凌曉寧，劉 群，張 榮，章啟慧，章帥文，李昆太,4*

響應(yīng)面法優(yōu)化羽毛降解菌Ochrobactrum intermedium JY-25的降解培養(yǎng)基

凌曉寧1，劉 群2，張 榮1，章啟慧1，章帥文3，李昆太1,4*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室，江西 南昌 330045；2. 江西交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院 信息工程系，江西 南昌 330013；3. 江西省科學(xué)院 微生物研究所，江西 南昌 330096；4. 廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088）

【目的】作為構(gòu)成羽毛主要成分的角蛋白，因其存在大量相互交聯(lián)的二硫鍵、氫鍵和鹽鍵等化學(xué)鍵，導(dǎo)致羽毛結(jié)構(gòu)穩(wěn)定難以被常規(guī)手段降解。相較于物理、化學(xué)方法降解廢棄羽毛，利用微生物產(chǎn)生的角蛋白酶使廢棄羽毛變成可再生資源，具有高效、環(huán)保的優(yōu)點。課題組前期從家禽養(yǎng)殖場的土壤中分離、篩選到一株羽毛降解菌，經(jīng)鑒定該菌株為中間蒼白桿菌JY-25。研究旨在進一步提高中間蒼白桿菌JY-25的羽毛降解率，為今后工業(yè)化降解廢棄羽毛提供依據(jù)?！痉椒ā恳来尾捎脝我蛩卦囼?、Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)面法對中間蒼白桿菌JY-25的羽毛降解培養(yǎng)基進行優(yōu)化?！窘Y(jié)果】通過單因素試驗確定了在降解培養(yǎng)基中外加碳源（糊化淀粉）和氮源（玉米粉）時，都能提高羽毛的降解率。Plackett-Burman試驗設(shè)計發(fā)現(xiàn)降解培養(yǎng)基的8種成分中，糊化淀粉、硫酸亞鐵和羽毛量是影響中間蒼白桿菌JY-25對羽毛降解率的顯著因素。最后通過響應(yīng)面法確定了最佳降解培養(yǎng)基的組分為：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、氯化鈉0.3 g/L、硫酸鎂0.025 g/L、氯化鈣0.025 g/L，在該優(yōu)化的培養(yǎng)基配方下，菌株JY-25的羽毛降解率高達76.31%，相較于初始的降解率提高了24.4%?！窘Y(jié)論】經(jīng)過多種優(yōu)化方式，顯著地提高了中間蒼白桿菌JY-25的羽毛降解率，為菌株用于工業(yè)化降解廢棄羽毛提供了理論基礎(chǔ)。

羽毛；中間蒼白桿菌JY-25；Plackett-Burman試驗設(shè)計；響應(yīng)面法；降解培養(yǎng)基優(yōu)化

【研究意義】近年來，隨著肉制品的消費，全球每年會產(chǎn)生幾千萬噸角蛋白廢物，而羽毛廢物約占850萬t[1]。羽毛是由90%的角蛋白組成，角蛋白又存在α-角蛋白和β-角蛋白之分，其中α-角蛋白主要存在于人和動物的毛發(fā)中，β-角蛋白主要存在于人的指甲、動物的蹄、角和羽毛中[2, 3]。由于角蛋白鏈緊密堆積在α-角蛋白和β-角蛋白中，形成超螺旋多肽鏈，從而產(chǎn)生機械穩(wěn)定性，導(dǎo)致其對常見蛋白水解酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜水解酶等）具有較強的抵抗力[4]。當前，對于羽毛的降解常采用高溫高壓、強酸強堿、填埋或焚燒等物理化學(xué)方法，但這些降解過程不僅會導(dǎo)致大量必需氨基酸的流失，而且還存在能源的巨大消耗，給環(huán)境造成壓力[5]。微生物法降解羽毛作為另一種降解羽毛的方法，由于在降解過程中不僅能避免氨基酸的破壞，而且高效環(huán)保，近年來越來越受到重視[6]。當前，已經(jīng)分離到能夠降解羽毛的微生物，主要來自于細菌、真菌、放線菌等[7-8]。【前人研究進展】響應(yīng)面法是將統(tǒng)計與數(shù)學(xué)方法結(jié)合，用于選擇最佳的實驗條件，以最少的實驗次數(shù)獲得最合適的結(jié)果[9]。吳翔等[10]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了煙草根際促生菌MT-002-B-12產(chǎn)吲哚-3-乙酸的發(fā)酵條件。肖美娟等[11]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了羰基還原酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基菌體酶活和生物量分別比優(yōu)化前提高了233.33%和20.39%。蔣彪等[12]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了芽孢桿菌CJPE209產(chǎn)角蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，在最優(yōu)培養(yǎng)基條件下角蛋白酶酶活較優(yōu)化前提高了20.74%。Ambati等[13]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了檸檬酸生產(chǎn)的培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件。Kieu等[14]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了厭氧菌株從可溶性淀粉中產(chǎn)氫氣的培養(yǎng)條件。Abdul Gafar等[15]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了芽孢桿菌UPM-AAG1在含羽毛培養(yǎng)基中產(chǎn)角蛋白酶的條件。

【本研究切入點】目前，對于廢棄羽毛的大規(guī)模生物降解利用，還處在實驗室研究階段，未找到能工業(yè)化降解羽毛的菌株。本研究以課題組篩選到的一株羽毛降解菌株為出發(fā)菌株，優(yōu)化了該菌株對羽毛的降解率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究依次通過用單因素試驗、Plackett-Burman試驗設(shè)計和響應(yīng)面法提高菌株對羽毛的降解率，使菌株的降解率得到顯著提高，為后期該菌株工業(yè)化降解羽毛和實現(xiàn)蛋白質(zhì)資源的再生利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株 中間蒼白桿菌（）JY-25，現(xiàn)保存于江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室。

培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。降解培養(yǎng)基：羽毛4 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.025 g，CaCl20.025 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃滅菌20 min。

1.2 單因素優(yōu)化菌株對羽毛的降解率

菌株JY-25對羽毛的降解 用20 mL帶有玻璃珠的無菌水將保存的菌株JY-25斜面洗出，充分搖勻制成菌體懸液。吸取200mL的菌懸液加入到裝有40 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在37 ℃、160 r/min培養(yǎng)12 h得到種子液。按2%的接種量接種種子液于降解培養(yǎng)基中，繼續(xù)在37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)72 h。

羽毛降解率的測定 將發(fā)酵好的天然羽毛用4層紗布過濾，所得的濾渣置于恒溫干燥箱中，于80 ℃下干燥至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量，按如下公式計算羽毛的降解率：

1.2.1 外加碳源對菌株降解羽毛的影響 在降解培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別外加10 g/L的甘露醇、糊化淀粉、淀粉、山梨醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳糖和蔗糖，以不加任何碳源為對照，每組3個重復(fù)。通過對羽毛降解率的測定，考察外加碳源對菌株降解羽毛的影響。

1.2.2 外加氮源對菌株降解羽毛的影響 在初始降解培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別外加10 g/L的硝酸銨、硝酸鉀、氯化銨、牛肉膏、硫酸銨、尿素、玉米粉、黃豆餅粉、酵母浸粉和蛋白胨，以不加任何氮源為對照，每組3個重復(fù)。通過對羽毛降解率的測定，考察外加氮源對菌株降解羽毛的影響。

1.3 Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選降解培養(yǎng)基顯著因子

選擇11個因素，通過Plackett-Burman設(shè)計12次實驗，考察改良的降解培養(yǎng)基的8個因素對天然羽毛降解率的影響，每個因素分為高（+1）和低（-1）兩個水平，以羽毛的降解率為響應(yīng)值，挑選出置信度大于95%的因素作為顯著因素。另外增加3個因素為虛擬變量，用于估計誤差。試驗設(shè)計見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平

1.4 響應(yīng)面優(yōu)化菌株對羽毛的降解率

從Plackett-Burman試驗設(shè)計的結(jié)果中，篩選出對羽毛降解率影響顯著的3個因子。根據(jù)中心組合設(shè)計的原理，以羽毛降解率為響應(yīng)值，設(shè)計3因素5水平試驗來確定降解培養(yǎng)基最佳組分，采用Design-expert 8.0軟件對試驗結(jié)果進行回歸分析和方差分析，試驗設(shè)計見表2。

表2 中心組合試驗設(shè)計因素與水平

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2019進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用Design-expert 8.0軟件對PB試驗和中心組合試驗進行方差分析，使用Origin 2018對數(shù)據(jù)進行作圖分析，photoshop CC 2019進行圖像處理。在統(tǒng)計學(xué)上＜0.05認為差異顯著、＜0.01差異極顯著、＞0.05差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 外加碳源對菌株降解率影響

外加碳源對菌株降解率的影響如圖1所示，從圖1可知，與空白對照組相比，果糖、阿拉伯糖、麥芽糖的加入使羽毛的降解率大幅下降，當使用糊化淀粉作為外加碳源時，羽毛的降解率最大，可以達到54.52%。故選擇糊化淀粉作為降解培養(yǎng)基的外加碳源。

2.2 外加氮源對菌株降解率的影響

外加氮源對菌株降解率的影響如圖2所示，從圖2可知，與空白對照組相比，只有降解培養(yǎng)基中加入玉米粉時，羽毛的降解率才有所提升，其它種類的氮源對于羽毛的降解率沒有促進作用。外加氮源為玉米粉時，羽毛的降解率達到55.8%。因此選擇玉米粉為降解培養(yǎng)基的外加氮源。

圖1 外加碳源種類對菌株JY-25降解羽毛的影響

2.3 Plackett-Burman試驗分析

Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果如表3所示，利用Design-expert 8.0軟件對結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表4所示。模型的值在95%的置信區(qū)間內(nèi)小于0.05，其決定系數(shù)2=0.988 9，校正系數(shù)為0.959 2，說明模型能解釋95.92%的實驗數(shù)據(jù)，證明此模型合理。由表4可知，=0.05時，糊化淀粉、硫酸亞鐵和羽毛量的值在95%的置信區(qū)間內(nèi)都小于0.05，表明糊化淀粉、硫酸亞鐵和羽毛量是影響菌株對羽毛降解率的顯著因素。

表3 Plackett-Burman 試驗設(shè)計與結(jié)果

表中最終值為3次重復(fù)試驗的均值，下同

表4 Plackett-Burman試驗方差分析

“*”表明差異顯著，<0.05；“**”表明差異極顯著，<0.01；下同

2.4 響應(yīng)面試驗分析

利用Design-expert 8.0軟件進行中心組合試驗設(shè)計，其試驗結(jié)果如表5所示，選取糊化淀粉（A）、硫酸亞鐵（B）和羽毛（C）為試驗因素，以羽毛的降解率（）為響應(yīng)值。對中心組合試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到羽毛降解率的二次回歸模型方程為：

=64.98+3.37A-0.23B-8.81C+0.78AB-4.26AC+0.52BC-0.60A2-0.95B2-4.51C2

方程中表示羽毛降解率（%），A、B、C分別表示糊化淀粉、硫酸亞鐵、羽毛在培養(yǎng)基中的濃度（g/L）。方程中C的系數(shù)較大，表明羽毛量對菌株降解羽毛的降解率最具有顯著性意義。

對二次回歸模型進行方差分析，結(jié)果如表6所示。由表6可知，此模型的值為0.008 0，遠小于0.05，模型的多元相關(guān)系數(shù)2=0.825 5，校正系數(shù)Adj2=0.668 4，表明該模型擬合度良好。失擬項值為0.500 5，差異不顯著(>0.05)，表明該回歸方程擬合度較高，可以用此數(shù)學(xué)模型推測試驗的結(jié)果。其中差異不顯著（>0.05）有A，B，AB，AC，BC，A2和B2，差異顯著（0.01<<0.05）有C2，差異極顯著有C，以表7的和值為比較標準，影響羽毛降解率的因素由大到小依次為羽毛（C），糊化淀粉（A），硫酸亞鐵（B）。

表5 中心組合試驗設(shè)計與結(jié)果

表6 響應(yīng)面二次模型的方差分析

2.5 響應(yīng)面交互作用分析

分別將糊化淀粉（A）、硫酸亞鐵（B）、羽毛（C）中的一個因子固定在中心點水平，分析另外兩個因素及其交互作用對羽毛降解率的影響。其等高線和響應(yīng)面如圖3～5所示。由圖3～5等高線圖可知，糊化淀粉（A）、硫酸亞鐵（B）、羽毛（C）3個因素之間兩兩交互作用不明顯，這與方差分析結(jié)果一致。由圖3～5響應(yīng)面圖可知，糊化淀粉的響應(yīng)面變化坡度最陡（圖3，圖4），且隨著糊化淀粉濃度的提高，羽毛降解率顯著提升；羽毛的響應(yīng)面變化曲折（圖4，圖5），隨著羽毛含量的提高，羽毛降解率先上升后下降；硫酸亞鐵的響應(yīng)面變化較平緩（圖3，圖5），隨著硫酸亞鐵濃度的提高，羽毛降解率呈現(xiàn)平緩趨勢。

圖3 糊化淀粉和硫酸亞鐵對羽毛降解率的等高線和響應(yīng)面

圖4 糊化淀粉和羽毛量對羽毛降解率的等高線和響應(yīng)面

圖5 硫酸亞鐵和羽毛量對羽毛降解率的等高線和響應(yīng)面

2.6 響應(yīng)面最優(yōu)工藝分析

利用Design-expert 8.0軟件分析響應(yīng)面的最優(yōu)工藝，可得到一個理論上羽毛的降解率最高的組合為：糊化淀粉15 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L和羽毛2 g/L，此時羽毛的降解率為76.31%。由此得到菌株JY-25降解羽毛的最適培養(yǎng)基組成為：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L，氯化鈉0.3 g/L，硫酸鎂0.025 g/L，氯化鈣 0.025 g/L。

3 結(jié)論與討論

響應(yīng)面法可以從眾多因素中快速篩選出關(guān)鍵因素并優(yōu)化培養(yǎng)條件，可以避免單因素優(yōu)化帶來的缺陷，是一種高效而簡便的方法[16]。該方法已成功應(yīng)用于化工、工程、生物等許多領(lǐng)域[17-19]。研究以實驗室篩選的一株羽毛降解菌JY-25為出發(fā)菌株，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用軟件Design-expert 8.0進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，以羽毛降解率作為響應(yīng)值，對羽毛的降解培養(yǎng)基進行優(yōu)化。

通過單因素試驗確定了在降解培養(yǎng)基中外加碳源（糊化淀粉）和氮源（玉米粉）時，都能提高羽毛的降解率。Plackett-Burman試驗設(shè)計發(fā)現(xiàn)降解培養(yǎng)基的8種成分中，糊化淀粉、硫酸亞鐵和羽毛量是影響中間蒼白桿菌JY-25對羽毛降解率的顯著因素。最后通過響應(yīng)面法確定了最佳降解培養(yǎng)基的組分為：羽毛2 g/L、糊化淀粉15 g/L、玉米粉10 g/L、硫酸亞鐵0.02 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、氯化鈉0.3 g/L、硫酸鎂0.025 g/L、氯化鈣0.025 g/L，在該優(yōu)化的培養(yǎng)基配方下，菌株JY-25對羽毛的降解率高達76.31%，相較于初始的降解率提高了24.4%，大大提高了廢棄羽毛的利用率。研究通過優(yōu)化羽毛降解菌JY-25的降解培養(yǎng)基，提高了廢棄羽毛的降解率，不僅可以保護環(huán)境，還可以促進可持續(xù)發(fā)展，在蛋白質(zhì)飼料生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，可為后期工業(yè)化降解羽毛提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of the Degradation Medium of Feather-degrading BacteriaJY-25 by Response Surface Methodology

LING Xiaoning1, LIU Qun2, ZHANG Rong1, ZHANG Qihui1, ZHANG Shuaiwen3, LI Kuntai1,4*

（1. College of Biological Sciences and Engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2.Department of Information Engineering,Jiangxi Vocational and Technical College of Communications, Nanchang 330013, China; 3. Institute of Microbiology, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330096, China; 4. College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524088, China）

Keratin, the main component of feathers, has a large number of cross-linked disulfide bonds, hydrogen bonds, and salt bonds among other chemical bonds, makes the feather structure stable and difficult to be degraded by conventional means. Compared with the degradation of waste feathers by physical and chemical methods, the use of keratinase produced by microorganisms to turn waste feathers into renewable resources has the advantages of high efficiency and environmental protection. The research team isolated and screened a feather-degrading bacterium from the soil of the poultry farm in the early stage, and the strain was identified asJY-25, which could be used to further improve the feather degradation rate ofJY-25 to deal with waste feathers industrially in the future.The single factor test, Plackett-Burman test designs and response surface methods were used to optimize the feather degradation medium ofJY-25.Through single-factor experiments, it was determined that adding carbon sources (gelatinized starch) and nitrogen sources (corn meal) to the degradation medium could increase the degradation rates of feathers. The Plackett-Burman experimental designs found that among eight components of the degradation medium, gelatinized starch, ferrous sulfate and feather amount were significant factors affecting the degradation rates ofJY-25 on feathers. Finally, the components of the optimal degradation medium were determined by response surface methodology: feather 2 g/L, gelatinized starch 15 g/L, corn flour 10 g/L, ferrous sulfate 0.02 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1.5 g/L, sodium chloride 0.3 g/L, magnesium sulfate 0.025 g/L, and calcium chloride 0.025 g/L. Under the optimized medium formula, the degradation rate of the strain JY-25 on feathers was as high as 76.31%, which increased by 24.4% compared with the initial degradation rate.After a variety of optimization methods, the feather degradation rate ofJY-25 had been significantly improved, providing a theoretical basis for the strain to be used for the industrial degradation of discarded feathers in the future.

feather;JY-25; Plackett-Burman experimental design; response surface methodology; optimization of degradation medium

Q939.96

A

2095-3704（2021）02-0228-09

2021-03-11

2021-04-26

國家自然科學(xué)基金項目（31760546）

凌曉寧（1995—），男，碩士生，主要從事微生物資源開發(fā)與利用方面的研究，705377915@qq.com；*通信作者：李昆太，教授，博士，atai78@sina.com。

凌曉寧, 劉群, 張榮, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化羽毛降解菌JY-25的降解培養(yǎng)基[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2021, 44(2): 228-236.