弓德強(qiáng)，胡美姣，高兆銀，李 敏，陳千付，黃慧俐，楊謹(jǐn)瑛，黃臺(tái)明，朱世江

（1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?71101）（2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院）（3 廣西百色市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)研究推廣中心）（4 海南省熱帶園藝產(chǎn)品采后生理與保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

芒果（Mangifera indicaL.）是我國廣西、海南、四川和云南等熱區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)，但芒果是一種不耐貯運(yùn)的熱帶水果。由于芒果果實(shí)在采前田間易受病原菌潛伏侵染，而且采后極易后熟軟化，導(dǎo)致芒果在采后貯運(yùn)中發(fā)病而腐爛[1]。目前，生產(chǎn)上常用化學(xué)殺菌劑浸泡處理防治芒果采后病害，但增加了勞動(dòng)力成本和采后損耗，同時(shí)也不利于食品安全[2]。近年來，采后病害的防控和保鮮越來越側(cè)重于從采前措施入手，其中采前利用抗病性誘導(dǎo)技術(shù)防控芒果采后病害已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)之一。

研究表明，水楊酸（salicylic acid，SA）作為一種誘導(dǎo)植物抗病性的天然誘抗劑，于采前處理可提高櫻桃[3]、梨[4]、臍橙[5]、棗[6]和杏[7]等果實(shí)對(duì)采后病害的抗性，并有效保持果實(shí)的品質(zhì)，從而達(dá)到較好的防腐保鮮效果。采前水楊酸處理控制芒果采后病害也有一些研究報(bào)道。曾凱芳和姜微波[8]研究表明，采前應(yīng)用較低濃度（0.1 mmol/L）的水楊酸處理不僅能延緩‘紫花’芒果采后衰老進(jìn)程，而且能有效控制芒果采后病害的發(fā)生。Sanikommu 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，采前噴施200 mg/L 水楊酸可抑制采后芒果乙烯的產(chǎn)生，從而延緩果實(shí)后熟衰老，并維持較高的果實(shí)品質(zhì)。弓德強(qiáng)等[10]系統(tǒng)研究了采前水楊酸處理對(duì)‘紅芒6 號(hào)’芒果采后品質(zhì)和抗病性的影響，篩選了采前水楊酸處理適宜的濃度、時(shí)期和次數(shù)，并進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，采前水楊酸處理提高采后芒果果實(shí)品質(zhì)和抗病性與抗氧化酶活性的增強(qiáng)、膜脂過氧化程度的降低及后熟衰老進(jìn)程的推遲密切相關(guān)。

近年來對(duì)采前水楊酸處理提高芒果采后抗病性與品質(zhì)機(jī)理的研究越來越多，但仍然不夠深入。本研究以‘紅芒6 號(hào)’芒果為材料，研究采前水楊酸處理對(duì)采后芒果果實(shí)品質(zhì)和抗病性的影響，并探討其與乙烯合成、果實(shí)軟化及防御酶相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，以期為改進(jìn)和完善水楊酸應(yīng)用于芒果防腐保鮮提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)于2019 年在廣西百色市田陽區(qū)百育鎮(zhèn)芒果生產(chǎn)園進(jìn)行。供試芒果品種為‘紅芒6 號(hào)’，選擇生長良好、樹勢(shì)健壯、樹齡約15 年的芒果樹為試驗(yàn)樹。

水楊酸為分析純（99.9%），購自Sigma 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 采前處理

處理時(shí)間為2019 年6 月3 日（即謝花后約60 d），此時(shí)果實(shí)發(fā)育已接近正常果大小。水楊酸處理濃度為40 mg/L，以清水為對(duì)照，均勻噴施于芒果果面后套上黑色紙質(zhì)果袋。處理與對(duì)照各重復(fù)3次，每次重復(fù)3 株樹。

1.2.2 采收與選果

于2019 年7 月28 日采收，芒果成熟度為七八成熟，此時(shí)果實(shí)中可溶性固形物含量為6.5%左右。挑選出大小、顏色基本均勻，無機(jī)械損傷，無明顯病斑或蟲咬的果實(shí)作為后續(xù)試驗(yàn)用果。

1.2.3 接種炭疽菌與病斑直徑測定

采前水楊酸處理和對(duì)照各30 個(gè)果，分別接種芒果炭疽菌，接種炭疽菌參照弓德強(qiáng)等[11]的方法，并用直尺測量接種后8 d 和10 d 時(shí)果實(shí)的病斑直徑，以10 個(gè)測定數(shù)值取平均值表示病斑直徑，每處理重復(fù)3 次。

1.2.4 常溫貯藏

采前水楊酸處理和對(duì)照各120 個(gè)果，裝入帶孔的硬紙箱中，每個(gè)果箱裝入20 個(gè)果，放在溫度為22～25 ℃、空氣相對(duì)濕度為80%～90%的常溫庫中貯藏。定期調(diào)查自然發(fā)病的病情指數(shù)，測定乙烯釋放速率，并取樣測定果實(shí)硬度、內(nèi)在品質(zhì)及相關(guān)基因的表達(dá)情況。

1.2.5 自然發(fā)病的病情指數(shù)調(diào)查

在常溫條件貯藏的芒果中，采前水楊酸處理和對(duì)照各固定3 箱共60 個(gè)芒果，參照弓德強(qiáng)等[12]的方法調(diào)查每箱芒果常溫貯藏8 d 和10 d 時(shí)的病情指數(shù)，每處理重復(fù)3 次。

1.2.6 乙烯釋放速率的測定

采用封罐法測定第0、2、4、6、8、10、12 d時(shí)芒果乙烯釋放速率。在常溫條件貯藏的芒果中，處理和對(duì)照各固定5 個(gè)芒果放入4.5 L 的密封塑料盒中，放置在常溫條件下3 h，然后用1 mL 的注射器從盒內(nèi)吸取1 mL 氣體，通過Agilent（美國）5795型氣相色譜儀測定，每處理重復(fù)測定3 次。

1.2.7 果實(shí)硬度的測定

在常溫條件貯藏的芒果中，于第0、2、4、6、8、10 d 各取樣1 次，每次取5 個(gè)果實(shí)。果實(shí)硬度采用GY-B 型硬度計(jì)進(jìn)行測定，取10 次數(shù)據(jù)平均值表示；將果肉和果皮分別切成小塊并混勻后用液氮速凍處理，并放于-80 ℃冰箱中保存，分別用于其他品質(zhì)指標(biāo)測定和相關(guān)基因的表達(dá)。

1.2.8 果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)的測定

參照梁清志等[13]的方法。維生素C 含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定；可溶性固形物含量采用手持折光儀測定；可滴定酸含量采用酸堿中和滴定法測定，按檸檬酸的含量計(jì)算可滴定酸含量；用可溶性固形物和可滴定酸含量的相對(duì)比值表示固酸比。

1.2.9 目的基因相對(duì)表達(dá)量分析

參考Hong 等[14]的方法，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）分析目的基因MiACO、MiEG、MiGLU和MiCHI的相對(duì)表達(dá)量，以ACTIN作為內(nèi)參基因。4 個(gè)目的基因和1 個(gè)內(nèi)參基因的引物序列信息見表1。將對(duì)照芒果0 d 取樣時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量設(shè)為1，計(jì)算各處理不同取樣時(shí)間點(diǎn)樣品的基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 用于基因表達(dá)分析的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003 軟件和DPS 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析，利用LSD 法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果病斑直徑和病情指數(shù)的影響

由圖1 可知，在貯藏8 d 和10 d 時(shí)，采前水楊酸處理芒果自然發(fā)病的病情指數(shù)均顯著低于對(duì)照，防治效果分別為80.95%和68.49%；采前水楊酸處理芒果接種炭疽菌后8 d 和10 d 時(shí)的病斑直徑均顯著低于對(duì)照，分別比對(duì)照降低了36.67%和23.17%。結(jié)果表明，采前水楊酸處理能夠提高采后芒果果實(shí)對(duì)炭疽菌侵染的抗性，對(duì)芒果具有良好的防腐保鮮效果。

圖1 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間的病情指數(shù)和病斑直徑的影響

2.2 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果乙烯釋放速率的影響

由圖2 可知，采前水楊酸處理芒果在貯藏期間乙烯釋放速率的變化趨勢(shì)與對(duì)照相似，呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，采前水楊酸處理降低了采后芒果乙烯釋放速率的峰值，并使乙烯峰值的到來推遲了4 d，其中貯藏前期（0～8 d）的乙烯釋放速率顯著低于對(duì)照。結(jié)果表明，采前水楊酸處理能夠抑制芒果內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生。

圖2 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間乙烯釋放速率的影響

2.3 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果果實(shí)硬度的影響

由圖3 可知，采后芒果在常溫貯藏中果實(shí)硬度逐漸降低，采前水楊酸處理延緩了采后芒果果實(shí)硬度的降低，其中貯藏期2～10 d 果實(shí)硬度顯著高于對(duì)照。

圖3 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間果實(shí)硬度的影響

2.4 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果品質(zhì)指標(biāo)的影響

由圖4 可知，在采后貯藏過程中，采前水楊酸處理和對(duì)照果實(shí)維生素C、可溶性固形物和可滴定酸含量的變化趨勢(shì)相似，即先升高后降低。其中采前水楊酸處理和對(duì)照果實(shí)維生素C 含量均在貯藏6 d 時(shí)達(dá)到最大值，并在貯藏4～10 d，采前水楊酸處理果實(shí)維生素C 含量顯著高于對(duì)照；采前水楊酸處理和對(duì)照果實(shí)可溶性固形物含量分別在貯藏8 d 和6 d 時(shí)達(dá)到最大值，并且貯藏前期（2～6 d）采前水楊酸處理低于對(duì)照，貯藏后期（8～10 d）高于對(duì)照，差異基本達(dá)到顯著水平；采前水楊酸處理和對(duì)照果實(shí)可滴定酸含量分別在貯藏6 d 和4 d 時(shí)達(dá)到最大值，并且整個(gè)貯藏期采前水楊酸處理均顯著高于對(duì)照；對(duì)照果實(shí)固酸比在貯藏前期（0～4 d）變化平緩，6 d 后急劇升高，而采前水楊酸處理果實(shí)固酸比在貯藏前期（0～6 d）變化平緩，8 d 后略有升高，并且在整個(gè)貯藏期均顯著低于對(duì)照。

圖4 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間品質(zhì)指標(biāo)的影響

2.5 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果MiACO 和MiEG表達(dá)量的影響

由圖5 可知，在貯藏前期（0～4 d），對(duì)照果 實(shí)MiACO的表達(dá)變化較緩，6 d 后開始迅速升高，8 d 時(shí)達(dá)到峰值，然后降低；而采前水楊酸處理芒果MiACO的表達(dá)變化一直較為平緩，并且在貯藏中后期（4～10 d）顯著低于對(duì)照。表明采前水楊酸處理抑制了采后芒果MiACO的基因表達(dá)。

在貯藏前期（0～4 d），對(duì)照果實(shí)MiEG的表達(dá)變化較緩，6 d 后開始迅速升高，10 d 時(shí)達(dá)到最大值；而采前水楊酸處理抑制了采后芒果MiEG的表達(dá)，整個(gè)貯藏期間一直處于較低水平，其中貯藏后期（6～10 d）顯著低于對(duì)照（圖5）。

圖5 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間MiACO 和MiEG 表達(dá)量的影響

2.6 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果MiGLU 和MiCHI表達(dá)量的影響

由圖6 可知，采后芒果在貯藏過程中MiGLU和MiCHI表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，均在貯藏6 d 時(shí)表達(dá)上調(diào)，達(dá)到峰值，然后降低；而采前水楊酸處理提高了MiGLU和MiCHI的表達(dá)，均在貯藏4 d時(shí)表達(dá)上調(diào)，6 d 時(shí)達(dá)到最大值，然后逐漸降低，其中貯藏期4～10 d 均顯著高于對(duì)照。

圖6 采前水楊酸處理對(duì)采后芒果貯藏期間MiGLU 和MiCHI 表達(dá)量的影響

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采前噴施40 mg/L 水楊酸處理能夠顯著抑制采后芒果果實(shí)硬度的降低和維生素C 的降解，延緩可溶性固形物含量的升高過程，保持較高的可滴定酸含量，從而抑制固酸比的升高，表明采前水楊酸處理能夠推遲采后芒果果實(shí)的后熟衰老進(jìn)程，從而延緩果實(shí)品質(zhì)的下降，達(dá)到防腐保鮮的目的。這與前期的研究結(jié)果基本一致[10,14]，在桃[15]、甜瓜[16]、棗[17]和葡萄[18]等果實(shí)上也有類似的研究結(jié)果。關(guān)于采前水楊酸處理延緩果實(shí)采后成熟衰老及保持果實(shí)品質(zhì)的相關(guān)機(jī)理，已經(jīng)有大量的研究報(bào)道。張帆等[19]研究發(fā)現(xiàn)，采前水楊酸處理主要通過誘導(dǎo)次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生和增強(qiáng)清除DPPH 自由基能力來提高樹莓果實(shí)采后保鮮效果。敬媛媛等[16]研究表明，采前水楊酸處理可通過抑制纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶等酶的活性有效延緩甜瓜果實(shí)硬度的下降，從而延緩果實(shí)的后熟軟化進(jìn)程。Sanikommu 等[9]研究結(jié)果表明，采前水楊酸處理能通過抑制芒果內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生進(jìn)而延緩芒果后熟衰老進(jìn)程，從而保持較高品質(zhì)，延長保鮮期。這與本試驗(yàn)的研究結(jié)果相似。ACC 氧化酶（ACO）是乙烯生物合成中的兩個(gè)關(guān)鍵酶之一，主要催化由1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）到乙烯（C2H4）的轉(zhuǎn)化過程[20]。在本試驗(yàn)中，采前水楊酸處理顯著抑制了芒果ACC 氧化酶基因（MiACO）的表達(dá)，降低了果實(shí)乙烯釋放速率的峰值，并推遲乙烯峰值到來時(shí)間達(dá)4 d，表明采前水楊酸處理可通過抑制MiACO的表達(dá)進(jìn)而抑制內(nèi)源乙烯的產(chǎn)生。果實(shí)軟化是芒果成熟的重要標(biāo)志之一，內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶（EG）作為一種纖維素酶，在果實(shí)后熟軟化中起著重要的作用[21]。EG 是一類由多基因家族編碼的細(xì)胞壁代謝酶之一，EG 基因的表達(dá)與內(nèi)源乙烯關(guān)系密切，與果實(shí)早期成熟軟化的啟動(dòng)有關(guān)[22]。在本研究中，采前水楊酸處理顯著抑制了采后芒果貯藏過程中MiEG表達(dá)水平的升高及果實(shí)硬度的降低，從而延緩了果實(shí)的后熟軟化，保持了較高的內(nèi)在品質(zhì)?？梢?，MiEG在芒果果實(shí)后熟軟化中起著重要的正調(diào)控作用。

水楊酸是植物抗病性的重要誘導(dǎo)因子，是植物體內(nèi)自身合成的一種類似植物激素的酚類化合物，能誘導(dǎo)多種植物對(duì)病毒、真菌及細(xì)菌病害產(chǎn)生抗性[23]。本研究結(jié)果顯示，采前水楊酸處理可顯著抑制采后接種芒果炭疽病菌的果實(shí)病斑的擴(kuò)展，并且顯著降低芒果在自然貯藏條件下的病情指數(shù)。該結(jié)果與我們前期的研究結(jié)果是基本一致的[10]，表明采前水楊酸處理能夠誘導(dǎo)采后芒果果實(shí)產(chǎn)生抗病性，從而減輕采后果實(shí)發(fā)病的嚴(yán)重程度。采前水楊酸處理提高采后果實(shí)的抗病性與其能誘導(dǎo)一系列抗性相關(guān)的防御酶活性及其相關(guān)基因表達(dá)水平的提高密切相關(guān)，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、幾丁質(zhì)酶（CHI）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）是幾種重要的防御酶，相關(guān)研究報(bào)道較多。Qin 等[24]在櫻桃果實(shí)上噴施水楊酸，誘導(dǎo)了果實(shí)PAL、PPO 以及GLU 活性的增強(qiáng)。Yao 和Tian[3]研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸采前噴施和采后浸泡都能顯著增強(qiáng)櫻桃果實(shí)中PAL、POD 和GLU 的活性，從而提高采后果實(shí)的抗病性。Cao 等[4]研究表明，采前水楊酸處理提高‘鴨梨’果實(shí)抗病性與誘導(dǎo)PAL、CHI 和GLU 等酶活性的增強(qiáng)有關(guān)。水楊酸作為植物抗病反應(yīng)的信號(hào)分子，能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，促使多種病程相關(guān)蛋白（PRs）的表達(dá)[25]。其中GLU 和CHI 是研究比較多的2 個(gè)重要的PRs，分別屬于PR-2 和PR-3 家族[26]。Xu 等[27]研究表明，外源水楊酸處理桃果實(shí)能夠誘導(dǎo)CHI 和GLU 基因表達(dá)的增強(qiáng)，從而提高果實(shí)的抗病性。在本試驗(yàn)中，采前水楊酸處理顯著增強(qiáng)了采后芒果MiCHI和MiGLU的表達(dá)水平，激發(fā)果實(shí)內(nèi)在的防御反應(yīng)機(jī)制，從而增強(qiáng)果實(shí)的抗病性，延緩采后病害的發(fā)生。

總之，采前水楊酸處理能夠提高采后芒果果實(shí)的品質(zhì)和抗病性，在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。并且，采前水楊酸處理提高采后芒果品質(zhì)和抗病性與芒果乙烯合成、軟化相關(guān)基因表達(dá)的抑制和防御相關(guān)基因表達(dá)的增強(qiáng)密切相關(guān)。