張 城，馬劍平，沈育樺，朱文君，劉河龍，邱 彥 （上海健康醫(yī)學院附屬浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201200）

腦卒中是人類疾病中最常見的腦血管疾病，已經(jīng)成為人類死亡的第二大原因[1]。腦卒中引起的一系列并發(fā)癥和后遺癥給患者家庭帶來了不可估量的負擔。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種，其中，缺血性腦卒中又稱腦中風，是腦卒中主要的發(fā)病方式，約占腦卒中患者的83%以上[2]。目前，尚無有效的治療藥物用于腦卒中引起的損傷，尤其是對于神經(jīng)損傷的治療[3]。活性多肽GRGDS 是由甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（Gly-Arg-Gly-Asp-Ser，GRGDS）5 種氨基酸構成，主要通過形成一個β 轉(zhuǎn)角的方式與其他細胞發(fā)生黏連[4]，因而，能夠阻斷細胞外基質(zhì)和細胞表面整合素的結合和黏附，可應用于組織工程或者癌癥和腫瘤方面。本試驗采用PC12 細胞體外模擬腦缺血模型，探討活性多肽GRGDS 對氧糖剝奪損傷后的PC12 細胞是否具有保護作用。

1 材料

1.1 細胞株

PC12 細胞購自ATCC 細胞庫，培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液中，每12 h 觀察一次細胞的生長狀態(tài)，每24 h 更換一次細胞培養(yǎng)液，待細胞長到80%進行傳代。

1.2 藥物與試劑

活性多肽GRGDS（上海淘普生物科技有限公司）；高糖DMEM 培養(yǎng)液、DMEM 無糖培養(yǎng)液（Gibco 公司）；凋亡試劑盒、蛋白質(zhì)提取試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；抗體：β-肌動蛋白（βactin）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase 3)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase 3)、磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(P-SAPK/JNK)、Bax 蛋白（美國CST 公司）。

1.3 儀器

細胞培養(yǎng)箱、酶標儀（美國Thermo 公司）；低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）；細胞缺氧裝置（美國Billips-Rothenberg 公司）；流式細胞儀（BDBiosci-ences 公司）；Western blot 圖像掃描儀（美國Odyssey 公司）。

2 方法

2.1 PC12 細胞氧糖剝奪損傷模型的建立

氧糖剝奪模型參照文獻[5]體外模擬腦缺血模型，即OGD 模型，再根據(jù)實驗過程中的實際情況稍作改造。將細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)板中，待細胞生長至培養(yǎng)板底面積80%以上，將對照組的培養(yǎng)液換成無血清高糖完全培養(yǎng)液，OGD 組換成無糖培養(yǎng)液，活性多肽GRGDS 給藥組換成加有GRGDS 藥物處理的無糖培養(yǎng)液。將含有3 組細胞的培養(yǎng)板置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后將模型組和給藥組的細胞置于缺氧裝置中，通入混合氣體（95%N2，5%CO2），使裝置內(nèi)的氧氣完全排出，分別將細胞缺糖和缺氧2、4、6、8 h 后取出，采用MTT 法選出細胞損傷的最佳時間，進行后續(xù)試驗研究。

2.2 MTT 法測定細胞活力

將PC12 細胞以2.0×105個/ml 的密度鋪于96 孔板中，按照“2.1”項下方法進行操作，在缺糖、缺氧之前，將給藥組細胞的培養(yǎng)液換成含有不同濃度的活性多肽GRGDS（10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 μg/ml）的無糖培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中適應1 h，OGD 組和給藥組一同置于缺氧裝置中缺氧4 h。缺氧過后取出培養(yǎng)板，在避光條件下將所有組的細胞加入每孔20 μl 提前配好的0.5%MTT 溶液（5 mg/ml），用錫箔紙包好將其放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4 h 后棄掉上清液，再向每個細胞培養(yǎng)孔中加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO)溶液，溫室振蕩5 min，用全自動酶標儀在492 nm 波長處檢測每個孔中細胞的吸光值（A）。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

將PC12 細胞鋪于6 孔板中，待細胞貼壁后將OGD 組中的培養(yǎng)液換成無糖DMEM 培養(yǎng)液，給藥組中的培養(yǎng)液換成加有活性多肽GRGDS 處理的無糖DMEM 培養(yǎng)液，恒溫孵育1 h 后置于缺氧裝置中缺氧4 h，缺糖、缺氧后棄掉每孔中的細胞上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2 次，洗掉細胞表面殘留的培養(yǎng)液，再用不含依地酸(EDTA)的胰蛋白酶消化液消化1～2 min。將各組細胞置于不同的離心管中，以1 200 r/min 離心5 min，棄上清液，再加入PBS，將細胞進行重懸后再離心。離心后棄掉上清液，每個離心管中加入500 μl 的1×緩沖液輕輕吹打混勻，避光條件下向各離心管中加入5 μl 的細胞凋亡檢測試劑(annexin V-FITC)，室溫放置5 min 后，再加入5 μl 的碘化丙啶(PI)染色液。充分混勻后室溫避光放置15 min，用流式細胞儀進行檢測。

2.4 ELISA 檢測OGD 后PC12 細胞相關炎癥因子的變化

將PC12 細胞氧糖剝奪后取細胞上清液，4 ℃、300 r/min，離心15 min。離心后取上清液放入4 ℃冰箱冷藏保存，若不能及時檢測，應將上清液放在?20 ℃冷凍保存。按照試劑盒中的說明書建立標準曲線，檢測各組樣本吸光值，并計算其濃度。

2.5 Western blot 檢測相關蛋白的表達

將氧糖剝奪損傷后的各組細胞上清液棄掉，用預冷的PBS 清洗細胞表面殘留的培養(yǎng)液，用細胞刮刀將各組細胞刮掉，置于預冷的RIPA 裂解液中裂解30 min，使細胞中的蛋白完全裂解，以12 000 r/min，離心10 min，取上清液。BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。各組蛋白中加入20 μl 5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min。10%SDS-PAGE 分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的Tris 緩沖液封閉1 h，孵育一抗4 ℃環(huán)境下過夜，回收一抗，洗膜3 次（5 min/次），室溫條件下加二抗，避光孵育2 h 后洗膜。使用Western blot 圖像掃描儀掃描并統(tǒng)計結果。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 活性多肽GRGDS 對OGD 損傷的PC12 細胞的保護作用

為了選擇合適的缺糖缺氧時間，本實驗設置了2、4、6、8 h 的時間點，結果顯示，細胞生存率隨著氧糖剝奪時間的增長而顯著降低，與對照組相比有顯著性差異（P<0.01），且缺糖缺氧4 h 細胞明顯皺縮，細胞活性明顯降低，細胞的損傷率達到50%，此時的損傷率有利于藥物補救，更有助于細胞的恢復，因此，氧糖剝奪損傷時間為4 h 條件最佳（圖1A）。活性多肽GRGDS 給藥濃度為0.01 μg/ml，可顯著提高缺糖缺氧4 h 后PC12 細胞的活力（P<0.01）。因此，選擇缺糖缺氧4 h，給藥濃度0.01 μg/ml 作為實驗條件進行后續(xù)研究（圖1B）。

圖1 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞的影響（n=3）

3.2 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞的凋亡

將細胞以2.0×105個/ml 細胞密度鋪于6 孔板中，培養(yǎng)16 h 后，將OGD 組細胞的高糖培養(yǎng)液換成無糖的DMEM 培養(yǎng)液，給藥組細胞的高糖培養(yǎng)液換成給予活性多肽GRGDS 藥物處理的無糖DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中平衡1 h，缺氧4 h，而正常對照組細胞的培養(yǎng)液換成新的高糖DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。缺糖缺氧結束后，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。圖2 結果顯示，與正常對照組比較，OGD 組細胞的凋亡率顯著增加（P<0.01），由正常對照組（2.26±0.61）%上升到（12.14±1.69）%。給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度處理后，細胞凋亡率明顯降低，凋亡率降至（6.94±1.45）%（P<0.01）。

圖2 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞凋亡率的影響（n=3）

3.3 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量

正常對照組細胞上清液中TNF-α 的含量為（27.16±2.69）pg/ml，兩者相比，OGD 組細胞中的TNF-α 含量明顯增加（P<0.01），為（54.51±2.89）pg/ml；與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細胞上清液TNF-α 的含量顯著降低，為（38.32±18）pg/ml（P<0.01，圖3A）。正常對照組細胞上清液IL-1β 的含量為（15.4±0.11）pg/ml，OGD組細胞上清液中IL-1β 的含量為（35.99±2.25）pg/ml，兩者相比，OGD 中的IL-1β 含量顯著增加（P<0.01）。與OGD 比較，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理的細胞上清液中IL-1β 的含量顯著降低，為（21.84±1.18）pg/ml（P<0.01，圖3B）。

圖3 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的影響（n=3）

3.4 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達

本實驗檢測了MAPKs 信號通路中的JNK 信號通路中相關蛋白表達的影響。結果如圖4 所示，PC12 細胞經(jīng)過氧糖剝奪損傷后，細胞中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達與正常對照組細胞相比均顯著升高（P<0.01）；而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，可明顯降低氧糖剝奪損傷后細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達（P<0.01）。

圖4 活性多肽GRGDS 對OGD 后PC12 細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達的影響（n=3）

3.5 活性多肽GRGDS 降低OGD 后PC12 細胞中加入JNK 抑制劑p-JNK、Bax 蛋白的表達

將原始濃度為10 mmol/ml 的JNK 抑制劑（SP600125）稀釋成10 μmol/ml 的濃度加入到PC12細胞中，缺糖缺氧后提取細胞蛋白分別檢測p-JNK 及其下游Bax 蛋白的表達情況。結果如圖5所示，OGD 組細胞中p-JNK、Bax 的蛋白表達與正常對照組細胞相比都顯著增加（P<0.01）；給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度以及JNK 抑制劑處理后，p-JNK、Bax 蛋白的表達水平與OGD 組相比均明顯降低（P<0.01）。

圖5 活性多肽GRGDS 對OGD 的PC12 細胞加入JNK 抑制劑后p-JNK、Bax 蛋白表達的影響（n=3）

4 討論

缺血性腦卒中是由血管阻塞引起的腦血液循環(huán)障礙誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)損傷，致死、致殘率較高，且病理機制十分復雜，目前醫(yī)學上仍缺乏行之有效的治療方法。在急性缺血的早期階段，細胞凋亡可能是對氧糖剝奪的一種自我保護反應，有助于維護重要細胞的生存。然而，在局部缺血的大部分期間，鈣超載、氧自由液和溶酶體酶的釋放均會導致細胞壞死[6]。

最新研究表明，活性多肽GRGDS 可激活體內(nèi)干細胞，促進細胞的增長和分化[7]。但是，活性多肽GRGDS 對于PC12 細胞凋亡引起的一系列炎癥反應的作用尚未見研究報道。因此，本實驗研究了活性多肽GRGDS 對氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡和凋亡反應的抑制作用，并初步探討其可能存在的藥理和藥效機制。首先，建立氧糖剝奪損傷的PC12 細胞模型，同時加入不同給藥劑量濃度的活性多肽GRGDS 進行處理。結果發(fā)現(xiàn)，活性多肽GRGDS 的不同給藥劑量濃度可有效抑制氧糖剝奪PC12 細胞的損傷，并且當活性多肽GRGDS 的劑量濃度為0.01 μg/ml 時藥物作用效果最佳。故確定0.01 μg/ml 濃度作為機制探討劑量。

TNF-α 是一種促炎性多效細胞因子，研究表明，TNF-α 可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 的機制阻止神經(jīng)元的死亡或凋亡，從而誘導Mn-SOD 和Bcl-2 的表達[8]。TNF-α 在大腦發(fā)育過程中起著效應分子的作用，經(jīng)常參與不同的信號通路，激活巨噬細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，促進神經(jīng)毒素的產(chǎn)生，并啟動神經(jīng)細胞的凋亡或死亡過程[9]。IL-1β 作為一種炎癥和免疫源性細胞因子，可在多個環(huán)節(jié)參與腦缺血損傷機制。研究表明，大量炎性細胞因子（IL-1β、TNF-α）參與腦缺血再灌注損傷后腦細胞的凋亡和壞死[10]。因此檢測了氧糖剝奪損傷的PC12 細胞上清液，結果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12 細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 含量顯著增加，給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后，上清液中的TNF-α 和IL-1β 含量明顯降低。

本研究結果顯示，經(jīng)過氧糖剝奪損傷后，PC12 細胞的凋亡率明顯增加，而給予活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml 劑量濃度處理后PC12 細胞的凋亡率顯著下降，這提示了活性多肽GRGDS 可能通過抑制PC12 的凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。為了進一步研究活性多肽GRGDS 是否通過抗凋亡作用發(fā)揮對PC12 細胞的保護作用，本實驗試著對凋亡信號通路中的p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 等相關蛋白的表達進行了檢測。據(jù)報道，caspase 3 是細胞凋亡中的關鍵部分，是其信號傳導的效應通路。caspase 3 可能通過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和死亡受體三種途徑激活體內(nèi)細胞中的死亡信號。缺血性腦卒中一般會引起體內(nèi)線粒體細胞色素c 的釋放導致caspase 3 的表達、激活和裂解，從而促進細胞凋亡。在細胞死亡引起的凋亡過程中，cleaved caspase 3 的表達會增加[11]。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK 可以參與調(diào)節(jié)多種信號通路誘導或減輕細胞凋亡，活化的JNK 會引起腦缺血應激反應的細胞凋亡，而JNK 抑制劑在腦缺血再灌注損傷后提供神經(jīng)保護作用。Bcl-2 蛋白家族中的抗凋亡Bcl-2（Bcl-xL）和促凋亡Bax 蛋白之間的動態(tài)平衡在決定腦缺血期間的細胞命運中起關鍵作用。越來越多的證據(jù)表明，Bcl-2（Bcl-xL）/Bax 比率的增加抑制Bax 易位至線粒體并保護神經(jīng)元免受細胞凋亡的損傷，而平衡向Bax 過量的轉(zhuǎn)變會引起缺血誘導的神經(jīng)細胞凋亡。本研究結果顯示，氧糖剝奪損傷后PC12細胞中p-JNK、Bax、cleaved caspase 3 蛋白的表達水平顯著升高，綜合流式細胞儀檢測氧糖剝奪損傷后PC12 細胞凋亡的結果，表明活性多肽GRGDS可能通過抑制凋亡信號通路中的JNK/Bax 信號通路，進而抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡反應，最終發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

本研究結果表明，活性多肽GRGDS 0.01 μg/ml劑量濃度可以明顯抑制氧糖剝奪損傷的PC12 細胞凋亡，降低細胞上清液中TNF-α 和IL-1β 的含量，并通過調(diào)控JNK/Bax 信號通路蛋白的表達發(fā)揮神經(jīng)保護作用。活性多肽GRGDS 可能在腦缺血中對PC12 細胞引起的損傷具有一定的神經(jīng)保護作用。進一步的研究還需在動物模型上進行更深一層的體內(nèi)藥效試驗解釋活性多肽GRGDS 對缺血性腦卒中的影響及其作用機制，為活性多肽GRGDS在臨床上用于缺血性腦卒中的藥物治療提供良好的藥理學基礎。