馬夢堯，張 冉，鐘文華，劉 云，張 藝，吳 超，蘇欣宇，王 林，胡澤波，李 曙

(皖南醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

缺血性腦卒中是一種嚴重損害健康的臨床常見疾病[1]，血管內(nèi)皮細胞缺氧是缺血性腦卒中發(fā)病的首發(fā)事件[2]。通過促進缺血區(qū)域的血管再生，可有效減少缺血區(qū)域血腦屏障的破壞，減輕缺血區(qū)組織損傷，延長溶栓療法的治療時間窗。

博舒替尼是酪氨酸酶抑制劑中的一種，在臨床上常被用來治療慢性髓性白血病。有研究表明，博舒替尼可以抑制鹽誘導(dǎo)激酶2(salt-inducible kinase 2，SIK2)的表達[3]。我們前期的研究表明，SIK2可以抑制血管生成[4]。本研究采用博舒替尼作用于CoCl2誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical rein endothelial cells,HUVECs)缺氧損傷模型[5]，探討其對HUVEC損傷后遷移能力的影響及可能的作用機制，以期為延長缺血性腦卒中的溶栓治療時間窗提供新的思路和靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 HUVECs(南京凱基生物公司)；DMEM高糖的培養(yǎng)基(HyClone，USA)；胎牛血清(CLARK，USA)；磷酸鹽緩沖液PBS(HyClone，USA)；CoCl2(sigma，USA)；博舒替尼(Beyotime，China)；Transwell Corning 3422(Corning，USA)；CCK-8(DOJINDO，China)；SIK2兔多克隆抗體(Thermo，USA)；β-actin鼠多克隆抗體(Beyotime，China)；HRP山羊抗兔抗體(Beyotime，China)；山羊抗鼠抗體(Beyotime，China)；細胞的程序凍存盒(Thermo，USA)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD，USA)；酶標儀(SpectraMax M2，USA)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將HUVECs用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔兩天換液，取對數(shù)生長期細胞實驗。

1.2.2 建立CoCl2缺氧損傷模型 將HUVECs細胞種入96孔板(1×104個/mL)，24 h后更換成100 μL終濃度分別為350、300、250、200、150、100、50、0 μmol/L的含CoCl2的無血清培養(yǎng)基，每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后加入10 μL CCK-8，2 h后在酶標儀450 nm波長(600 nm波長參比)下測各組光密度(OD)值。取100 μL 250 μmol/L CoCl2分別作用于HUVECs 0、3、6、12、24、48 h，通過CCK-8法進一步篩取最佳時間。

1.2.3 測定細胞培養(yǎng)上清中的乳酸脫氫酶(LDH)含量 將HUVECs細胞制成懸液，用移液槍種入96孔板內(nèi)(1×104個/mL)，待細胞長滿孔底后棄去培養(yǎng)基，加入LDH釋放試劑孵育1 h后，離心取上清并隨即進行樣品測定。

1.2.4 劃痕實驗法測定細胞遷移率 6孔板背面用Marker筆做輔助線，接種HUVECs細胞懸液并加入含絲裂原霉素C(1 μg/mL)鋪滿孔底后待過夜，用200 μL槍頭垂直橫線劃痕。PBS清洗3次，加入含2%胎牛血清的培養(yǎng)基。按對照組、CoCl2缺氧損傷組、博舒替尼治療組分別以0、24 h為時間點取樣拍照。隨機選取40×視野拍照比較細胞遷移程度，遷移程度=(0 h兩側(cè)平均距離-24 h兩側(cè)平均距離)/0 h兩側(cè)平均距離。

1.2.5 Transwell實驗法測定細胞遷移率 實驗分為對照組、CoCl2缺氧損傷組、博舒替尼治療組3組。將饑餓處理后的HUVECs制成1×105個/mL濃度的混懸液，取200 μL 2% FBS細胞懸液置于Transwell上室，在Transwell下室加入800 μL含有20% FBS的DMEM高糖完全培養(yǎng)基。待孵育24 h后，鑷子去除小室，用棉簽伸進上室輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭，接著PBS清洗，100%甲醇固定下室面細胞30 min，再用0.5%結(jié)晶紫染色20 min，擦凈上室后鏡檢，隨機選取5個200×視野拍照，比較細胞數(shù)量。

1.2.6 Western blot法檢測SIK2蛋白的相對表達 冰上裂解提取6孔板中細胞的蛋白，BCA法測濃度。以每泳道35 μg蛋白上樣，通過電泳分離蛋白后，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，再封閉80 min，洗凈，一抗過夜。次日待體系溫度恢復(fù)室溫后回收一抗，TBST每次5 min洗滌3次，加入1∶1 000二抗孵育2 h，再次用TBST每次5 min洗滌3次，ECL試劑盒曝光顯色。采用Image J對蛋白條帶進行分析。

1.2.7 蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)分析SIK2相關(guān)蛋白 使用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)找到SIK2及其上下游蛋白，通過京都基因和基因組百科全書比較相關(guān)蛋白通路并進行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 CoCl2的有效作用濃度與作用時間 CCK-8結(jié)果表明，低濃度的CoCl2(250 μmol/L以下)不影響HUVECs的增殖(P>0.05)；當(dāng)CoCl2的濃度達到250 μmol/L時，細胞增殖率(0.743 0±0.028 1)與對照組(0.968 1±0.027 6)相比開始出現(xiàn)抑制(P<0.05)；時間梯度實驗結(jié)果表明，當(dāng)CoCl2作用時間延長到24 h時，抑制效果(0.396 3±0.036 1)最為明顯(P<0.05)。見圖1。

2.2 CoCl2對內(nèi)皮細胞凋亡的影響 LDH結(jié)果表明，對照組[(14.638 9±0.820 8)mU/μL]和CoCl2缺氧損傷組[(15.362 1±0.613 8)mU/μL]的LDH含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細胞未出現(xiàn)大量凋亡、壞死。見圖2。

LDH含量(n=6，t=1.728，P=0.115)。

2.3 博舒替尼對細胞遷移能力的影響 劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組(38.47±2.81)%相比CoCl2缺氧損傷組遷移率(13.10±1.11)%下降(P<0.05)；聯(lián)用博舒替尼治療組(19.37±2.14)%與CoCl2缺氧損傷組相比遷移率有所升高(P<0.05)；Transwell的結(jié)果表明，各組穿孔細胞數(shù)差異明顯。取CoCl2缺氧損傷組、聯(lián)用博舒替尼治療組同對照組穿孔細胞數(shù)目的比值并進行統(tǒng)計，CoCl2缺氧損傷組遷移率(57.87±8.20)%下降(P<0.05)，聯(lián)用博舒替尼治療組遷移率(80.64±10.81)%有所升高(P<0.05)。見圖3。

A.劃痕實驗；B.劃痕實驗細胞遷移率(n=3，F(xiàn)=114.269，P=0.000；vs.對照組，**P<0.01；vs.博舒替尼組，*P<0.05)；C.Transwell實驗；D.Transwell實驗細胞遷移率(n=3，F(xiàn)=18.550，P=0.000；vs.對照組，**P<0.01；vs. 博舒替尼組，*P<0.05)。標尺=50 μm。

2.4 博舒替尼對SIK2蛋白表達的影響 各組細胞SIK2蛋白表達及水平檢測如下。與CoCl2損傷組相比，博舒替尼治療組SIK2蛋白表達下降(P<0.05)。見圖4。

A.Western blot檢測結(jié)果；B.SIK2在各組中蛋白的表達(n=3，F(xiàn)=114.269，P=0.000；vs. CoCl2缺氧損傷組，**P<0.01)。

2.5 SIK2相關(guān)蛋白PPI及KEGG分析 在STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org)中找出與之相關(guān)的蛋白(CRTC、CREB、HIF-1、COX-2、TGF、ANG、PDGF、AKT、PI3K、MAPK、FAK、MEK、PKC、ERK、FAK、mTOR、PLC、P38)同SIK2之間的互作關(guān)系，見圖5。富集分析上述蛋白，結(jié)果匹配106條KEGG通路，取顯著的前10條通路，見表1。

圖5 SIK2相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

表1 KEGG途徑富集分析

3 討論

博舒替尼是酪氨酸酶抑制劑中的一種[6]，常被用來治療正處于慢性、加速期或急變期(既往治療無效)的慢性髓性白血病患者。有研究表明，博舒替尼可以抑制小鼠體內(nèi)SIK2的表達[3]。SIK2是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶[7]，隸屬于AMP活化蛋白激酶家族。對SIK2最初的研究集中在糖脂代謝、腫瘤預(yù)后、細胞周期調(diào)控、黑色素合成等方面[8-14]。最近的研究表明，SIK2在缺血性腦卒中的發(fā)病中也具有重要作用，其可以維持神經(jīng)元中cAMP調(diào)控的轉(zhuǎn)錄共激活因子1(CREB-regulated transcription coactivator-1，CRTC1)的磷酸化及游離狀態(tài)，避免CRTC1進入胞核與環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CRE response element-binding protein，CREB)相結(jié)合發(fā)揮作用。腦缺血損傷發(fā)生后，大量SIK2 降解并解除對CRTC1的抑制，繼而導(dǎo)致神經(jīng)元存活率明顯增加[7]。我們的前期研究表明，在缺血再灌注損傷中SIK2可通過促血管生成的方式來減輕機體損傷[4]。這些結(jié)果提示SIK2可能不僅通過維持CRTC1的磷酸化來保護神經(jīng)元，還可通過促進血管生成來減輕缺血區(qū)的損傷，但其發(fā)揮作用的具體機制仍然需要探索。

本研究成功建立HUVECs缺氧損傷模型，通過CCK-8法測定細胞增殖率，篩選CoCl2最佳濃度與作用時間并最終選用250 μmol/L CoCl2作用24 h建立模型，該模型能在體外準確模擬腦缺血損傷初期。LDH在胞漿內(nèi)廣泛存在，細胞發(fā)生凋亡時，胞漿內(nèi)的高濃度LDH可以順濃度梯度滲透入培養(yǎng)液中，因而可測量上清LDH來評價損傷情況。通過檢測該模型上清液中的LDH含量，發(fā)現(xiàn)無明顯變化，細胞未發(fā)生大量死亡，可較準確的判斷細胞遷移情況。且Hoechst熒光結(jié)果也證明了這個結(jié)論。將博舒替尼作用于HUVECs缺氧損傷模型，結(jié)果表明博舒替尼治療可以有效地改善缺氧HUVECs的遷移能力，與CoCl2缺氧損傷組相比，博舒替尼治療組降低了SIK2蛋白的表達，這表明SIK2可能與HUVECs遷移能力相關(guān)。通過對SIK2及相關(guān)蛋白作PPI及KEGG分析，表明SIK2可能通過CREB調(diào)控來實現(xiàn)其遷移能力的抑制作用。

血管生成是缺血性腦卒中預(yù)后的重要指標[15]。細胞增殖、遷移是血管生成最早的標志之一[16-17]，也是血管生成級聯(lián)反應(yīng)的早期步驟之一[18-19]。本研究結(jié)果表明，在HUVECs建立的缺氧損傷模型里，博舒替尼有可能通過抑制SIK2促進HUVECs遷移進而發(fā)揮促進血管生成的作用。但是是否通過SIK2-CRTC1-CREB這一相互作用鏈實現(xiàn)進而促進HUVECs遷移，這一點還需要進行免疫共沉淀等進一步的試驗進行驗證，后續(xù)我們將進一步擴大對相關(guān)蛋白指標的測定，為進一步探究SIK2在腦卒中發(fā)病中的作用，進而為患者尋找新型早期有效的診斷及預(yù)后標志物奠定基礎(chǔ)。