李坤淋，周豪坤，李全鑫，李 楊

(1.重慶醫(yī)科大學 中醫(yī)藥學院，重慶 400016；2.浙江中醫(yī)藥大學 基礎(chǔ)醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；3.重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院，重慶 400700)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種累及全身的多系統(tǒng)、多臟器、病程遷延反復的慢性自身免疫性疾病，多發(fā)于育齡期女性，屬結(jié)締組織病范疇[1]。近幾十年來，該病的治療取得了一定進展，但是目前可用的藥物如糖皮質(zhì)激素等尚不能很好地控制疾病，并且常受到脫靶效應(yīng)的限制[2]。中醫(yī)古籍對本病早有記載，古代醫(yī)家多根據(jù)其臨床表現(xiàn)及特征將其命名為“面游風”“茱萸丹”“馬纓丹”等，中醫(yī)藥治療該病具有一定特色和優(yōu)勢，運用恰當?shù)闹委煼椒?，可大大減少藥物產(chǎn)生的副反應(yīng)，提高療效。

芍藥之名始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[3]，經(jīng)歷代醫(yī)家發(fā)展運用，后逐漸分化為赤芍與白芍兩種，均為臨床常用中藥。赤芍、 白芍雖為兩種藥物，但性味相近，且來源皆為毛茛科芍藥的干燥根，二者化學成分有諸多相似之處，由于原植物生長環(huán)境、藥材加工方法以及飲片炮制工藝等方面的不同，所以導致功用各有偏重[4]?，F(xiàn)代研究表明，在臨床治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡方面，赤白二芍不論是單用或是合用都可在多個環(huán)節(jié)影響系統(tǒng)性紅斑狼瘡的細胞免疫、體液免疫以及炎癥過程，取得較好療效[5-6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是基于網(wǎng)絡(luò)生物學基礎(chǔ)，結(jié)合現(xiàn)有的多藥理學基礎(chǔ)，對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號節(jié)點對多靶點藥物分子設(shè)計的一門新型學科[7]。而網(wǎng)絡(luò)藥理學系統(tǒng)性、整體性的網(wǎng)絡(luò)研究理念與中藥復方“多成分、多層次、多靶點、多通路”的調(diào)節(jié)模式和作用特點相似，為中醫(yī)中藥“病-證-方”研究提供了新技術(shù)與方法[8]。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法，本研究深入探討了赤芍、白芍治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的潛在作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 赤芍-白芍藥對有效活性成分的挖掘與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)進行成分的查詢及篩選，分別以“赤芍”“白芍”作為檢索條件，得到各自相應(yīng)成分，再進行ADME參數(shù)設(shè)置，以口服吸收利用度(OB)≥30%，藥物相似性(DL)≥0.18作為篩選條件，結(jié)合文獻學研究方法，獲取赤芍、白芍的有效活性成分。

1.2 活性成分作用靶點預測

將收集到的有效活性成分的化學名分別輸入PubChem數(shù)據(jù)庫，即有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，以獲得其SMILE結(jié)構(gòu)。對于PubChem數(shù)據(jù)庫中沒有收錄的成分，則先在TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載該化合物的MOL2結(jié)構(gòu)文件，再將MOL2文件鍵入到在線計算網(wǎng)站ALOGPS 2.1(Computational Chemistry Laboratory，http：//www.vcclab.org/lab/alogps)進行SMILE結(jié)構(gòu)的計算，以獲取該化合物的SMILE結(jié)構(gòu)。將得到的SMILE結(jié)構(gòu)整合后，分別輸入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http：//www.swisstargetprediction.ch/)進行有效成分靶點預測，剔除沒有預測靶點的成分，從而獲取芍藥的潛在生物學靶點及靶點的相關(guān)信息。

1.3 系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病靶點獲取

主要利用TTD和Drugbank兩個數(shù)據(jù)庫。在TTD(https：//db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)頁上下載“TTD all target date”和“TTD 自轉(zhuǎn)UNIPROT ID”文件，利用excel的查找和篩選功能，獲得系統(tǒng)性紅斑狼瘡的部分相應(yīng)靶點和Uniprot號。在Drugbank數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)頁檢索框中輸入“systemic lupuseryth ematosus”，獲得SLE靶點的名稱，再借助Uniprot數(shù)據(jù)庫的“Retrieve/ID mapping”功能，將獲得的靶點名稱校正為Uniprot號，以便后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計和處理。將兩個數(shù)據(jù)庫獲得的靶點整合，得到系統(tǒng)性紅斑狼瘡相應(yīng)的疾病靶點。

1.4 赤芍、白芍成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓撲分析

將上述獲得的成分靶點和疾病靶點通過Uniprot號進行映射，得到二者的交集靶點，再借助Uniprot數(shù)據(jù)庫的“Retrieve/ID mapping”功能將這些靶點的Uniprot號校正為基因名，從而解決藥物靶點存在的名稱不規(guī)范等問題。把得到的有效活性成分和基因名稱用Excel進行整合，繪制成分疾病靶點三列表，將其導入Cytoscape3.6.0軟件，建立“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。在該網(wǎng)絡(luò)圖中，Node(節(jié)點)表示活性成分和靶點，Edge(邊)表示成分與靶點相互作用的關(guān)系。并借助Cytoscape3.6.0軟件中的Network Analyzer功能進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析來評價活性成分和靶點的重要性。

1.5 Metascape基因列表分析

Metascape數(shù)據(jù)庫(http：//metascape.org/)可提供自動化元分析工具和一鍵式Express Analysis輸出，并支持基于BioGrid(https：//thebiogrid.org/)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析，基因本體論(GO)網(wǎng)絡(luò)的交互式可視化和富集熱圖生成[9]。將前面得到的映射靶點名稱鍵入到Metascape的輸入框中創(chuàng)建基因列表，物種選擇為“Homo Sapiens”，點擊Express Analysis得到Metascape基因列表分析報告的各項輸出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 赤芍、白芍有效活性成分

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫以及相關(guān)文獻報道[10-11]，剔除無預測靶點的活性成分，最終得到包括芍藥苷、單萜糖苷在內(nèi)的21種重要有效活性成分，其中赤芍16個，白芍8個，二者共同有效成分3個，分別是谷甾醇、β-谷固醇和芍藥苷，說明二芍之間具有一定的協(xié)同作用。結(jié)果見表1。

表1 赤芍、白芍的有效活性成分

2.2 芍藥活性成分作用靶點預測和SLE疾病靶點

將通過PubChem數(shù)據(jù)庫或通過ALOGPS 2.1計算所得的有效成分的SMILE結(jié)構(gòu)輸入到SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測作用靶點，經(jīng)過Excel去重總計得到成分靶點608個。借助TTD和Drugbank兩個數(shù)據(jù)庫，整理得到疾病靶點總計114個。將成分靶點和疾病靶點進行映射，得到二者交集靶點38個，說明這些靶點為赤芍、白芍直接作用于SLE的靶點。見表2。

2.3 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓撲分析

將得到的芍藥有效成分與交集靶點數(shù)據(jù)輸入到Excel中構(gòu)建成分靶點關(guān)系三列表，將其導入Cytoscape 3.6.0軟件繪制成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，在該網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點代表成分和交集靶點，邊代表二者之間的關(guān)系，總計得到59個節(jié)點，170條邊，見圖1。借助Cytoscape 3.6.0件中的Network Analyzer功能對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲分析，發(fā)現(xiàn)其中Degree值靠前的5個成分分別是δ(7)-甾烯醇、喜樹堿、樺木酸、菠菜甾醇和黃芩素，其Degree值分別為12、12、12、11、10。而Degree值前5的靶點為CYP19A1、BCHE、PTGS2、ABCB1和CYP2C19，其Degree值分別為14、12、11、11、9。

表 2 芍藥與SLE的交集靶點

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析

將得到的38個交集靶點的基因名輸入到Metascape數(shù)據(jù)庫進行基因列表分析，從報告中提取蛋白質(zhì)相互作用富集分析的CYS文件，導入到Cytoscape3.6.0軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析。該PPI網(wǎng)絡(luò)總共包含27個節(jié)點，54條邊，分為3個模塊，見圖2。網(wǎng)絡(luò)拓撲分析顯示Degree值排名靠前的5個靶點為CYP3A4、CYP2C9、HSPA5、MAPK3、和CYP2C19，說明這些靶點在PPI網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用，提示這些靶點在芍藥調(diào)控SLE的作用中具有較大意義。應(yīng)用分子復合物檢測(MCODE)算法識別提取富集程度較高的2個子網(wǎng)絡(luò)組件，見圖3。MCODE子網(wǎng)絡(luò)組件1主要參與的生物過程為細胞色素P450-底物型排列、Ⅰ-化合物的官能化和類固醇代謝過程；MCODE子網(wǎng)絡(luò)組件2主要參與的生物過程為細胞對饑餓的反應(yīng)、細胞對金屬離子的反應(yīng)和饑餓反應(yīng)，見表3。

圖 3 MCODE子網(wǎng)絡(luò)

表3 相應(yīng)組件的功能描述

2.5 基因本體論(GO)分析和KEGG富集熱圖

提取Metascape基因列表分析中的GO分析和KEGG通路分析，在該分析報告中，采用了基于累積的超幾何分布計算P值，并使用Banjamini-Hochberg程序計算q值以說明多次測試[12]，從而收集P值<0.01，最小計數(shù)為3，富集因子>1.5的術(shù)語。GO分析顯示，這些靶點主要參與的生物過程有類固醇代謝過程、對外源刺激的反應(yīng)、對細菌起源分子的反應(yīng)等；KEGG通路分析表明這些靶點基因主要參與調(diào)控的通路有抗葉酸抵抗、ABC轉(zhuǎn)運蛋白和卵巢類固醇生成等通路，見表4。挑選具有代表性的富集術(shù)語的前20個集群構(gòu)建條形圖以更好地展示他們之間的聯(lián)系，見圖4。為了進一步捕獲術(shù)語之間的關(guān)系，Metascape選擇了富集術(shù)語的子集并將其呈現(xiàn)為網(wǎng)絡(luò)圖，將其中相似性>0.3的術(shù)語通過邊連接。從20個聚類中的每個聚類中選擇具有最佳P值的項，并限制每個聚類不超過15個項，且合計不超過250個。將CYS文件導入Cytoscape3.6.0軟件對標簽進行著色調(diào)整，見圖5。

圖4 按P值大小著色的富集術(shù)語條形圖

表 4 GO分析和KEGG通路分析富集結(jié)果

3 討論

目前對SLE的治療目標主要為控制疾病活動、減少合并癥和藥物毒性，以確?；颊吣軌蜷L期存活，并防止器官損傷，從而改善患者生活質(zhì)量[13]。中醫(yī)藥講究“整體觀”診療模式，對SLE患者的管理具有獨特優(yōu)勢，可顯著提高患者預后和生活質(zhì)量。二芍自古便是中醫(yī)醫(yī)師常用藥物，白芍柔肝止痛、平抑肝陽；赤芍清熱涼血、散瘀止痛，均可用于系統(tǒng)性紅斑狼瘡的對癥治療。

注：(a)用集群ID著色，其中共享相同集群ID的節(jié)點通常彼此靠近；(b)用P值著色，其中包含更多基因的術(shù)語傾向于具有更重要的P值。

本次研究共篩選出21種重要有效活性成分，網(wǎng)絡(luò)拓撲分析顯示，δ(7)-甾烯醇、喜樹堿、樺木酸等有效成分的Degree值較高，說明這些化合物具有重要的調(diào)節(jié)作用。例如樺木酸能提高機體的抗氧化能力、增強免疫力，在機體的抗氧化損傷和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用[14]。而喜樹堿作為世界上第三大植物抗癌藥，喜樹堿及其多種衍生物對于免疫調(diào)節(jié)亦具有較好療效，羥基喜樹可堿通過降低Dnmt1基因表達水平，下調(diào)p16基因啟動子的甲基化水平，從而增加SLE患者單個核細胞(PBMC)中p16表達水平[15]。加用白芍總苷治療SLE患者時可明顯改善患者相關(guān)癥狀和免疫功能[16]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷作為二芍的共同化合物，亦具有重要的調(diào)節(jié)作用，而芍藥苷在白芍總苷中往往占到90%以上，從而進一步驗證了二芍對于SLE的療效。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析顯示，Degree值較高的靶點有CYP3A4、HSPA5、MAPK3等。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是信號從細胞表面?zhèn)鲗У郊毎藘?nèi)部的重要傳遞者，對參與T細胞信號轉(zhuǎn)導和自身免疫反應(yīng)具有重要作用[17]。SLE患者外周血單個核細胞(PBMCs)的磷蛋白組學分析顯示，MAPK通路含差異的磷酸化位點最多[18]，說明MAPK相關(guān)靶點在SLE疾病的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。

根據(jù)GO分析可以得知，二芍主要通過參與調(diào)節(jié)免疫、控制炎癥等過程進行調(diào)控。MCODE子網(wǎng)絡(luò)顯示，P值最高的生物學過程為細胞色素P450-底物型排列，細胞色素P450酶中的CYP2E1與腦部疾病的關(guān)系密切，SLE患者常合并神經(jīng)系統(tǒng)病變?nèi)缁杳?、腦卒中等，因此可以推測在針對治療有腦部病變的SLE患者時，配伍二芍進行治療或許可以取得一定療效。

KEGG通路富集分析表明，赤芍、白芍主要通過抗葉酸抵抗、ABC 轉(zhuǎn)運蛋白、癌癥MicroRNAs、卵巢類固醇生成等通路參與調(diào)控，發(fā)揮其抗SLE作用。葉酸對于DNA復制至關(guān)重要，細胞內(nèi)葉酸輔因子在炎性自身免疫性疾病和癌癥生物學中具有重要作用，說明該通路對于SLE的調(diào)節(jié)較為重要。ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白催化轉(zhuǎn)運反應(yīng)，例如微量營養(yǎng)素對細菌的高親和力吸收以及細胞毒性化合物從哺乳動物細胞中的輸出[19]。有研究表明，血清P-糖蛋白水平與SLE與疾病活動性之間具有一定聯(lián)系[20]，可見通過調(diào)控該蛋白通路，可以影響SLE的疾病活動度。

綜上所述，赤芍、白芍對于SLE的調(diào)控具有多成分、多靶點、多通路、多層次的特點。本研究總計得到21種有效活性成分、38個作用靶點、相關(guān)生物學過程14個、相關(guān)通路6條，有些靶點或通路已被證實在SLE的發(fā)揮中具有重要作用。但通過網(wǎng)絡(luò)藥理學研究方法仍具有一定限制，可能存在忽視二芍配伍前后的活性成分差異、作用靶點的功能還需要實驗驗證支持等。因此，本研究為中藥二芍的研究提供了預測性思路，可為今后設(shè)計體內(nèi)體外驗證試驗提供參考。