姜云斌，賀 強(qiáng)，王志華，佟 偉，王文輝，賈朝爽

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧省果品貯藏加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧興城125100）（2 天津捷盛東輝保鮮科技有限公司）（3 綏中縣農(nóng)業(yè)事務(wù)服務(wù)中心）

‘寒富’是沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)用‘東光’ב富士’雜交選育的抗寒優(yōu)質(zhì)大果型蘋果品種，在遼寧省中北部冷涼地區(qū)推廣面積大，截至2018 年底，遼寧省栽培面積近11.33 萬(wàn)hm2，在遼寧省的蘋果中居第1[1]?！皇俊O果在貯藏期間很容易發(fā)生果肉褐變現(xiàn)象[2-7]。作為其后代，‘寒富’也存在同樣的問題[8-9]，解決貯藏期間果肉褐變對(duì)‘寒富’蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展意義重大。

關(guān)于蘋果果肉的褐變，20 世紀(jì)80 年代就有報(bào)道[10-11]。有研究認(rèn)為，CO2濃度過高是貯藏期間‘富士’果肉褐變的直接原因[12-14]。關(guān)于‘寒富’果實(shí)貯藏的研究，集中在采收期[15]、氣調(diào)貯藏[9]、1-MCP及其類似物處理[16-17]，以及果實(shí)解剖結(jié)構(gòu)[18]，對(duì)果肉褐變機(jī)理的研究未見報(bào)道。本試驗(yàn)研究了‘寒富’果肉褐變與過氧化物酶、多酚氧化酶活性及丙二醛、過氧化氫含量的關(guān)系，同時(shí)研究了果肉組織中抗氧化活性物質(zhì)含量的變化，旨在探明‘寒富’果肉褐變的氧化還原機(jī)理，為其貯藏保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

供試的‘寒富’果實(shí)于2019 年10 月25 日采自遼寧省綏中縣寬幫鎮(zhèn)大栗村管理水平較好的果園，采收當(dāng)天運(yùn)回中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所（興城）實(shí)驗(yàn)室，選取大小均勻、無(wú)病蟲害、無(wú)磕碰傷的果實(shí)，預(yù)冷12 h 后，放入氣調(diào)密閉容器（廣口玻璃瓶，20 L）內(nèi)，分別進(jìn)行如下處理：①高濃度CO2處理，玻璃瓶輸入CO2，使CO2濃度為10%，O2濃度為18%，N2濃度為72%；②對(duì)照，玻璃瓶輸入空氣，2 個(gè)處理溫度均為（0±0.5）℃，空氣相對(duì)濕度均為90%～95%。果實(shí)貯藏30 d 后取出，測(cè)定相關(guān)品質(zhì)。每瓶裝40 個(gè)果，3 次重復(fù)。

配氣方法：鋼瓶高壓CO2（遼寧省葫蘆島市偉業(yè)氣體有限公司生產(chǎn)）由氣調(diào)配氣系統(tǒng)按照試驗(yàn)設(shè)定的組成分流調(diào)節(jié)，輸入玻璃瓶中，氣體流量為150 mL/min。CO2濃度用COMBO 280 Gas Analyzer（意大利 FRUIT CONTROL）儀器測(cè)定。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

（1）果實(shí)品質(zhì)。去皮硬度采用GS-15 水果質(zhì)地分析儀（GUSS 公司，南非）測(cè)定；可溶性固形物含量采用PR-101α折糖儀（ATAGO 公司，日本）測(cè)定；可滴定酸含量和維生素C 含量均使用自動(dòng)智能電位滴定儀（808 Titrando，瑞典），分別用0.1 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)液和2,6-二氯靛酚吲哚酚鈉鹽滴定。

（2）酶活性和丙二醛含量的測(cè)定。過氧化物酶（POD）活性用愈瘡木酚比色法[19]測(cè)定，多酚氧化酶（PPO）活性參照Wang 等[20]方法測(cè)定，丙二醛（MDA）含量利用硫代巴比妥酸比色法[21]測(cè)定。

（3）抗氧化物質(zhì)含量。過氧化氫（H2O2）含量參照Patterson 等[22]的方法測(cè)定，可溶性蛋白含量利用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[23]測(cè)定。

（4）GSH、GSSG 蛋白和維生素C 含量。均參照試劑盒說明書測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 處理，用SPSS 13.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果肉褐變對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響

貯藏1 個(gè)月后，高濃度CO2處理果肉已經(jīng)全部發(fā)生褐變，對(duì)照果肉沒有變化。

蘋果果肉硬度既可以反映果實(shí)的成熟衰老程度，又可以反映果實(shí)細(xì)胞的受傷害程度。由表1 可知，通過30 d 高濃度CO2氣體處理后，‘寒富’果肉硬度下降到檢不出的水平，對(duì)照果肉硬度為5.77 kg/cm2，只下降了0.28 kg/cm2。高濃度CO2處理對(duì)果實(shí)可溶性固形物含量影響不大，貯藏30 d 后，處理和對(duì)照果實(shí)可溶性固形物含量分別為13.6%、13.7%。貯藏期間，處理與對(duì)照果實(shí)的可滴定酸含量都有所下降。貯藏30 d 后，高濃度CO2處理果實(shí)可滴定酸含量為0.22%，下降了37.14%；而對(duì)照果實(shí)可滴定酸含量為0.29%，只下降了17.14%。果實(shí)維生素C 含量都大幅度下降，高濃度CO2處理30 d后，維生素C 含量下降到檢不出的水平，對(duì)照果實(shí)下降了65.38%。

表1 果肉褐變后的‘寒富’及對(duì)照果實(shí)品質(zhì)

2.2 果肉褐變對(duì)果實(shí)PPO 和POD 活性的影響

果實(shí)組織褐變屬于酶促褐變，酚類物質(zhì)是組織酶褐變的反應(yīng)底物，PPO 可以將酚類氧化成醌，從而引起果實(shí)褐變，組織褐變往往伴隨PPO 活性的升高[24]。由表2 可知，剛采收后的‘寒富’果實(shí)PPO活性為3.02 U·min-1·g-1。貯藏30 d 后，高濃度CO2處理的‘寒富’果實(shí) PPO 活性升高到 15.34 U·min-1·g-1，對(duì)照果實(shí)PPO 活性則略有升高，為3.52 U·min-1·g-1。

表2 果肉褐變后的‘寒富’及對(duì)照果實(shí)PPO 和POD 活性

POD 在植物組織中既可作為清除自由基的保護(hù)酶，又是誘導(dǎo)酚類物質(zhì)氧化促進(jìn)果實(shí)褐變的酶[24]。果實(shí)剛采收后的POD 活性為14.59 U·min-1·g-1，通過30 d 貯藏后，高濃度CO2處理果實(shí)POD 活性下降到5.62 U·min-1·g-1，對(duì)照果實(shí)POD 活性略有升高，為19.82 U·min-1·g-1（表2）。

2.3 果肉褐變對(duì)果實(shí)MDA 和H2O2含量的影響

在植物衰老生理和抗性生理研究中，丙二醛（MDA）含量是一個(gè)常用指標(biāo)。丙二醛是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，主要導(dǎo)致膜脂過氧化，損傷細(xì)胞質(zhì)膜，使得細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能上受到損傷，從而影響一系列生理生化反應(yīng)的正常進(jìn)行，其含量高低可以反映細(xì)胞膜脂氧化的程度[25]。由表3 可知，剛采收后的果實(shí)MDA 含量為0.25 μmol/g。貯藏30 d后，高濃度CO2處理果實(shí)MDA 含量大幅度上升，為0.85 μmol/g，而對(duì)照果實(shí)MDA 含量則略有下降，下降了16.00%。由此可見，高濃度CO2處理的果實(shí)細(xì)胞膜脂過氧化程度極為嚴(yán)重。

表3 果肉褐變后的‘寒富’及對(duì)照果實(shí)MDA 和H2O2含量

過氧化氫（H2O2）是生物體內(nèi)最常見的活性氧分子，也是體內(nèi)活性氧相互轉(zhuǎn)化的樞紐。一方面，H2O2可以直接或間接地氧化細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子，使細(xì)胞膜遭受損害，從而加速細(xì)胞的衰老和解體；另一方面，H2O2也是許多氧化應(yīng)急反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[26]。貯藏30 d 后，與基礎(chǔ)值相比較，高濃度CO2處理和對(duì)照果實(shí)的H2O2含量均大幅度下降，高濃度CO2處理果實(shí)H2O2含量下降了73.85%，而對(duì)照果實(shí)H2O2含量下降了41.54%，說明高濃度CO2處理果實(shí)內(nèi)活性氧分子含量更少，抗氧化能力更弱（表3）。

2.4 果肉褐變對(duì)果實(shí)中 GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG 的影響

谷胱甘肽氧化型/還原型（GSH/GSSG）是細(xì)胞內(nèi)最重要的氧化還原對(duì)之一，細(xì)胞內(nèi)GSH 和GSSG含量以及GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)[27]。由表4 可知，貯藏30 d 后，與基礎(chǔ)值相比，高濃度CO2處理GSH含量顯著降低，下降了33.49%，GSSG 含量則明顯增加，增加了50.97%，而對(duì)照二者的含量則變化較小，GSH 含量下降了3.88%，GSSG 含量增加了10.68%。貯藏30 d 后，高濃度CO2處理GSH/GSSG 為4.46，對(duì)照為8.79，表明高濃度CO2處理果實(shí)內(nèi)的氧化還原狀態(tài)比對(duì)照果實(shí)差。

表4 果肉褐變后的‘寒富’及對(duì)照果實(shí)GSH、GSSG 含量和GSH/GSSG

3 結(jié)論與討論

蘋果果肉褐變與貯藏中的低O2和高CO2氣體環(huán)境密切相關(guān)，尤其是高CO2易導(dǎo)致果實(shí)褐變。有研究認(rèn)為[28]，氣調(diào)貯藏中的CO2濃度超過1 kPa 時(shí)，‘粉紅女士’蘋果出現(xiàn)了果肉褐變現(xiàn)象，且褐變程度隨著貯藏環(huán)境中CO2濃度的增加和O2濃度的降低而增加。Hatoum 等[29]認(rèn)為與能量和脂質(zhì)有關(guān)過程，包括氧化應(yīng)激的重要作用，已被證明與果實(shí)褐變息息相關(guān)。本研究結(jié)果表明，‘寒富’果肉褐變伴隨著果實(shí)內(nèi)維生素C、H2O2、氧化型谷胱甘肽含量的顯著或極顯著下降，這表明果實(shí)內(nèi)部自由基產(chǎn)生和清除的平衡系統(tǒng)遭到破壞，導(dǎo)致膜脂過氧化程度加劇，從而MDA 含量極顯著升高。而GSH/GSSG 急劇下降，也能反映出果實(shí)內(nèi)細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)，充分說明‘寒富’發(fā)生果肉褐變是與果實(shí)內(nèi)細(xì)胞氧化還原平衡失衡有關(guān)。