姜金豆，林 秀，陳容容，胡葵葵

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)美容科，廣東 廣州，510000）

毛發(fā)移植術(shù)是目前治療各種原因所致的毛發(fā)缺損性疾病最為常用的手術(shù)方法，手術(shù)主要以枕部毛發(fā)為供區(qū)來(lái)源，但對(duì)于大面積突發(fā)且供區(qū)不足的患者，該技術(shù)的應(yīng)用及效果受到了嚴(yán)重的影響。毛囊組織工程的研究為這些問(wèn)題的解決帶來(lái)了希望，近年來(lái)毛囊細(xì)胞移植重建毛囊的相關(guān)研究取得了一定進(jìn)展，已通過(guò)鼠源性和人源性毛囊細(xì)胞重建出新的毛囊，但經(jīng)傳代培養(yǎng)后的部分毛囊細(xì)胞活性下降，難以獲得具有高活性的細(xì)胞，毛囊組織工程的種子細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題仍有待解決。毛囊干細(xì)胞的增殖、遷移及分化機(jī)制仍有待深入研究。毛囊干細(xì)胞在其所在微環(huán)境中的多種信號(hào)因子調(diào)節(jié)下完成自我更新及分化過(guò)程，其中wnt信號(hào)通路廣泛參與到了毛囊干細(xì)胞的增殖、遷移、分化以及凋亡過(guò)程，國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的探索目前仍局限于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究階段。既往動(dòng)物研究資料表明，wnt信號(hào)通路通過(guò)不同配體、受體以及上下游信號(hào)通路的交互調(diào)節(jié)參與毛囊干細(xì)胞的增殖分化過(guò)程[1]。

本項(xiàng)研究中，我們將使用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)人毛囊干細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，研究分析wnt10b及其相關(guān)信號(hào)通路對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖和分化的影響。該研究結(jié)果對(duì)于毛發(fā)缺損的發(fā)病機(jī)制和毛發(fā)組織工程以及干細(xì)胞基因治療毛發(fā)缺損方面均有重要的理論和實(shí)際意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 組織來(lái)源

人毛發(fā)組織來(lái)源于整形外科毛發(fā)移植術(shù)殘余的枕部毛發(fā)組織及面部提升術(shù)切除毛發(fā)組織。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清（Hyclone，SH30087.01），DMEM（Hyclone，SH30023.01B），青鏈霉素（Hyclone，SH30010），PBS磷酸鉀緩沖液（Hyclone，SH30256.01B），Annexin V-APC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（keygen，KGA106），cellTiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（Promega，G3582）。

1.2 方 法

1.2.1 人毛囊干細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

人頭部皮膚標(biāo)本先由林格液潤(rùn)洗，去除多余脂肪，顯微剪分離處于毛囊峽部和毛球上部之間的隆突區(qū)組織,其深度起始位距表皮約1 mm范圍，延伸深度約1.8 mm,將分離隆突區(qū)組織應(yīng)用 10ng/ml 中性蛋白酶37℃下消化45分鐘后接種。接種所用培養(yǎng)板應(yīng)用Matrigel包被。將隆突區(qū)毛囊組織直接接種于Matrigel包被的培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞遷出后待細(xì)胞融合達(dá)到60%～70%時(shí)，以0.25%胰酶37℃下振蕩消化5-10min，收集細(xì)胞以1:2比例傳代培養(yǎng)。觀察細(xì)胞的增殖能力及形態(tài)學(xué)特征。取傳代培養(yǎng)4周的人毛囊干細(xì)胞（hair follicle stem cell，HFSCs）細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析及克隆形成能力測(cè)定，鑒定毛囊干細(xì)胞表型及增殖潛能。

1.2.2 Wnt10b信號(hào)通路的激活

利用gateway克隆技術(shù)構(gòu)建含Wnt10b基因的質(zhì)粒pAV.EX1d‐WNT10B/ⅠRES/eGFP，應(yīng)用腺病毒包裝后轉(zhuǎn)染人毛囊干細(xì)胞以激活Wnt通路，分析Wnt10b信號(hào)通路激活在人毛囊干細(xì)胞自我更新和分化調(diào)節(jié)過(guò)程的差異及交互作用。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞行克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞增殖活力測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 載體結(jié)構(gòu)圖譜見(jiàn)圖1

圖1 pAV.EX1d-WNT10B/IRES/eGFP載體結(jié)構(gòu)圖譜

2.2 病毒感染結(jié)果

應(yīng)用Adwnt10b轉(zhuǎn)染人毛囊干細(xì)胞后培養(yǎng)結(jié)果。細(xì)胞轉(zhuǎn)移后應(yīng)用 wnt10b病毒載體及空白載體轉(zhuǎn)染,圖2為48小時(shí)后GFP蛋白表達(dá)情況。病毒載體成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)于人毛囊干細(xì)胞中。wnt10b轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)較為密集，圖中熒光視野可見(jiàn)較多轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的GFP表達(dá)細(xì)胞。

圖2 過(guò)表達(dá)wnt10b毛囊干細(xì)胞（×200）a.明視野和熒光視野重疊圖，b.明視野，c.熒光視野

2.3 MTS細(xì)胞增殖檢測(cè)

wnt10b過(guò)表達(dá)激活 wnt10b信號(hào)后，對(duì)毛囊干細(xì)胞的增殖具有一定的促進(jìn)作用(圖3)。MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在第六天時(shí)，wnt10b過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖率與空白對(duì)照組細(xì)胞相比，增殖比率提高了約50.1%。

圖3 wnt10b信號(hào)通路激活后毛囊干細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率變化曲線

2.4 平板克隆實(shí)驗(yàn)

圖4 人毛囊干細(xì)胞空白對(duì)照組

圖5 人毛囊干細(xì)胞-GFP細(xì)胞株

圖6 人毛囊干細(xì)胞-wnt10b細(xì)胞株

圖7 人毛囊干細(xì)胞wnt10b基因過(guò)表達(dá)的克隆形成率（克隆形成率=克隆數(shù)÷接種細(xì)胞數(shù)×100%）。

圖8 人毛囊干細(xì)胞wnt10b基因過(guò)表達(dá)的細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)（存活分?jǐn)?shù)=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率÷對(duì)照組克隆形成率×100%）。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果中wnt10b轉(zhuǎn)染組細(xì)胞總凋亡比率為4.96%，而單純細(xì)胞組及空白載體轉(zhuǎn)染組這一比率分別為7.91%及8%（圖9）。結(jié)果分析表明，wnt10b的過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡過(guò)程，wnt通路的激活對(duì)毛囊干細(xì)胞有著一定的保護(hù)作用。

圖9 人毛囊干細(xì)胞wnt10b基因過(guò)表達(dá)的凋亡檢測(cè)總凋亡細(xì)胞比例

3 討論

Notch信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜而又保守的分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，其發(fā)生作用與細(xì)胞、組織類型以及與其他信號(hào)通路的相互作用有關(guān)。Nocht廣泛參與到了干細(xì)胞自我更新及多向分化調(diào)節(jié)過(guò)程中，Notch及其受體在表皮中有廣泛的表達(dá)，在表皮不同層細(xì)胞間的分化中起到了一種分子開(kāi)關(guān)的作用。本研究主要針對(duì)Notch信號(hào)通路對(duì)毛囊干細(xì)胞增殖分化過(guò)程的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行深入探索，為毛囊組織工程中種子細(xì)胞的體外大規(guī)模擴(kuò)增及分化方向的控制提供新的研究策略。

哺乳動(dòng)物中存在四種Notch受體,即Notch1，Notch2，Notch3，Notch 4[1]。Notch信號(hào)通路中存在5中不同的配體，分屬兩種不同家族（Jagged-1及Jagged-2,Delta-樣配體Delta 1,Delta 3,Delta 4）[2]。完整皮膚及培養(yǎng)細(xì)胞中Notch信號(hào)可調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞的增殖、定型及分化方向的選擇。Notch為一單次跨膜蛋白，通過(guò)與其配體結(jié)合或通過(guò)Notch受體在兩種酶（γ‐分泌酶及ADAM非金屬蛋白酶）順序作用下水解，Notch 胞內(nèi)段片段（N1ICD）進(jìn)入胞核，與 Rbpj結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，從而激活下游相關(guān)靶基因的表達(dá)發(fā)揮信號(hào)調(diào)節(jié)作用。這一系列變化稱為經(jīng)典Notch信號(hào)通路[2]。Demehri S等人的研究證實(shí)，Notch信號(hào)通路的作用在于阻止毛囊干細(xì)胞向表皮細(xì)胞方向遷移分化[3]。Notch信號(hào)在隆突區(qū)干細(xì)胞向表皮分化的過(guò)程中起阻滯作用。轉(zhuǎn)基因小鼠研究中，其毛囊形成表皮囊腫與Notch信號(hào)部分減少有關(guān)[4]。

Wnt/β‐catenin信號(hào)通路是與Notch通路產(chǎn)生交互作用的諸多調(diào)節(jié)信號(hào)之一，其在毛囊胚胎的發(fā)育及后天穩(wěn)定性的維持中起重要作用[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Wnt/β‐catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)毛囊由靜止期向生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化，Notch信號(hào)通路中諸多基因的表達(dá)均受β‐catenin蛋白的調(diào)節(jié)。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路可誘導(dǎo)祖細(xì)胞中Notch配體Jagged1的表達(dá)。目前對(duì)Notch及其相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用的了解仍局限于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究階段，對(duì)人毛囊干細(xì)胞體外Notch信號(hào)通路研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。目前有關(guān)Notch信號(hào)通路在毛囊中的作用的相關(guān)研究，主要通過(guò)針對(duì)不同轉(zhuǎn)基因小鼠分析獲取。完整皮膚及培養(yǎng)細(xì)胞中Notch信號(hào)調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，定型及分化方向。Wnt信號(hào)是胚胎發(fā)育過(guò)程中毛囊形成的必須通路之一，而成體表皮中過(guò)度激活Wnt會(huì)導(dǎo)致毛囊形成表皮囊腫。表皮中多種Notch信號(hào)通路基因的表達(dá)受到β‐連環(huán)蛋白的調(diào)控。經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路可誘導(dǎo)祖細(xì)胞中Jagged1的表達(dá)。敲除Jagged1可以阻滯β‐連環(huán)蛋白的異常毛囊形成作用，而對(duì)β‐連環(huán)蛋白的促分化作用不發(fā)生影響[5]。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中通過(guò)Notch激活后（N1ICD過(guò)量表達(dá)），并未發(fā)生毛囊干細(xì)胞的異常增殖，可能與wnt通路中β‐連環(huán)蛋白共同作用促進(jìn)毛囊分化成熟有關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)可通過(guò)p21介導(dǎo)作用抑制Wnt通路蛋白的表達(dá)，有文獻(xiàn)表明Notch胞內(nèi)段與β‐連環(huán)蛋白相結(jié)合后可負(fù)性調(diào)控β‐連環(huán)蛋白的轉(zhuǎn)錄活性[3]。本項(xiàng)目研究中通過(guò)深入探索Notch及其相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，以達(dá)到模擬毛囊干細(xì)胞體內(nèi)信號(hào)通路微環(huán)境，于體外培養(yǎng)毛囊干細(xì)胞，通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路及其與上游Wnt通路的交互作用，使毛囊干細(xì)胞于體外快速增殖，從而達(dá)到使毛囊干細(xì)胞在體外穩(wěn)定增殖分化的目的。目前已可以通過(guò)轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt10b重組基因激活小鼠毛囊由休止期向增殖期轉(zhuǎn)變。本研究通過(guò)體外對(duì)毛囊干細(xì)胞轉(zhuǎn)染Notch1胞內(nèi)活性片段以達(dá)到激活Notch信號(hào)通路的作用，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)毛囊干細(xì)胞增殖及分化過(guò)程。

我們的研究小組通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Notch1可上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)因子p21的表達(dá)，使處在正常增殖過(guò)程中的毛囊干細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯，并進(jìn)一步發(fā)生終末分化。本研究通過(guò)系統(tǒng)性阻斷與激活人毛囊干細(xì)胞Notch信號(hào)通路，在國(guó)內(nèi)外首次就人毛囊干細(xì)胞增殖分化過(guò)程中該通路的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了較為深入的探索。應(yīng)用N1ICD及wnt10b轉(zhuǎn)染人毛囊干細(xì)胞后，GFP蛋白表達(dá)情況分析表明兩種病毒載體均成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)于人毛囊干細(xì)胞中。N1ICD的轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的增殖產(chǎn)生了明顯的抑制作用，與N1ICD轉(zhuǎn)染組相比，wnt10b轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長(zhǎng)較為密集。N1ICD過(guò)表達(dá)激活Notch信號(hào)后，對(duì)毛囊干細(xì)胞的增殖具有一定的抑制作用。MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，N1ICD對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率約為35.83%，而與之相反的是，通過(guò)wnt10b過(guò)表達(dá)激活Wnt通路后，細(xì)胞增殖比率提高了約46.8%。N1ICD與wnt10b處理組克隆形成率測(cè)定結(jié)果分別為44%±0.08及67%±0.09,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯（p<0.05）。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果分析，N1ICD與wnt10b兩種不同信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白過(guò)表達(dá)后，毛囊干細(xì)胞S期差異明顯，其中N1ICD過(guò)表達(dá)處理組S期比率僅為7%，wnt10b處理組為39.92%，空白載體對(duì)照組及單純細(xì)胞組這一比例分別為40.9及33.17%，Notch信號(hào)激活所導(dǎo)致的細(xì)胞周期改變與對(duì)照組相比具有較明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果表明Notch信號(hào)通路可能使部分細(xì)胞退出正常的細(xì)胞周期，導(dǎo)致部分細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入S期而停留于G1，從而抑制毛囊干細(xì)胞的正常增殖過(guò)程。兩種不同信號(hào)通路激活所導(dǎo)致的細(xì)胞功能改變，來(lái)源于通路相關(guān)的不同靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。Western blot 蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明，N1ICD轉(zhuǎn)染后N1ICD及Notch信號(hào)下游Hes1 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，表明Notch信號(hào)成功激活，N1ICD組細(xì)胞周期抑制因子p21表達(dá)上調(diào)，wnt10b蛋白含量明顯減少，與wnt10b處理組相比，相關(guān)蛋白的表達(dá)具有相反的調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路對(duì)經(jīng)典的wnt通路中wnt10b蛋白的表達(dá)具有一定的抑制作用，N1ICD過(guò)表達(dá)激活Notch信號(hào)通路后，通過(guò)細(xì)胞周期抑制蛋白p21表達(dá)的上調(diào)使人毛囊干細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，退出正常的細(xì)胞周期循環(huán)，退出細(xì)胞周期循環(huán)的人毛囊干細(xì)胞并未發(fā)生大規(guī)模凋亡，而是進(jìn)入到了分化過(guò)程中。Notch1信號(hào)的阻斷導(dǎo)致了Wnt/β‐catenin信號(hào)通路中wnt10b的上調(diào),使人毛囊細(xì)胞中β‐鈣連環(huán)蛋白介導(dǎo)信號(hào)的增強(qiáng)，而Wnt信號(hào)可被激活的Notch1表達(dá)所抑制。Notch1激活導(dǎo)致的wnt通路抑制作用可能由p21介導(dǎo)。Notch激活p21表達(dá)，進(jìn)而反饋性下調(diào)wnt10b基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

通過(guò)慢轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的方式使人毛囊干細(xì)胞Notch胞內(nèi)活性片段N1ICD過(guò)表達(dá)，可成功激活Notch信號(hào)通路。Notch信號(hào)通路與經(jīng)典的wnt信號(hào)通路在就人毛囊干細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中有著完全相反的作用，這種調(diào)節(jié)作用可能與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白p21的表達(dá)密切相關(guān)。Notch信號(hào)激活后可使人毛囊干細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期停滯，一定程度上抑制了細(xì)胞的增殖，但并未導(dǎo)致人毛囊干細(xì)胞的大規(guī)模凋亡，可能使大批人毛囊干細(xì)胞進(jìn)入進(jìn)一步的分化過(guò)程中。這一新的研究發(fā)現(xiàn)為人毛囊干細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞增殖及分化的可控性提供了新的研究策略。