劉 鴻 鑫，張 強(qiáng)，程 昉*，董 繼 程，劉 波，朱 嬌 慧

(1.大連理工大學(xué) 精細(xì)化工國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116024；2.大連理工大學(xué) 化工學(xué)院 藥學(xué)系，遼寧 大連 116024；3.大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116024；4.湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 鄂州 430206 )

0 引 言

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，占癌癥總死亡人數(shù)的15%[1]．臨床上常用于乳腺癌的抗癌藥物是具有高細(xì)胞毒性的化療藥物(如5-氟尿嘧啶、吉西他濱、阿霉素、紫杉醇等)[2]．在治療過(guò)程中，乳腺癌細(xì)胞容易產(chǎn)生多藥耐藥性，這主要與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過(guò)量表達(dá)有關(guān)．其作用機(jī)制是將抗癌藥物從癌細(xì)胞中排出來(lái)，大大降低藥物對(duì)癌細(xì)胞的毒性，嚴(yán)重影響治療效果[3]．因此，對(duì)于多藥耐藥型乳腺癌的治療，需要設(shè)計(jì)和制備一種實(shí)現(xiàn)抗癌藥物增敏的給藥體系．

齊墩果酸(oleanolic acid，OA)化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

OA是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物，在整個(gè)植物界中廣泛存在．OA及其衍生物具有多種藥理活性，例如保肝作用以及抗炎、抗氧化和抗癌活性[4-7]．OA可影響腫瘤發(fā)育的不同階段，阻滯腫瘤細(xì)胞周期，是一種癌癥化療的潛在輔助手段．Braga等[8]研究發(fā)現(xiàn)，OA可以抑制一種與MDR有關(guān)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(P-gp)的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而增強(qiáng)抗腫瘤活性．使用兩種或多種藥物的聯(lián)合化療可能會(huì)提供一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如發(fā)出不同的信號(hào)通路，改善治療效果以及抑制和逆轉(zhuǎn)耐藥性[9-11]．鹽酸阿霉素(DOX·HCl)化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：

將OA與DOX·HCl共同遞送給藥是提高抗癌藥物敏感性的新思路．

相較于傳統(tǒng)給藥方式水凝膠具有生物相容性等多種優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)局部抗腫瘤藥物的遞送[12-13]．不同種類的響應(yīng)型凝膠(如pH和溫度等)可以持續(xù)或間歇地控制藥物釋放，明顯降低對(duì)健康機(jī)體的毒性，增強(qiáng)藥物對(duì)癌細(xì)胞的毒性[14]．目前，用于腫瘤研究的共給藥水凝膠體系是包埋DOX·HCl和另一種小分子藥物(如紫杉醇[15]、米托蒽醌[16]、順鉑[17]、阿司匹林[18]、亞葉酸鈣[19]等)．然而DOX·HCl/OA的雙給藥體系未見報(bào)道，可能是因?yàn)镈OX·HCl與OA的親疏水性差異過(guò)大．因此，有必要在水凝膠中引入疏水基團(tuán)，通過(guò)對(duì)其基團(tuán)種類和密度的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)DOX·HCl/OA的共包埋和共釋放．

本實(shí)驗(yàn)制備和表征一種新型的聚乙二醇水凝膠材料，通過(guò)氧-邁克爾加成反應(yīng)制備得到聚乙二醇凝膠，實(shí)現(xiàn)將親水性藥物DOX·HCl與疏水性增敏劑OA的共同負(fù)載和可控釋放．經(jīng)過(guò)不同種類醇的修飾，可微調(diào)藥物共載藥釋放速率．采用多藥耐藥型乳腺癌細(xì)胞MCF/MDR，考察雙給藥水凝膠體系的細(xì)胞毒性，評(píng)價(jià)OA與DOX·HCl的協(xié)同殺傷作用．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

試劑六甘醇(EG6，97%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP，99%)、齊墩果酸(OA)、5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、半胱氨酸(Cys)購(gòu)于Aladdin．二乙烯基砜(DVS)購(gòu)于西亞試劑有限公司．鹽酸阿霉素(DOX·HCl)購(gòu)于Ark．

儀器有傅里葉變換紅外光譜儀(6700，ThermoFisher)、平板流變儀(MCR302，Anton Paar)、脫色搖床(TSY-A，Blabotery)、低溫恒溫箱(FMC-1000，EYELA)、高效液相色譜儀(S3000，Acchrom-Tech)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Synergy H1 MFD，BioTek)．

1.2 聚乙二醇水凝膠的制備

將EG6(230 mg，1.0 mmol)、丙三醇(92 mg，1.0 mmol)和DVS(250 mg，2.0 mmol)投入反應(yīng)瓶中混合，加入DMAP(50 mg，0.4 mmol)攪拌均勻，25 ℃反應(yīng)2 h形成凝膠．用乙腈洗滌3次，加入一定量超純水，靜置．

1.3 水凝膠的紅外表征

將凍干后的水凝膠，使用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定其紅外光譜，掃描范圍為350～7 800 cm-1，分辨率為0.09 cm-1．

1.4 水凝膠中乙烯基砜(VS)殘留量的測(cè)定

稱取25 mg水凝膠置于1 mL的1 mmol/L Cys溶液(pH=8.0)中孵育4 h，取250 μL反應(yīng)液和50 mL Ellman試劑(10 mmol/L DTNB，pH=8.0)加入2.5 mL反應(yīng)緩沖液(pH=8.0)中，孵育15 min．使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定樣品中VS基團(tuán)殘留量(412 nm，0～2 000 μg/mL)．

1.5 水凝膠的封閉

將一定量聚乙二醇水凝膠和2 mL不同醇溶液(甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇)放入24孔板中，并與DMAP孵育12 h．用超純水清洗3次后，將其存儲(chǔ)在超純水中以進(jìn)行后續(xù)測(cè)試．

1.6 封閉后水凝膠的力學(xué)性能

用平板流變儀測(cè)量水凝膠的儲(chǔ)能模量G′和損耗模量G″．將多種醇改性水凝膠放在流變儀板上，將轉(zhuǎn)子(PP25)移動(dòng)到板間距為1 mm的板上．掃描條件：應(yīng)變0.1%，頻率1 Hz．

1.7 藥物包埋

將10%的OA或(和)DOX·HCl溶解在乙腈中并超聲處理10 min以制備藥物溶液．將200 mg 聚乙二醇水凝膠和2 mL藥物溶液加入到24孔板中，并置于37 ℃恒溫振蕩箱中，以使藥物完全裝載到水凝膠中．然后干燥并蒸發(fā)乙腈．用乙腈和超純水反復(fù)洗滌，以除去未嵌入水凝膠中的藥物．通過(guò)下式計(jì)算水凝膠的載藥率(E)：

其中M1是加入的藥物總量，M2是藥物殘留量．

1.8 藥物體外釋放行為

將載入DOX和OA的水凝膠置于超純水中，每24 h收集1 mL溶液，再次添加1 mL溶劑以保持相同的體積．取3次平均值．通過(guò)下式計(jì)算水凝膠的藥物釋放率(C)：

其中W1為藥物在n天的釋放量，W2為水凝膠總載藥量．

1.9 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中培養(yǎng)多藥耐藥型人乳腺癌細(xì)胞系MCF/MDR細(xì)胞，放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中．每2 d 換一次培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿至底部面積的80%時(shí)，使用0.2%胰蛋白酶消化傳代．

以1×104/孔的密度將MCF/MDR細(xì)胞平均鋪到96孔板中，培養(yǎng)24 h使細(xì)胞完全貼壁．向每孔分別加入濃度為0、0.04、0.08、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50 μg/mL的DOX·HCl(每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h．使用CCK8試劑盒，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)吸光度，從而計(jì)算出細(xì)胞活性．

以1×104/孔的密度將MCF/MDR細(xì)胞平均鋪到96孔板中，培養(yǎng)24 h．待其完全貼壁，加入20 μmol/L OA與0、0.04、0.08、0.16 μg/mL的DOX·HCl混合液(每組平行設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h．使用CCK8試劑盒，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)吸光度，從而計(jì)算出細(xì)胞活性．

在細(xì)胞分析儀中，將MCF/MDR細(xì)胞以3×104/孔的密度平鋪至孔板中，培養(yǎng)24 h待其完全貼壁．將100 μg/mL DOX·HCl和OA包埋至20 mg甲醇修飾的聚乙二醇水凝膠中．將載藥后的水凝膠用乙腈和超純水洗滌，并使用紫外照射滅菌后放入孔板中，觀測(cè)細(xì)胞活性隨藥物釋放后變化以及單載藥和共載藥對(duì)MCF/MDR細(xì)胞的影響．

2 結(jié)果與討論

2.1 水凝膠的制備與表征

本文選取EG6和丙三醇作為反應(yīng)物，DVS和DMAP為添加劑，利用氧-邁克爾加成反應(yīng)制備中間體，最終吸水溶脹制備PEG水凝膠．為了減少合成的PEG水凝膠上VS基團(tuán)對(duì)細(xì)胞的毒性，通過(guò)不同醇對(duì)水凝膠中VS進(jìn)行封閉，從而降低細(xì)胞毒性．合成路線如圖1所示．

圖1 聚乙二醇水凝膠合成路線Fig.1 Synthetic route of polyethylene glycol hydrogel

圖2 聚乙二醇水凝膠傅里葉變換紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of polyethylene glycol hydrogel

使用Ellman試劑測(cè)定聚乙二醇水凝膠中VS基團(tuán)的殘留量(如表1所示)．選用不同醇對(duì)中間體進(jìn)行封閉．相比于未封閉水凝膠測(cè)得VS量為0.236 mmol/g，通過(guò)甲醇、乙醇、異丙醇和正丁醇修飾后的水凝膠測(cè)得VS基團(tuán)殘留量降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，說(shuō)明殘留的VS基團(tuán)得到了較好的封閉．

表1 不同醇封閉PEG水凝膠中VS殘留量Tab.1 Residual VS in PEG hydrogels blocked by various alcohols

2.2 水凝膠力學(xué)性能

如圖3所示，被不同醇封閉的PEG水凝膠可以調(diào)節(jié)其力學(xué)性能．隨著封閉醇鏈長(zhǎng)的增加，儲(chǔ)能模量G′也增加．這是因?yàn)殒湹拈L(zhǎng)度增加，水凝膠的內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)更致密，儲(chǔ)能模量增加．損耗模量G″是描述內(nèi)摩擦損失的能量，可以被看作是由黏性形變轉(zhuǎn)化的熱損失．而黏性來(lái)自于聚合物鏈和小分子之間的摩擦．損耗模量先隨著鏈的延長(zhǎng)而增加，然后減少．這可能是封閉醇的鏈長(zhǎng)度增加而導(dǎo)致的空間位阻變大，增加了摩擦力．正丁醇的鏈比其他醇的柔軟，鏈與小分子間的摩擦力較小，因此正丁醇封閉的損耗模量降低．

圖3 不同醇封閉PEG水凝膠的彈性模量和損耗模量Fig.3 G′ and G″ of various-alcohol-blocked PEG hydrogel

2.3 體外藥物包埋與釋放

選取疏水性藥物OA和親水性藥物DOX·HCl來(lái)檢測(cè)PEG水凝膠對(duì)親疏水藥物的單一釋放和共釋放性能．將藥物包埋于制備的PEG水凝膠材料中，獲得不同醇封閉的單載藥和共載藥水凝膠，其包埋率如表2所示．DOX·HCl載藥包埋率明顯高于OA載藥，是因?yàn)镈OX·HCl為親水性藥物，其更易包埋于水凝膠中．而DOX·HCl共載藥包埋率高于單載藥，是因?yàn)镈OX·HCl的氨基和OA的羧基具有靜電作用，提高了包埋率．其中甲醇、乙醇封閉的水凝膠DOX·HCl共載藥包埋率分別為86.29%和88.44%，而異丙醇和正丁醇封閉的包埋率分別為85.22%和84.46%，這是因?yàn)檩^長(zhǎng)的鏈長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的空間位阻作用．

表2 不同醇封閉PEG水凝膠的藥物包埋率Tab.2 Encapsulation efficiency of various-alcohol-blocked PEG hydrogel

考察了不同醇封閉PEG水凝膠的藥物釋放情況，如圖4所示．其中圖4(a)是DOX·HCl單載藥的藥物釋放曲線，圖4(b)為OA單載藥的藥物釋放曲線．從以上結(jié)果可以看出，隨著醇鏈長(zhǎng)的增加，釋放速率減慢．這是因?yàn)樗z的疏水結(jié)構(gòu)隨著醇鏈長(zhǎng)的增加而增大，而醇鏈長(zhǎng)為凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)提供了空間位阻．

圖4(c)和(d)分別是水凝膠共載藥的雙藥物釋放曲線．與單載藥體系相比，共載藥體系中OA的釋放速率有所加快，結(jié)果表明在共釋放過(guò)程中兩種藥物相互作用．這可能是由于DOX·HCl的氨基與OA的羧基之間存在靜電作用．

(a)DOX·HCl單載藥

2.4 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

為了定量考察DOX·HCl對(duì)多藥耐藥型乳腺癌細(xì)胞的毒性，選取多藥耐藥型人乳腺癌細(xì)胞系MCF/MDR，利用CCK8試劑盒定量評(píng)價(jià)了不同濃度的DOX·HCl對(duì)MCF/MDR的細(xì)胞毒性．加入不同濃度(0，0.04，0.08，0.16，0.31，0.63，1.25，2.50 μg/mL)的DOX·HCl處理48 h 后，細(xì)胞的存活率Vc如圖5所示，MCF/MDR細(xì)胞的存活率存在著一定的濃度依賴關(guān)系．隨著DOX·HCl的濃度增加，存活率降低，但并沒有明顯的大量細(xì)胞凋亡．使用最大濃度2.50 μg/mL 的DOX·HCl處理后的細(xì)胞存活率仍在70%以上，說(shuō)明MCF/MDR細(xì)胞對(duì)DOX·HCl存在一定程度的耐藥性．

圖5 DOX·HCl對(duì)MCF/MDR的細(xì)胞毒性(n=5)Fig.5 The cytotoxicity of DOX·HCl to MCF/MDR(n=5)

為了考察聯(lián)合使用OA和DOX·HCl兩種藥物是否有協(xié)同作用，利用CCK8試劑盒評(píng)價(jià)了在使用不同濃度的DOX·HCl處理的同時(shí)加入20 μmol/L的OA后的細(xì)胞存活率，其結(jié)果如圖6所示．單獨(dú)使用DOX·HCl劑量達(dá)到0.16 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率約為80%．與單獨(dú)使用DOX·HCl處理的MCF/MDR細(xì)胞相比，加入OA后，細(xì)胞的存活率有明顯下降，其中，在0.04 μg/mL濃度的DOX·HCl處理后，細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞存活率下降了約20%，OA的增敏效果最為明顯．在DOX·HCl濃度較高時(shí)，20 μmol/L的OA對(duì)DOX·HCl的增敏作用不是很明顯．這表明對(duì)于多藥耐藥型人乳腺癌細(xì)胞系MCF/MDR，20 μmol/L 的OA對(duì)DOX·HCl有著濃度依賴的增敏作用．

圖6 DOX·HCl和OA共載藥體系對(duì)MCF/MDR的細(xì)胞毒性(n=5)Fig.6 The cytotoxicity of dual-drug delivery system of DOX·HCl and OA to MCF/MDR (n=5)

使用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀檢測(cè)單載藥和共載藥PEG水凝膠對(duì)MCF/MDR細(xì)胞活性影響，比較不同給藥方式對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖7所示．空白水凝膠和OA載藥水凝膠對(duì)MCF/MDR細(xì)胞均無(wú)明顯作用，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線與空白對(duì)照的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)相近，說(shuō)明細(xì)胞正常增殖，PEG水凝膠具有良好的生物相容性．相比于空白對(duì)照、空白水凝膠和OA載藥水凝膠，DOX·HCl載藥水凝膠和共載藥水凝膠的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線在加藥后有明顯的變化，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞毒性明顯增加．此外還觀測(cè)到共載藥水凝膠在加入到MCF/MDR細(xì)胞后就迅速產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性．

圖7 MCF/MDR細(xì)胞在甲醇封閉的不同水凝膠載藥體系中的細(xì)胞指數(shù)

Fig.7 Cell index of MCF/MDR cells in different methanol-blocked hydrogel drug delivery systems

3 結(jié) 語(yǔ)

本文報(bào)道了一種新型PEG水凝膠的制備方法，用于親疏水性藥物的負(fù)載和釋放研究．該水凝膠通過(guò)不同醇修飾可以調(diào)節(jié)其力學(xué)性能，并對(duì)親水性、疏水性藥物均有良好的載藥性能，實(shí)現(xiàn)了兩種性質(zhì)藥物的共載藥和共釋放．體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，與單載藥水凝膠相比，共載藥水凝膠對(duì)多藥耐藥型乳腺癌細(xì)胞具有更好的殺傷作用．該共載藥水凝膠體系拓展了對(duì)多藥耐藥型乳腺癌的給藥方式．