張長興,徐澤君, 張景鋒

(1.河南牧業(yè)經濟學院 動物科技學院,河南 鄭州 450046；2.河南省畜牧局畜牧總站,河南 鄭州 450000)

定時人工授精(Timed artificial insemination, TAI)是一種實用的遺傳改良工具，它實現(xiàn)了母畜群的同步授精，有利于降低公母畜比例，從而更充分地發(fā)揮優(yōu)良種公畜的繁殖性能[1]；同時也省去了發(fā)情鑒定所消耗的人力成本[2]。TAI技術在奶牛業(yè)中應用已經較為普遍，但在養(yǎng)羊業(yè)中極少得到應用[3-4]。在綿羊TAI方案上，以二次注射前列腺素及其類似物(以下簡稱PG)為基礎的TAI方案，必須是在綿羊處于發(fā)情季節(jié)時才能進行[2]，這樣就限制了二次PG為基礎的TAI方案的應用范圍。在對綿羊大量的對比試驗資料中，以孕酮激素 (Progesterone,P4)及其類似物制作的陰道栓 和馬絨毛膜促性腺激素(Equine chorionic gonadotropin, eCG，舊稱PMSG)為基礎的TAI方案的效果均明顯優(yōu)于二次PG為基礎的TAI方案[1-2,4]。但以P4-eCG為基礎的TAI方案也存在一些問題，主要表現(xiàn)為：如果陰道栓留滯時間過短(9～12 d)可導致撤栓時部分母羊黃體因未退化而無法達到發(fā)情同步。反之，陰道栓留滯時間過長(13～16 d)，則放栓時處于黃體期后期的母羊孕激素作用的總時間過長，加上eCG的作用，可能導致卵母細胞質量降低，進而影響受精率和胚胎發(fā)育；此外，陰道栓留滯過久，還會增加陰道炎和粘連的發(fā)生率[1]。為了給規(guī)?；驁鎏峁┮环N適用性強，效果可靠，簡便易行的TAI方案，本研究設計了一種以P4-PG-eCG為基礎TAI方案。其基本方法是：孕激素陰道栓放置后留滯12 d，在撤栓前一天注射eCG和PG，在撤栓后兩個固定的時間窗口內用鮮精進行常規(guī)子宮頸輸精。該方案經過一定范圍的應用取得了良好的效果。為了較為準確地觀察和分析在規(guī)?；驁鰧d羊開展該技術的效果及其影響因素，課題組在某規(guī)?；驁鲞M行了TAI效果測定試驗，以便為該技術的改進和推廣提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗用公母羊均為純種湖羊。對23棟羊舍中7月齡以上的青年母羊、斷奶40 d及以上的能繁母羊按生產計劃分組分批開展TAI。對能夠追蹤到的母羊進行返情和受胎情況統(tǒng)計分析。母羊在試驗期間，用玉米青貯飼料和混合精料進行常規(guī)飼養(yǎng)管理。

1.2 試驗藥品

一次性導管式陰道栓(河南牧業(yè)經濟學院提供，內含孕激素類似物)；注射用血促素(eCG)(赤峰博恩藥業(yè)有限公司,1 000 IU/支)，用量為250 IU/只；氯前列醇鈉注射液(以下簡稱PG，丹東市綠丹和華動物醫(yī)藥有限公司,0.2 mg/支)； 用量為0.1 mg/只。

1.3 測試地點及時間

試驗地點為河南省登封市某有限公司羊場。對母羊進行TAI處理中，放栓時間為2017年5月份至12月份，到2018年2月完成全部受胎率測定。

1.4 操作流程

1.4.1 放栓 用噴壺將含0.05%新潔爾滅的生理鹽水配成的消毒劑噴灑在母羊外陰部，之后用清潔紙巾擦干；逐支取出一次性導管式陰道栓，用止血鉗夾住外導管的后端，然后在外導管的前端噴灑少量潤滑劑(含10%豬輸精用潤滑劑的生理鹽水)。左手分開陰門，右手持止血鉗將導管插入陰道，插入深度為外導管后端比陰門深1～2 cm，左手拇指將推桿推到底，然后右手持止血鉗將外導管和推桿一起抽出。放栓后，連續(xù)3 d在母羊采食時巡查是否脫栓，正常情況下有2%～3%的脫栓率。對脫栓母羊進行補放。

1.4.2 注射eCG和PG 放栓當天計為0 d，在放栓后第11 d上午注射eCG和PG。為簡化操作，可將兩種激素按比例混合后使用連續(xù)注射器進行頸部肌肉注射。

1.4.3 撤栓 在注射eCG和PG 24～30 h即放栓后的第12 d下午撤栓。

1.4.4 輸精 在撤栓后48～52 h (即放栓后的第14 d下午)和60～64 h(即放栓后的第15 d早上) 用鮮精進行兩次常規(guī)子宮頸輸精，每次輸精劑量為0.2 mL，前進運動精子數不少于5 000萬個。

1.5 指標計算

最終用于統(tǒng)計的試驗母羊，均為始終可追蹤(即沒有發(fā)生耳標丟失)的母羊數。

1.5.1 21 d不返情率(The non-return rate to service at Day 21，NRR-21)測定 21 d 不返情率是指TAI后第14～21天未發(fā)現(xiàn)發(fā)情的母羊數占試驗母羊數的百分率。母羊配種后第14～21天，每天用帶試情布的公羊試情兩次，將返情母羊挑出。記錄可追蹤到的母羊的不返情情況，并計算21 d不返情率。

1.5.2 受胎率測定 配種后50～60 d，用便攜式B型超聲波儀經腹外壁進行妊娠診斷，統(tǒng)計受胎母羊數，并計算受胎率。TAI的受胎率是指TAI后50～60 d，確認妊娠的母羊數占試驗母羊數的百分率。

1.5.3 返情羊受胎情況及總受胎率測定 返情羊配種后50～60 d，用便攜式B型超聲波儀經腹外壁妊娠診斷，統(tǒng)計返情羊的受胎母羊數。總受胎率在這里是指經TAI妊娠的母羊數和TAI后出現(xiàn)第一次返情后輸精而受胎的母羊數之和占試驗母羊的百分率。

1.6 數據處理方法

試驗數據用Microsoft Excel進行整理,用IBM SPSS Statistics 26進行卡方獨立性檢驗。根據河南省的氣候特點及綿羊在中原地區(qū)季節(jié)性發(fā)情特點，劃分3～8月份為乏情季節(jié)，9月份至次年2月份為發(fā)情季節(jié)。依據原始數據中發(fā)情季節(jié)和乏情季節(jié)中返情及受胎與否等情況，通過皮爾遜卡方獨立性檢驗分析1.5中各指標與季節(jié)因素的關聯(lián)性，以P<0.05視為指標與季節(jié)因素存在顯著關聯(lián)，季節(jié)因素可影響該指標的水平；P<0.01視為指標與季節(jié)因素存在極顯著關聯(lián)，季節(jié)因素明顯影響該指標。

2 結果與分析

2.1 試驗期內各月份的TAI效果

按生產計劃共進行40個批次的TAI試驗，放栓母羊共計4 832只，最終將可追蹤的母羊為4 724只作為試驗母羊數。參與放栓但最終無法追蹤的母羊占所有參與放栓母羊數的2.23%。按實際配種月份記錄各月份中TAI的相關指標，結果見表1。從表1知，試驗母羊TAI的受胎率達到82.0%，總受胎率達到91.7%。在測試的6個月份中，各月份21 d不返情率差異不大。但6～8月份的TAI受胎率和總受胎率均低于9月份和12月份。

2.2 季節(jié)因素對TAI效果的影響分析

乏情季節(jié)和發(fā)情季節(jié)TAI效果的統(tǒng)計結果見表2。 季節(jié)因素與21 d不返情率相互獨立(P=0.210)，季節(jié)因素對返情率無顯著影響。但，季節(jié)因素與TAI受胎率(P=0.007)和總受胎率(P<0.001)存在極顯著的關聯(lián)性，季節(jié)因素顯著影響TAI受胎率及總受胎率。發(fā)情季節(jié)TAI受胎率及總受胎率均高于乏情季節(jié)，分別為85.6%vs81.4%和94.4%vs91.2%。由表2可見，雖然發(fā)情季節(jié)的21 d不返情率略高于乏情季節(jié) ，但統(tǒng)計學分析未發(fā)現(xiàn)季節(jié)因素與返情率存在關聯(lián)性(P>0.05)。季節(jié)因素與受胎率存在極顯著的關聯(lián)性(P<0.01)，發(fā)情季節(jié)TAI的受胎率和總受胎率均高于乏情季節(jié)(85.6% vs 81.4%和94.4% vs 91.2%)。

表1 各月份綿羊TAI的效果統(tǒng)計Table 1 Effect of TAI in sheep by month

表2 季節(jié)因素對綿羊TAI效果的影響Table 2 Effect of seasonal factors on the outcome of TAI in sheep

3 討 論

雖然不同綿羊品種發(fā)情季節(jié)性程度有一定差異，但所有綿羊品種的發(fā)情季節(jié)都主要集中在秋冬季節(jié)[5]。以P4-PG-eCG為基礎的TAI方案，模擬了發(fā)情季節(jié)母羊發(fā)情周期的激素譜，所以，即使在乏情季節(jié)，也達到了良好的效果。盡管如此，發(fā)情季節(jié)的效果仍要好于乏情季節(jié)，這是處理方案與季節(jié)因素互作的結果。

Olivera-Muzante[2]在綿羊的發(fā)情季節(jié)進行了以二次PG分別間隔12、13、14、15、16 d，同時與以P4-eCG為基礎的TAI方案比較，雖然發(fā)現(xiàn)以間隔15 d的二次PG的TAI方案受胎率(62.9%)為最高，但仍明顯低于以P4-eCG為基礎的TAI方案的受胎率(66.2%)。但是，以P4-eCG為基礎的TAI方案存在同期發(fā)情率較低的問題，因此，其應用的效果還是不夠理想。以P4-PG-eCG為基礎的TAI方案，與以P4-eCG為基礎的TAI方案相比，一是增加了PG的使用，二是與許多相似方案相比不同的是，注射PG和eCG的時間是在撤栓前一天進行。其原理是：在給母羊放栓后的12 d中，母羊群自身的黃體會隨時間推移陸續(xù)退化，但由于陰道栓的外源孕激素持續(xù)釋放，其卵泡的發(fā)育仍會受到抑制。因此，在撤栓時，大部分母羊的黃體已經退化。撤栓后停止了外源性孕激素的釋放，為卵泡發(fā)育提供了共同的起點，從而達到發(fā)情同步的目的。但仍有一些個體在放栓時其排卵剛結束或結束不久，這樣經過12 d，其黃體仍未達到自然退化時間；另外，少部分母羊存在持久黃體。注射PG時，這兩類黃體已經不是新生黃體，對PG是敏感的，因此，在撤栓前注射PG，可確保這兩類黃體的退化。Nett等[6]發(fā)現(xiàn)，綿羊在發(fā)情周期第10 d注射PG后，母羊的孕酮水平是在12 h后下降到基礎水平的，注射PG 24 h后黃體完全退化(結構性退化)。因此，注射PG應早于撤栓時間，才能使注射時黃體還沒有退化的母羊在撤栓時已經完全退化，并與其他母羊發(fā)情同步。eCG的注射也應該在撤栓前一天進行，尤其是在乏情季節(jié)[7]。阿米娜·阿布都瓦力等[8]對綿羊采用了以P4-PG-eCG為基礎的同期發(fā)情方案，但與本研究不同的是PG和eCG的注射時間是與撤栓同步進行的。這個方案雖然有利于減少工作量，但對于同步發(fā)情的效果，其使用PG應該沒有明顯改善作用，因此，在該試驗中，P4-PG-eCG法與P4-eCG法相比，同期發(fā)情率沒有顯著差異。經過同期發(fā)情處理，雖然為母羊群創(chuàng)造了一個卵泡發(fā)育的共同起點，但對于群體來說，達到發(fā)情和最佳輸精的時間必然還存在個體間的差異。 Olivera-Muzante等[9]發(fā)現(xiàn)，對綿羊用P4-eCG法進行同期發(fā)情處理，撤栓后分別在不同時間進行鮮精輸精，僅作一次輸精的最佳時間為撤栓后54 h，達到71%的受胎率。本研究則采用了二次輸精，這可能是受胎率高于Olivera-Muzante等試驗結果的原因。

4 結 論

以P4-PG-eCG為基礎的綿羊TAI方案，陰道栓留滯時間以12 d為宜，應在撤栓前一天注射PG和eCG，宜在撤栓后48～52 h 和60～64 h進行兩次輸精。在發(fā)情季節(jié)開展TAI的效果要好于乏情季節(jié)。