毛邱嫻 熊美麗 王文珍 林岱華

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，每年造成全球約7.6萬(wàn)名女性死亡，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]。雖然很多患者可以通過(guò)各種影像技術(shù)及早發(fā)現(xiàn)無(wú)癥狀的子宮內(nèi)膜癌，或其他技術(shù)早期診斷[2]。通過(guò)手術(shù)治療結(jié)合放化療可取得較好的預(yù)后，但部分患者容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，很難治愈，死亡率高[3]。因此，探討識(shí)別子宮內(nèi)膜癌惡化進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的可靠生物學(xué)標(biāo)志，不僅可為判斷疾病預(yù)后、指導(dǎo)個(gè)性化治療提供參考，還可為發(fā)展新的治療靶點(diǎn)和治療手段提供線索，具有重要的臨床意義。

腫瘤進(jìn)展的重要機(jī)制之一是免疫逃逸，逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)控后，腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為包括增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移將會(huì)進(jìn)一步加快[4-5]。CD47是一種新的免疫抑制信號(hào)分子，在腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制中發(fā)揮重要作用。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(Signal regulatory protein α，SIRPα)是CD47的重要配體，健康細(xì)胞通過(guò)廣泛表達(dá)CD47，與巨噬細(xì)胞上的SIRPα結(jié)合，產(chǎn)生“不要吃我”信號(hào)，阻止巨噬細(xì)胞吞噬健康細(xì)胞。然而這一機(jī)制被狡猾的腫瘤細(xì)胞利用。CD47在多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，與SIRPα結(jié)合啟動(dòng)抑制性信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避巨噬細(xì)胞的吞噬作用[6-7]。因此，阻斷CD47-SIRPα信號(hào)的腫瘤免疫治療具有很好的應(yīng)用前景。

關(guān)于CD47在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和作用的研究報(bào)道罕見(jiàn)。Gu等[8]曾報(bào)道CD47在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)升高，阻斷CD47不僅可以激活巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向腫瘤募集，還可限制腫瘤的生長(zhǎng)。但CD47與子宮內(nèi)膜癌惡性程度和預(yù)后的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道，CD47在子宮內(nèi)膜癌的作用機(jī)制仍有待深入挖掘。本研究擬通過(guò)綜合分析TCGA、GEO和THPA數(shù)據(jù)庫(kù)中子宮內(nèi)膜癌的基因和蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床資料，探討CD47在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況及其與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步理解CD47在子宮內(nèi)膜癌中的作用機(jī)制提供線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 GEO數(shù)據(jù)集 以“Endometrial cancer”為關(guān)鍵詞，在GEO官網(wǎng)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索相關(guān)數(shù)據(jù)集，最終選取同時(shí)具有正常子宮內(nèi)膜組織和腫瘤組織表達(dá)數(shù)據(jù)的三個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)進(jìn)行差異表達(dá)分析。

1.1.2 THPA數(shù)據(jù)庫(kù) 以“CD47”為關(guān)鍵詞，在THPA官網(wǎng)(https://www.proteinatlas.org/)檢索CD47在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行整理分析。

1.1.3 TCGA數(shù)據(jù)集 使用R語(yǔ)言RTCGA包從TCGA官網(wǎng)(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下載子宮內(nèi)膜癌(n=541)的基因表達(dá)和臨床數(shù)據(jù)(包括生存資料和腫瘤分級(jí)信息)，并提取指定基因的表達(dá)值。

1.2 分析流程及方法

分析流程概述如下(圖1)：①使用GEO官網(wǎng)自帶的GEO2R工具，對(duì)GSE63678、GSE36389和GSE115810三個(gè)數(shù)據(jù)集分別進(jìn)行差異表達(dá)分析，并將CD47的表達(dá)值和P值提取出來(lái)，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作箱型圖；將THPA官網(wǎng)中CD47在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和分析，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作堆積柱形圖。②使用R語(yǔ)言RTCGA包將子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因表達(dá)值和生存資料提取出來(lái)，采用SPPSS 16.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行ROC曲線和生存分析(Kaplan-Meier and Log-rank test)。③將GSE63678、GSE36389和GSE115810三個(gè)數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)P<0.05的基因提取出來(lái)，利用歐易生信工具(https://cloud.oebiotech.cn/task/)作文氏圖，得出共同差異表達(dá)基因集；利用Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)對(duì)294個(gè)共同差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并將CD47相關(guān)的GO和KEGG通路挑選出來(lái)(結(jié)果主要為GO富集通路)，利用歐易生信工具作富集氣泡圖。㈣使用R語(yǔ)言RTCGA包將子宮內(nèi)膜癌中CD47相關(guān)的GO通路基因表達(dá)值提取出來(lái)，使用GraphPad Prism 8.0.2進(jìn)行軟件差異表達(dá)分析(Mann-Whitney U test)和繪制箱型圖；采用SPPSS 16.0和GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行ROC曲線和生存分析(Kaplan-Meier and Log-rank test)。⑤使用R語(yǔ)言RTCGA包將子宮內(nèi)膜癌的腫瘤分級(jí)信息提取出來(lái)，并用GraphPad Prism 8.0.2軟件分析不同級(jí)別腫瘤中基因的表達(dá)差異(Mann-Whitney U test)和繪制箱型圖。

圖1 分析流程圖

2 結(jié)果

2.1 CD47在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)升高

對(duì)GEO三個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中CD47的基因表達(dá)水平顯著升高(圖2A)。對(duì)THPA數(shù)據(jù)庫(kù)中CD47在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌組織CD47陽(yáng)性染色的比例和強(qiáng)度均高于正常組織(圖2B、圖2C)。以上結(jié)果表明，CD47在子宮內(nèi)膜中基因和蛋白表達(dá)均升高，提示CD47在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。

注：A， CD47在GEO三個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)中的表達(dá)；N：正常(Normal)，T：腫瘤(Tumor)；B，THPA數(shù)據(jù)庫(kù)中CD47在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的免疫組化陽(yáng)性染色比例；C，CD47在正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌中的免疫組化染色代表圖。*P<0.05，**P<0.01

2.2 CD47高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)

TCGA數(shù)據(jù)集提供基因表達(dá)數(shù)據(jù)和患者生存資料、腫瘤分級(jí)等臨床信息，可進(jìn)行生存分析以確定CD47表達(dá)和子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系。ROC曲線分析確定CD47區(qū)分生存結(jié)局的Cut-off值是22.75(圖3A)；將CD47表達(dá)>22.75的劃分為CD47-High組，<22.75的劃分為CD47-Low組，然后進(jìn)行生存分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD47-High組的總體生存率比CD47-Low組的明顯下降(圖3B)，表明CD47表達(dá)升高與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)。

注：A，ROC曲線分析確定CD47區(qū)分生存結(jié)局的Cut-off值；B，CD47表達(dá)與生存分析。數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集

2.3 與CD47相關(guān)的GO富集分析

將GSE63678、GSE36389和GSE115810三個(gè)數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)基因作文氏圖分析，發(fā)現(xiàn)294個(gè)基因(包含CD47)在三個(gè)數(shù)據(jù)集中均有差異表達(dá)(圖4A)。分析差異表達(dá)基因所在的信號(hào)通路，可發(fā)現(xiàn)哪些通路的功能改變導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。利用Metascape對(duì)294個(gè)共同差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，并將CD47相關(guān)的GO和KEGG通路挑選出來(lái)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CD47相關(guān)的主要為GO生物過(guò)程通路，而且前10個(gè)富集的GO通路中，3個(gè)為調(diào)控細(xì)胞激活的通路，7個(gè)為調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架構(gòu)建過(guò)程的通路(圖4B)。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞遷移至關(guān)重要，表明在子宮內(nèi)膜癌中，CD47可能參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移。

注：A，GEO三個(gè)數(shù)據(jù)集(GSE63678、GSE36389和GSE115810)差異表達(dá)基因的文氏圖，其中294個(gè)基因(包含CD47)在三個(gè)數(shù)據(jù)集中均有差異表達(dá)。B，GO富集氣泡圖。氣泡圖展示前10個(gè)富集的與CD47相關(guān)的GO通路(從下往上)

2.4 相關(guān)GO通路基因與CD47表達(dá)的關(guān)系和預(yù)后分析

利用TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集，分析相關(guān)GO通路基因與CD47表達(dá)及疾病預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有相關(guān)基因中，調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架構(gòu)建過(guò)程相關(guān)的基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47-High組中的表達(dá)比CD47-Low組顯著增高(圖5A)。生存分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1的高表達(dá)均與不良預(yù)后相關(guān)(圖5B)，進(jìn)一步提示CD47表達(dá)升高與調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架構(gòu)建過(guò)程相關(guān)的基因表達(dá)升高有一定關(guān)系，而它們的表達(dá)升高又與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)。

注：A， CD47相關(guān)GO通路基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47-Low和CD47-High組的表達(dá)情況。B，F(xiàn)AM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1的表達(dá)與預(yù)后分析，通過(guò)ROC曲線確定區(qū)分基因高低表達(dá)組的Cut-off值。數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集。*P<0.05，***P<0.001

2.5 CD47及相關(guān)基因在高級(jí)別子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)升高

分析CD47及相關(guān)GO通路基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在不同級(jí)別子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)CD47及FAM49B、CLIP2在高級(jí)別的子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)升高(圖6)，表明CD47、FAM49B和CLIP2表達(dá)升高與子宮內(nèi)膜癌的惡化程度有關(guān)，提示CD47及其相關(guān)的調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的通路在子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

注：CD47及CD47相關(guān)GO通路基因包括包括FAM49B、CLIP2 DIAPH1和F2RL1在不同級(jí)別子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)。數(shù)據(jù)來(lái)源于TCGA子宮內(nèi)膜癌數(shù)據(jù)集。**P<0.01，***P<0.001

3 討論

CD47-SIRPα信號(hào)介導(dǎo)腫瘤逃避免疫監(jiān)視的觀點(diǎn)已被廣泛接受。CD47在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，包括非霍奇金淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病、骨髓瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌、平滑肌肉瘤、骨肉瘤和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等[9]。而且，CD47的高表達(dá)與多種腫瘤的進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)，包括急性髓樣白血病[10]、乳腺癌[11]、卵巢癌[12-13]、結(jié)直腸癌[14]、食管鱗狀細(xì)胞癌[15]及口腔鱗狀細(xì)胞癌[16]等。我們和Gu等[8]研究發(fā)現(xiàn)，CD47在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)也顯著升高；我們還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD47高表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌惡性程度和不良預(yù)后相關(guān)，提示CD47在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

然而，通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織差異表達(dá)基因所在的通路進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，CD47主要參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)建過(guò)程，提示腫瘤組織過(guò)度表達(dá)CD47，除了免疫逃避的目的之外，還可能讓其發(fā)揮其他有益于腫瘤細(xì)胞生存的作用。Pai 等[16]揭示了CD47在腫瘤中的其他作用，他們發(fā)現(xiàn)CD47-SIRPα信號(hào)傳導(dǎo)可誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤干性，并與患者預(yù)后不良相關(guān)。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD47往往意味著更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[17]。研究表明，CD47可調(diào)控肺癌細(xì)胞中CDC42的表達(dá)[18]，而CDC42表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[19-20]。CD47也可通過(guò)與其他蛋白相互作用調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，如CD47通過(guò)與糖酵解酶ENO1結(jié)合促使其穩(wěn)定，進(jìn)而增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞中的有氧糖酵解和ERK活性，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[21]；CD47還可與血小板反應(yīng)蛋白1(TSP1)相互作用，增強(qiáng)ERK1/2和AKT的活化及survivin的表達(dá)，促進(jìn)皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)的生長(zhǎng)和遷移[22]。此外，CD47對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的促進(jìn)作用受到microRNA的負(fù)調(diào)控[23-24]。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架對(duì)于維持細(xì)胞的形狀和結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞遷移至關(guān)重要，我們的研究提示CD47還可能參與調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)建，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，然而需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證據(jù)的支持。目前，Shinohara等[25]已經(jīng)證實(shí)，CD47與E-cadherin共定位在上皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附位點(diǎn)，通過(guò)參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移。因此，CD47通過(guò)調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)建來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移是很有可能的。

參與構(gòu)建肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架過(guò)程的相關(guān)基因包括FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1在CD47高表達(dá)的子宮內(nèi)膜癌組織中高表達(dá)，并與子宮內(nèi)膜癌不良預(yù)后相關(guān)，而且FAM49B、CLIP2還在高級(jí)別腫瘤中表達(dá)增加，提示他們和CD47之間可能存在協(xié)同機(jī)制，同時(shí)在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。目前，尚無(wú)證據(jù)表明CD47與這些基因存在直接聯(lián)系，而且，這些基因與腫瘤有關(guān)的報(bào)道也不多見(jiàn)。Chattaragada等[26]報(bào)道FAM49B通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤線粒體的氧化還原反應(yīng)和新陳代謝來(lái)抑制胰腺導(dǎo)管腺癌中的癌細(xì)胞增殖和侵襲。Zhang等[27]卻認(rèn)為FAM49B的上調(diào)是TASP1促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。CLIP2參與了放射性碘暴露導(dǎo)致的乳頭狀甲狀腺癌的基本致癌過(guò)程，包括細(xì)胞凋亡、促有絲分裂原激活的蛋白激酶信號(hào)傳導(dǎo)和基因組不穩(wěn)定性[28]，而且，CLIP2的表達(dá)水平呈碘暴露劑量依賴性[29]。在惡性結(jié)腸癌細(xì)胞中，DIAPH1的表達(dá)增加，有助于腫瘤細(xì)胞穩(wěn)定微管并促進(jìn)轉(zhuǎn)移[30]。DIAPH1的高表達(dá)與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和喉鱗狀細(xì)胞癌(LSCC)的整體存活率低有關(guān)，DIAPH1在LSCC細(xì)胞中被上調(diào)，并且可以通過(guò)抑制LSCC細(xì)胞凋亡維持腫瘤存活[31]。F2RL1基因編碼蛋白酶激活受體2(PAR-2)，Kawaguchi等[32]報(bào)道PAR-2在ApcMin / +小鼠模型中具有加速腸腫瘤形成的作用。以上研究支持了CLIP2、DIAPH1和F2RL1可發(fā)揮促腫瘤的作用，而FAM49B功能可能更復(fù)雜，可通過(guò)不同作用機(jī)制既能發(fā)揮抑制腫瘤的作用，也能發(fā)揮促腫瘤的作用。我們的研究首次將CD47與FAM49B、CLIP2、DIAPH1和F2RL1聯(lián)系起來(lái)，在子宮內(nèi)膜癌中，CD47與這些基因是否存在協(xié)同作用機(jī)制，共同調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)建過(guò)程，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移，還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CD47在子宮內(nèi)膜中表達(dá)升高并與不良預(yù)后有關(guān)，還進(jìn)一步提示CD47可能通過(guò)調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的構(gòu)建從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展，為進(jìn)一步研究CD47在子宮內(nèi)膜癌中作用的分子機(jī)制提供了線索和思路。CD47是判斷子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志和免疫治療靶點(diǎn)。