。經(jīng)過進一步Cox風險回歸分析，發(fā)現(xiàn)這74個差異基因中有16個與患者生存相關（P＜ 0.05），見圖1B。其中14個基因風險比（hazard ratio，HR）＞1，表明隨著基因表達量增加，患者死亡風險增加。

圖1 初步篩選出16個生存相關差異基因Fig.1 Preliminary screening of 16 survival related genes

2.2 生存相關差異基因的預后分析

基于Kaplan-Meier生存曲線，進一步分析16個基因的表達水平與PRCC患者OS的相關性。結(jié)果提示，只有TERT基因和VSTM2L基因的表達水平與PRCC患者OS相關。TERT高表達與PRCC患者OS較短相關（P=0.009，圖2A），且ROC曲線表明，TERT基因可以準確預測患者的預后［曲線下面積（area under the curve，AUC）=0.713］。而VSTM2L基因的表達水平雖然與PRCC患者OS相關（P=0.004），但ROC曲線表明，VSTM2L基因不能準確預測患者生存（AUC=0.381）。以上結(jié)果表明，TERT基因可以準確預測PRCC患者預后。

圖2 TERT基因和VSTM2L基因?qū)RCC患者生存的預測作用Fig.2 The survival predictive effect of TERT and VSTM2L genes in PRCC patients

2.3 TERT基因?qū)RCC的獨立預后作用

與正常人相比，PRCC患者中TERT基因表達增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3A。PRCC患者中，隨著TERT表達量增加，患者生存時間縮短，死亡人數(shù)增加，這與之前證明的TERT是風險因素（HR＞1）的結(jié)果一致。隨后，為了證實TERT基因不受臨床因素影響，可以作為獨立風險因素預測患者的預后，將TERT基因及臨床病理參數(shù)（TNM分期、性別和年齡）投入到單因素Cox風險回歸分析中，發(fā)現(xiàn)TERT基因（P=0.029，圖3C）、N分期（P=0.001，圖3C）和T分期（P＜ 0.001）與PRCC患者OS顯著相關。多因素Cox回歸分析結(jié)果提示，TERT基因（P=0.005，圖3D）和N分期（P=0.011，圖3D）具有獨立預測PRCC患者OS的潛在作用，TERT高表達提示PRCC患者具有高死亡風險。

圖3 TERT基因?qū)RCC的獨立預后作用Fig.3 Independent prognostic effect of TERT gene on PRCC

2.4 誘導PRCC細胞中TERT表達后增殖活性增加

上述結(jié)果提示TERT在PRCC中可能發(fā)揮促癌基因作用，進一步通過細胞實驗進行驗證。將cDNATERT轉(zhuǎn)染至SK-RC-39細胞中，Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染組比較，細胞轉(zhuǎn)染cDNA-TERT后TERT表達明顯增加（圖4A），即有效誘導細胞中TERT高表達。接下來，通過MTT方法檢測細胞增殖水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TERT基因過表達可使SK-RC-39細胞增殖活性增加（圖4B），提示TERT可能通過調(diào)控細胞增殖活性發(fā)揮促癌作用。

圖4 TERT過表達對PRCC細胞細胞增殖的影響Fig.4 Effect of TERT overexpression on proliferation of PRCC cells

3 討論

PRCC是第二常見腎癌類型，但由于病例數(shù)有限，關于PRCC的分子機制研究和隨機臨床試驗很少［8］。因此，與PRCC進展相關的分子機制尚不清楚［9］。盡管目前臨床存在多種PRCC治療方法，但患者預后不良［10］。因此，迫切需要尋找有效的預后生物標志物，以便準確預測預后，提高PRCC患者的生存率。

近10年來，RNA測序及基因芯片等技術不斷成熟，其準確度和精確度都大幅提高，形成了癌癥相關的大數(shù)據(jù)［5，11］。利用生物信息學手段挖掘這些大數(shù)據(jù)，可以方便地找到可能與PRCC發(fā)生、發(fā)展相關的基因。與傳統(tǒng)研究相比，更加經(jīng)濟且有效地縮短了研究周期。目前，已有多篇文獻［12-15］基于生物信息學對PRCC進行預后分析。

本研究中，基于PRCC患者和正常人的基因表達數(shù)據(jù)，初步篩選出74個差異表達基因。進一步采用單因素Cox風險回歸分析，篩選出16個基因與患者生存相關。隨后，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)只有TERT基因（P=0.009）和VSTM2L基因（P=0.004）可以預測患者生存。但是ROC曲線證實，僅TERT基因可以準確預測PRCC患者預后（TERT：AUC=0.713；VSTM2L：AUC=0.381），即TERT高表達患者的OS較TERT低表達患者明顯縮短。對臨床因素進行單因素和多因素Cox風險回歸分析發(fā)現(xiàn)，TERT（P=0.005）和N分期（P＜ 0.001）是PRCC患者的獨立預后因素。

總之，本研究系統(tǒng)證明了TERT基因與PRCC進展顯著相關。TERT基因可以準確、獨立地預測PRCC患者的預后。本研究結(jié)果表明，TERT基因是PRCC潛在的診斷和預后生物標志物，為今后對PRCC的基礎研究和臨床輔助治療提供了參考。但本研究僅基于生物信息學分析，需要更大樣本的同類數(shù)據(jù)進行驗證，并同時開展相關的臨床和基礎實驗，以確認這些指標的穩(wěn)定性和實用性。