趙 雪，周巧利，顧 威

南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 南京 210008

黏多糖Ⅵ型綜合征（mucopolysaccharidosis typeⅥ，MPS Ⅵ）又稱Maroteaux-Lamy 綜合征，是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病（autosomal recessive，AR），常因芳基硫酸酯酶B（arylisulfatase B，ARSB）基因的致病性變異引起［1］。據(jù)估計，全球發(fā)病率約為1/320 000～1/248 000［2］，居住在德國的土耳其移民中患病率最高，為0.023‰（1/43 261），在瑞典為1/150萬，中國臺灣地區(qū)患病率為1/83萬，中國大陸目前無流行病學統(tǒng)計數(shù)據(jù)［3］。人類基因突變數(shù)據(jù)庫（human gene mutation database，HGMD）可搜索到ARBS基因突變位點達200余種，大多為錯義突變或無義突變，幾乎每種類型的突變都可引起ARSB 缺乏或缺失，導(dǎo)致部分分解的酸性黏多糖（glycosaminoglycan，GAG）、大分子物質(zhì)硫酸皮膚素（dermatan sulfate，DS）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）沉積積聚在組織內(nèi)，出現(xiàn)一系列隨著年齡不斷惡化的臨床癥狀［3］。MPS Ⅵ主要特征包括多發(fā)性發(fā)育不良、多種營養(yǎng)不良，包括心臟損害、肝脾腫大、聽力損害及眼部異常，骨骼表型以身材矮小和生長衰竭為特征［4-5］。根據(jù)臨床特征可做出初步診斷，但基因診斷仍是最有效的確診手段。本研究對1例臨床診斷的MPS Ⅵ患者進行二代測序及家系驗證，為進一步探討臨床表型與基因型相關(guān)性提供依據(jù)。

1 病例資料

患者，男，生后3 月齡時出現(xiàn)腰部后凸，佩戴矯形器治療，3.5 歲發(fā)現(xiàn)前眼球進行性突出，家長自述“聽力異常”，現(xiàn)4.5 歲因“腰部后凸”于南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科診治。G1P1，足月順產(chǎn)，出生體重4.05 kg，7～8 個月能獨自坐穩(wěn)，1 歲左右能獨自走穩(wěn)，會喊“爸爸、媽媽”，現(xiàn)行走姿勢無明顯異常，無視力異常，無高代謝癥狀，口齒不清。母孕期無特殊，否認相關(guān)疾病家族史。入院后查體：身高94.5 cm（＜P3），體重15 kg（＜P5），左膝伸側(cè)、背部，臀部見多塊青色胎記，特殊面容，眼球明顯突出，鼻梁低平，雞胸。臍疝，約1 元硬幣大小，恥骨聯(lián)合上4 cm 處見一2 cm 長橫行手術(shù)瘢痕，愈合好，肝脾肋下2 cm，質(zhì)中，骨骺端肥大，關(guān)節(jié)僵硬，手掌大，X 型腿。余無特殊。

輔助檢查：胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor 1，IGF-1）35.4 ng/mL；胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein-3，IGFBP-3）1.85 μg/mL；IGF-1/IGFBP-3 比值19.1 ng/μg。脊柱全長正側(cè)位片：腰椎后凸，腰椎椎體前緣發(fā)育差，前下部呈魚嘴樣突出，雙側(cè)肋骨略寬，根部變細，呈飄帶狀，所及骨盆坐骨大切跡深凹，髖臼淺平，右側(cè)股骨頭扁平，密度偏高，雙側(cè)股骨頸略外翻狀。左腕關(guān)節(jié)正位片、四肢及骨盆平片：雙側(cè)尺橈骨干骺端增寬，邊緣可見刺狀突起，所及雙手掌骨近端不規(guī)則，變尖，指骨呈“子彈頭”樣改變，骨齡發(fā)育約相當于4 歲；雙側(cè)髖臼頂扁平，股骨頭骨骺發(fā)育小，股骨頸短，下肢長骨較短，干骺端增寬，脛腓骨顯著，且邊緣可見刺狀突起。頭顱側(cè)位片：頭顱外形增大，蝶鞍拉長，諸骨皮質(zhì)光整。心臟彩超提示二尖瓣前葉輕度脫垂伴關(guān)閉不全（少量反流）、假性室隔膨出瘤（室間隔缺損自然閉合？）、主動脈瓣關(guān)閉不全（少量反流）。鼻咽側(cè)位片提示腺樣體肥大腭扁桃體增大。眼科視力檢查因患者無法配合失敗，眼壓正常。聽力測試中聲阻抗右耳0.67 mL，左耳0.92 mL；耳聲發(fā)射中雙側(cè)瞬態(tài)聲誘發(fā)耳聲發(fā)射均未引出。韋氏智力測定：語言配合困難，圖片詞匯測試配合尚可，得分17，IQ 64，輕度弱智。

結(jié)合患者病史特征，臨床診斷考慮黏多糖貯積癥可能。建議完善基因檢測。獲得患者家長知情同意后，抽取患者及其父母、弟弟、妹妹的靜脈血各2 mL（EDTA抗凝）。根據(jù)南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院相關(guān)流程規(guī)定，標本統(tǒng)一送至北京邁基諾公司完成基因檢測。

基因檢測：二代測序可以同時兼顧敏感性和準確性，被廣泛應(yīng)用于各個學科和領(lǐng)域，是目前常用的基因檢測方法［6］。研究使用標準文庫構(gòu)建試劑盒（北京邁基諾自主研發(fā)）進行基因組文庫構(gòu)建。采用目標序列捕獲探針（GenCap）對812個已知的遺傳性骨骼疾病相關(guān)候選基因外顯子區(qū)域及其邊緣50 bp進行捕獲，富集目標區(qū)域DNA 片段。借助Illumina HiSeq X Ten 測序儀對目標區(qū)域進行高通量測序。GenCap 相較于全基因組測序，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量更少，避免大量冗余數(shù)據(jù)的產(chǎn)生，便于分析，降低成本。將原始測序數(shù)據(jù)去除污染和接頭序列，然后利用BWA 軟件（http：//bio-bwa.sourceforge.net/）將過濾后的序列比對NCBI 數(shù)據(jù)庫人類基因組參考序列（hg19）［7］。利用GATK軟件（https：//software.broadinstitute.org/gatk/）分析得出單核苷酸變異（single nucleotide variation，SNV）和插入缺失突變（inserts and deletions，INDEL）的相關(guān)信息［8］。通過ANNOVAR軟 件（http：//annovar.openbio -informatics.org/en/latest/）對所有的SNV和INDEL進行注釋［9］。篩選出正常人數(shù)據(jù)庫中頻率小于0.05的突變位點，正常人數(shù)據(jù)庫包括千人基因組計劃和EXAC等。錯義突變使用SIFT、PolyPhen-2、Mutation Taster 和GERP++等軟件進行致病性預(yù)測和保守性預(yù)測。結(jié)合疾病遺傳模式和患者臨床表征進行綜合分析，篩選出可疑候選變異［10］。

使用預(yù)測軟件進行致病性分析，根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會（ACMG）發(fā)布的變異解讀指南發(fā)現(xiàn)3 個可能致病基因位點：INPPL1、LRP5、ARSB（表1）。INPPL1 為常染色體隱性遺傳，其家系中未發(fā)現(xiàn)同一基因突變，且患者臨床特征與該基因突變表型不相符，故不考慮其致病可能。LRP5為常染色體顯性遺傳，與其相關(guān)的Van Buchem 病2型是一種硬化性骨發(fā)育不良疾病，臨床特征與患者部分重合，但家系驗證中無同一突變。該患者ARSB 基因突變表型與患者臨床特征相符合，且家系驗證發(fā)現(xiàn)相關(guān)位點，證實為常染色體隱性遺傳，考慮為該患者致病基因。利用Primer 3.0 在線軟件（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計ARSB 基因PCR 引物（表2）。PCR 擴增產(chǎn)物使用3130XL 測序儀進行毛細管電泳測序并在ABI 3130 Genetic Analyzer 上進行分析。再對家系成員進行共分離驗證。使用貝克曼自動化工作站預(yù)設(shè)程序，配制PCR 擴增反應(yīng)體系，充分混勻、離心后置于已經(jīng)設(shè)置好的PCR 儀中：95 ℃預(yù)變性10 min，35 個循環(huán)（94 ℃30 s，58～64 ℃30 s，72 ℃45 s），72 ℃延伸5 min，4 ℃保存，每步對應(yīng)不同的退火溫度（表2）。由于大片段缺插入缺失序列結(jié)果讀取可能存在一定的局限性，實際操作中可采用一代PCR聯(lián)合Sanger 測序法進行補充［11］。Sanger 驗證可采用正向測序或反向測序，反向測序峰圖顯示的堿基有可能為被檢測堿基的反向互補序列。chr5-78251291突變導(dǎo)致部分序列移碼，正向測序得到的圖顯示左側(cè)亂峰，無法使用，故采用反向測序圖。

表1 可疑致病基因

表2 驗證引物信息

最終確定致病的2個突變位點（圖1）：①第5位外顯子上c.979C＞T，導(dǎo)致氨基酸改變p.R327X，為無義突變，變異來源于母親；②第4位外顯子上c.724_725insCCCTTCAGGTCC，導(dǎo)致氨基酸改變 p.H242delinsPLQVH，為整碼突變，變異來源于父親，同時患者妹妹和弟弟相同位點也發(fā)生了雜合變異。

圖1 ARSB基因Sanger測序圖

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測：將需要預(yù)測的蛋白序列導(dǎo)入在線軟件SWISS-model（https：//swiss-model.expasy.org/interactive），選擇覆蓋突變位點range 范圍的蛋白質(zhì)同源性模型［12-14］。模型的一致性和相似度不低于30%，可視化分析軟件Swiss-PdbViewer（http：//www.genebee.msu.su/spdbv/text/getpc.htm）［15］繪制蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖，分析預(yù)測該突變位點對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。既往研究證實與野生型相比，Mutant1（p.R327X）因提前終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生截短的蛋白，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不完整［16］；圖2 中Mutant2（p.H242delinsPLQVH）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可見小部分缺失，與野生型相比，插入4個新的堿基，氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化，原His242 與Tyr175 之間的氫鍵消失，His242 與Glu243 之間的氫鍵消失，取而代之的是Pro242 與Tyr175之間和Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵，導(dǎo)致蛋白長度發(fā)生改變（圖3）。

圖2 Mutant1、Mutant2與野生型蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)對比圖

圖3 Mutant2與野生型氨基酸結(jié)構(gòu)對比圖

2 討論

MPS Ⅵ常因第5 染色體（5q13～q14）上的ARSB基因突變引起，該基因由8個71～885 bp的外顯子和7 個內(nèi)含子組成，轉(zhuǎn)錄合成了2 228 bp 的mRNA，編碼533個氨基酸的前體蛋白［17］。當其編碼的參與黏多糖降解的溶酶體酶發(fā)生儲存障礙時，GAG、DS、CS不能降解，蓄積在溶酶體內(nèi)，引起細胞損害，造成不可逆的多器官功能障礙，一般無智力異常及神經(jīng)退行性變［18-19］。本研究為了進一步明確臨床MPS 診斷，指導(dǎo)臨床治療及判斷預(yù)后，完善MPS 相關(guān)基因測序和家系驗證后發(fā)現(xiàn)了尚未報道的復(fù)合雜合突變：母源性無義突變p.R327X 及父源性整碼突變p.H242delinsPLQVH。

2004 年p.R327X 首次作為新發(fā)位點出現(xiàn)在報道中，并被證實與嚴重的臨床表型存在相關(guān)性［16］。Suarez-Guerrero 等［20］在MPS Ⅵ的病理生理學、診斷和治療的相關(guān)研究中也指出p.R327X為病情快進展突變，患者骨骼系統(tǒng)異常比較明顯，面部特征出現(xiàn)較早。本研究中患者生后3個月以脊柱發(fā)育異常為首發(fā)癥狀就診，癥狀出現(xiàn)在早期，骨骼系統(tǒng)異常明顯，與既往研究一致?；颊咄瑫r存在語言發(fā)育障礙，智力測試提示輕度弱智，考慮因聽力受損及教育限制導(dǎo)致其語言及智力發(fā)育落后，盡管目前尚未發(fā)現(xiàn)ABSB 基因突變與智力發(fā)育之間的直接關(guān)系，但不能排除該患者另一突變位點的影響。通過SWISS-model 軟件建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)圖發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，該無義突變導(dǎo)致ARSB多肽過早終止，產(chǎn)生無功能性截斷蛋白，ARSB 基因編碼的溶酶體酶活性喪失，引起GAG 異常代謝，產(chǎn)生相關(guān)臨床表型［16］。結(jié)合ACMG 指南，c.979C＞T（p.R327X）初步判定為致病性變異（PVS1+PS1+PM2）。

His242 位于ARSB 蛋白具有α/β拓撲結(jié)構(gòu)并具有酶活性位點的結(jié)構(gòu)域內(nèi)，其變異可能影響ARSB酶活性［21］。本研究中p.H242delinsPLQVH與野生型相比，插入了4個新的堿基，導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變化，原His242 與Tyr175、Glu243 之間的氫鍵消失，Pro242與Tyr175、Gln244與Glu247之間形成新的氫鍵，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變。其可能的致病機制是氨基酸側(cè)鏈的變化引起非重復(fù)序列區(qū)域框內(nèi)小插入/缺失或終止密碼喪失引起蛋白長度改變，導(dǎo)致溶酶體酶的缺陷，ARSB 酶活性較低，最終導(dǎo)致MPS Ⅵ。既往研究發(fā)現(xiàn)當伴隨同一染色體上的致病突變時，p.V358M 多態(tài)性可導(dǎo)致ARSB 活性的降低［22］。而已閱文獻中尚無p.H242R純合突變或單純雜合突變的病例報道，故推測p.H242delinsPLQVH 是否也可能同p.V358M 一樣，作為多態(tài)性位點與p.R327X 并存時致病。致病性分析表明c.724_725insCCCTTCAGGTCC（p.H242delinsPLQVH）為疑似致病性變異（PM2+PM3+PM4）。

本研究發(fā)現(xiàn)了1 例尚未報道過的復(fù)合雜合突變，其父源性突變?yōu)樾掳l(fā)現(xiàn)的突變位點，結(jié)合家系驗證結(jié)果證實該復(fù)合雜合突變?yōu)槌Ｈ旧w隱性遺傳，初步判定為可疑致病，但臨床表型與基因型間的相關(guān)性仍無法明確。本研究與既往大多ARSB基因突變位點研究相同，均止步于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)及相關(guān)軟件致病性預(yù)測，缺少進一步功能驗證，對臨床表型與基因型的相關(guān)性未能進行確認，基因突變的研究還需進一步深入，探索基因治療的可能。但本研究新發(fā)現(xiàn)的復(fù)合雜合突變，擴大了ARSB 的致病基因譜，指導(dǎo)患者臨床診治及預(yù)后判斷，基因診斷在罕見疾病診治中是不可或缺的手段。