劉姝睿，吳雪娥，王遠(yuǎn)鵬

（廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院化學(xué)工程與生物工程系，福建廈門361005）

引 言

微生物胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）是電活性微生物通過特定的呼吸鏈將胞內(nèi)氧化電子供體產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移到胞外電子受體，實(shí)現(xiàn)電子受體還原的同時(shí)維持微生物自身生長的過程[1-2]。該現(xiàn)象于1987 年由Lovley 等[3]發(fā)現(xiàn)，此后EET 受到了眾多科研工作者的關(guān)注?；谶@種能力，EET在清潔電力生產(chǎn)、污水處理、生物修復(fù)、生物傳感、高能燃料轉(zhuǎn)化合成等方面具有重要的應(yīng)用潛力和廣闊的發(fā)展遠(yuǎn)景[4-5]。然而，現(xiàn)階段電活性微生物和電子受體之間相對低效的電子傳遞是影響EET在實(shí)際中應(yīng)用的關(guān)鍵因素。因此開發(fā)EET效率的改善手段，研究其傳遞機(jī)理、影響因素及應(yīng)用前景研究具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

目前，強(qiáng)化微生物EET 的手段主要是通過內(nèi)部遺傳改造和外部納米材料介導(dǎo)的兩種途徑[6-7]。對電活性微生物進(jìn)行遺傳改造，主要是從以下兩大方面：一是直接增加電子傳遞相關(guān)的功能基因的表達(dá)；二是提高調(diào)節(jié)微生物胞外呼吸的蛋白活性。然而，只有少數(shù)表征良好的電活性微生物可用于遺傳改造，且EET 的機(jī)制目前尚未完全闡明，導(dǎo)致大多數(shù)遺傳工具無法廣泛使用，限制了遺傳改造技術(shù)的應(yīng)用。隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，在生物領(lǐng)域顯示出了潛在的應(yīng)用前景。近年來，對納米材料與微生物偶聯(lián)作用的研究日趨活躍，尤其是納米材料對EET 的作用研究廣受關(guān)注[8]。納米材料與電活性微生物主要存在電子轉(zhuǎn)移和物理接觸的聯(lián)系，納米材料介導(dǎo)EET 的過程是決定其應(yīng)用的關(guān)鍵，因此其作用機(jī)制研究是該領(lǐng)域亟需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題之一。本文將重點(diǎn)闡述納米材料在EET 過程中的作用，以及納米材料-電活性微生物界面構(gòu)筑的研究進(jìn)展，并展望這個(gè)領(lǐng)域今后的發(fā)展趨勢。

1 電活性微生物的EET方式

目前，電活性微生物中已發(fā)現(xiàn)的電子傳遞方式主要分為兩種：（1）直接電子傳遞（direct electron transfer，DET），通過胞外膜上的細(xì)胞色素c或納米導(dǎo)線將電子傳遞至胞外受體；（2）間接電子傳遞（mediated electron transfer，MET），通過電子穿梭體介導(dǎo)電子傳遞至胞外受體[9]。這兩種EET 方式并非相互孤立的，一種微生物可能同時(shí)具有這兩種EET模式。已鑒定的兩種電活性微生物，希瓦氏菌Shewanella oneidensisMR-1（S. oneidensis）和硫還原地桿菌Geobacter sulfurreducens（G.sulfurreducens），目前研究最為全面，它們已被用作了解其他物種同源系統(tǒng)的模式菌株[10-11]，其電子傳遞途徑如圖1所示。

1.1 直接電子傳遞

圖1 S.oneidensis和G.sulfurreducens胞外電子傳遞方式示意圖[8-9,12]Fig.1 Extracellular electron transfer model of S.oneidensis and G.sulfurreducens[8-9,12]

1.1.1 細(xì)胞色素c電活性微生物可以依靠細(xì)胞胞外膜上的細(xì)胞色素c與胞外受體之間的直接物理接觸來傳遞電子[13]。S.oneidensis中的電子傳遞途徑被研究者們稱為Mtr 途徑（metal reduction pathway），代謝過程中產(chǎn)生的電子先被細(xì)胞膜內(nèi)的細(xì)胞色素CymA 接受，再通過c型色素蛋白Fcc3和STC跨過周質(zhì)空間傳遞至MtrCAB 復(fù)合體[14]。然而，周質(zhì)空間介導(dǎo)電子的細(xì)胞色素并不僅限于Fcc3 和STC，Sturm等[12]證明同時(shí)敲除這兩種細(xì)胞色素蛋白表達(dá)相關(guān)基因的突變株，在經(jīng)過長時(shí)間的滯后期后仍能在檸檬酸中生長。MtrCAB 復(fù)合體負(fù)責(zé)希瓦氏菌的周質(zhì)空間和外膜表面的電子連接，其中MtrA 和MtrC 分別從周質(zhì)和細(xì)胞外側(cè)錨定在MtrB 形成的孔道內(nèi)。暴露于細(xì)胞外膜表面的MtrC 和OmcA，作為呼吸鏈末端蛋白，實(shí)現(xiàn)胞外電子受體的還原[15]。

G. sulfurreducens的EET 模 式 與S. oneidensis類似，位于內(nèi)膜與細(xì)胞質(zhì)相連的MacA 可以接受醌池傳遞出的電子，并將其轉(zhuǎn)移給周質(zhì)中的三亞鐵紅素PpcA 或PpcD，跨過周質(zhì)空間后，再將電子傳遞給外膜蛋白OMCs（包括OmcB、OmcE、OmcS 及OmcZ），最終傳遞至胞外的固體電子受體上，完成了電子的向外傳遞[16-17]。

1.1.2 納米導(dǎo)線 微生物納米導(dǎo)線（microbial nanowires）是從細(xì)胞表面延伸出長達(dá)數(shù)十微米的導(dǎo)電鞭毛[18]。這種導(dǎo)電結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)生物膜內(nèi)微生物與固體電子受體的接觸，也可以加強(qiáng)種間微生物電子傳遞。不同種微生物之間潛在的電子傳遞機(jī)制存在差異。研究發(fā)現(xiàn)，在S.oneidensis中存在兩種類型的納米導(dǎo)線，一種是基于導(dǎo)電的Ⅵ型菌毛，被認(rèn)為可以通過依賴芳香氨基酸間電子躍遷的方式傳遞 電 子[19]，另 一 種 由El-Naggar 等[20]最 近 發(fā) 現(xiàn)S.oneidensis外膜與周質(zhì)空間可以向外延伸形成富含細(xì)胞色素c的膜囊泡納管，電子通過納管上的細(xì)胞色素c以躍遷方式傳遞。對于G.sulfurreducens，多數(shù)研究者也認(rèn)為G.sulfurreducens可以表達(dá)多種納米導(dǎo)線。早期研究發(fā)現(xiàn)G.sulfurreducens鞭毛上有PliA蛋白，PliA 蛋白羧基端芳香族氨基酸π-π 軌道的重疊，使鞭毛具有與金屬相似的導(dǎo)電性，從而引起電子傳遞[21]。而最新的冷凍電鏡結(jié)果表明，在G.sulfurreducens的表面還存在OmcS 納米導(dǎo)線，OmcS納米導(dǎo)線中的血紅素分子連續(xù)排列，空間間距3.5～6 ?(1 ?=0.1 nm)，構(gòu)成電子傳遞的通路。Pirbadian等[22]研究發(fā)現(xiàn)，希瓦氏菌的納米導(dǎo)線是其細(xì)胞膜的外突而非蛋白微絲，與地桿菌的納米導(dǎo)線有本質(zhì)區(qū)別。Malvankar 等[23]用靜電力顯微鏡證實(shí)了G.sulfurreducens的納米導(dǎo)線連接著細(xì)菌，并實(shí)現(xiàn)細(xì)菌間的電子傳遞。因此，這種優(yōu)良的導(dǎo)電性和特殊的結(jié)構(gòu)形態(tài)顯示出納米導(dǎo)線機(jī)制在促進(jìn)遠(yuǎn)距離EET方面的潛力。

1.2 間接電子傳遞

間接電子傳遞是基于電子穿梭分子在電子供體和受體之間的擴(kuò)散[24-25]。與整個(gè)細(xì)胞相比，這些分子具有更小的尺寸和更高的擴(kuò)散，增強(qiáng)了它們與固體電子受體可用表面積的界面能力，從而大大提高EET 效率。研究發(fā)現(xiàn)微生物能自分泌到細(xì)胞外具有電子傳遞功能的穿梭體，如黃素類、吩嗪類等[26-27]。Brutinel等[28]證實(shí)了S.oneidensis分泌黃素類物質(zhì)作為電子穿梭體介導(dǎo)EET 的可能機(jī)制，如圖1所示，微生物在胞內(nèi)分解有機(jī)物所產(chǎn)生的部分黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dianucleotide，F(xiàn)AD）被轉(zhuǎn)運(yùn)至周質(zhì)空間，然后在UshA（5'-核苷酸酶）的作用下水解為黃素單核苷酸（flavin mononucleotide，F(xiàn)MN）和 腺 苷 一 磷 酸（adenosine monophosphate，AMP）[29]。FMN可以自由穿過外膜擴(kuò)散至胞外，也或者進(jìn)一步水解為核黃素（riboflavin，RF）。胞外游離態(tài)的FMNox得到來自MtrC/OmcA 的電子而被還原為FMNred，然后再通過擴(kuò)散將電子傳遞至胞外電子受體緊接被氧化，以此方式來介導(dǎo)電活性微生物與胞外受體間的電子傳遞過程。除了微生物自分泌的小分子，天然存在或人工合成的可溶性分子也具有傳遞電子的能力，如醌類、腐殖質(zhì)等[30-31]。另外，Okamoto 等[32]研究發(fā)現(xiàn)S. oneidensis分泌的黃素，除了以游離形式存在，還可以與外膜細(xì)胞色素形成細(xì)胞色素-半醌復(fù)合物進(jìn)行電子傳遞。這種復(fù)合物的氧化還原反應(yīng)速率比游離形式的黃素快103～105倍。但這種結(jié)合態(tài)會隨著S. oneidensis代謝的強(qiáng)弱而形成與消散，調(diào)控著EET 的程度以及細(xì)胞內(nèi)代謝活動。對于這種結(jié)合形式，電子如何從復(fù)合物傳遞至電子受體，是繼續(xù)穿梭？還是直接接觸電子受體表面?zhèn)鬟f？以及這個(gè)過程對微生物的重要性如何？目前還不清楚。

2 納米材料影響EET的主要因素

電活性微生物至胞外受體的電子轉(zhuǎn)移能力是影響微生物EET 體系效率的關(guān)鍵。納米科學(xué)的快速發(fā)展對微生物與胞外受體界面修飾從而促進(jìn)EET提供了重要支撐。已有研究表明，引入納米材料可以降低電子從電活性微生物到胞外受體的界面阻力，增強(qiáng)電子從電活性微生物到胞外受體的轉(zhuǎn)移，改善微生物的附著和生物膜的形成，并促進(jìn)特定的代謝活性[33]。納米材料-電活性微生物界面電子傳遞過程受多種因素影響，如電子轉(zhuǎn)移能力、氧化還原電勢、表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、生物相容性、界面相互作用、微生物種類、電子受體以及外界環(huán)境等。這里主要綜述了納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力、氧化還原電勢、表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)、生物相容性以及納米材料-微生物界面構(gòu)筑對EET過程的影響。

2.1 納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力

納米材料能夠介導(dǎo)電活性微生物EET 與其自身電子轉(zhuǎn)移能力（導(dǎo)電性、表面官能團(tuán)等）密切相關(guān)[34]。一般來說，納米材料的導(dǎo)電性越高，越可以有效地接受電子并從微生物傳遞至終端受體。碳基材料具有高的離域電子結(jié)構(gòu)和載流子遷移率，并且碳基材料表面的氧化還原基團(tuán)也具有輔助間接電子傳遞的效果[35]，因此常被應(yīng)用于增強(qiáng)生物膜的導(dǎo)電性進(jìn)而促進(jìn)EET。Liang 等[36]考察了碳納米管、活性炭和柔性石墨分別作為微生物燃料電池陽極對S. oneidensisMR-1 產(chǎn)電性能影響，其中以碳納米管作為陽極的MFC 的功率密度最高，內(nèi)阻最低，分別為402 mW/m2和263 Ω。研究結(jié)果表明，相比于其他兩種碳基材料，碳納米管能夠有效地降低MFC 的陽極內(nèi)阻和歐姆內(nèi)阻。循環(huán)伏安法分析表明，碳納米管的介導(dǎo)使微生物EET 動力學(xué)增強(qiáng)，包括S.oneidensisMR-1 的外膜細(xì)胞色素OmcA 的氧化還原活性提高。除了利用納米材料本身性質(zhì)外，還可以通過引入表面缺陷和雜原子摻雜來調(diào)節(jié)納米材料的表面電荷轉(zhuǎn)移性質(zhì)。如You 等[37]使用氮原子摻雜打破碳納米管的化學(xué)惰性，在表面形成更多的缺陷，實(shí)驗(yàn)剖析證實(shí)多孔納米碳材料表面基團(tuán)與產(chǎn)電菌間的相互作用，有利于提高細(xì)菌胞外直接電子傳遞，進(jìn)而改善MFC性能。

除了碳基納米材料，研究人員也曾利用導(dǎo)電聚合物（如聚吡咯[38]、聚多巴胺[39]、聚乙烯二氧噻吩[40]等）介導(dǎo)EET 過程，一方面降低了微生物至電極受體之間的傳質(zhì)內(nèi)阻（Rct），以獲得更高的MFC 電流輸出；另一方面同時(shí)改善了生物相容性，以達(dá)到MFC長期有效運(yùn)行。金屬/金屬氧化物具有更高的導(dǎo)電能力或易調(diào)控的氧化還原電勢，也被引入介導(dǎo)EET過程。為了單一評估電子轉(zhuǎn)移能力對EET 的影響，Li等[41]將Fe(Ⅲ)作為末端電子受體，不同醌類作為介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的氧化還原中間體，探究氧化還原中間體的電子轉(zhuǎn)移能力與EET 速率的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)Fe(Ⅲ)還原速率與中間體的電子轉(zhuǎn)移能力呈很好的線性正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.933，表明納米材料介導(dǎo)的微生物EET 過程與納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力密不可分；同時(shí)研究者發(fā)現(xiàn)將電極作為電子受體時(shí)，EET 速率與電子轉(zhuǎn)移能力的相關(guān)系數(shù)只有0.801，這表明了納米材料的電子轉(zhuǎn)移能力對EET 的影響，不僅是納米材料本身性質(zhì)，也同時(shí)受其他因素影響，如電子受體等。

2.2 納米材料的氧化還原電勢

電活性微生物通過內(nèi)源或外源電子穿梭體促進(jìn)EET，主要是因?yàn)檫@些穿梭體具有合適的氧化還原電勢，能夠接受細(xì)胞色素c的電子變成還原態(tài)，再將其傳遞至胞外受體隨之被氧化。納米材料與微生物外膜、電子受體之間的電勢差，決定著電子傳遞反應(yīng)的驅(qū)動力。 Liu 等[42]研究發(fā)現(xiàn)在G.metallireducens和G. sulfurreducens共培養(yǎng)體系中，Anthraquinone-2, 6-disulfonate（AQDS）能增強(qiáng)乙醇氧化和琥珀酸還原，但其無法介導(dǎo)G.metallireducens和Methanosarcina barkeri互營促進(jìn)甲烷產(chǎn)生過程，主要因素可能是氧化還原電勢。AQDS/AHQDS 氧化還原電勢為E0= - 184 mV，可驅(qū)使延胡索酸的還原，而將CO2還原成CH4所需的電勢為E0(CO2/CH4)=- 240 mV，高于AQDS/AHQDS 氧化還原電勢。Li等[43]研究發(fā)現(xiàn)，將可溶的萘醌負(fù)載在氧化石墨烯上制備成固態(tài)的醌類化合物，能很好地促進(jìn)微生物的鉻還原能力。因此，與可溶性穿梭體類似，具有合理氧化還原電勢的固態(tài)納米材料也可以作為氧化還原介體介導(dǎo)微生物的電子傳遞。

一般來說，微生物由呼吸作用獲取的能力與納米材料的中點(diǎn)氧化還原電勢具有相關(guān)性[27]。理論上，納米材料的氧化還原電勢應(yīng)介于兩個(gè)氧化還原的半反應(yīng)之間[44]。納米材料的氧化還原電勢不應(yīng)低于終端電子受體的電勢，否則納米材料無法轉(zhuǎn)移電子；同理，若氧化還原電勢比電子受體高太多，則該反應(yīng)無法順利進(jìn)行[44]。Bian 等[45]通過Sn 摻雜In2O3納米線（SINWs）調(diào)節(jié)其氧化還原電勢到所需的范圍，以降低細(xì)菌-電極界面的能壘，與未修飾納米線的平面FTO 電極相比，SINW 修飾后可以使電流提高60 倍。微生物外膜的細(xì)胞色素氧化還原電勢位于-0.2 V，希瓦氏菌分泌的黃素氧化還原電勢為-0.4 V，合成Sn 摻雜的In2O3納米線的氧化還原電勢位于-0.57 V，在+ 0.2 V 的偏壓下，細(xì)胞外膜傳遞的電子可以被黃素的氧化態(tài)接收，而合成的納米線可以接受黃素還原態(tài)的電子并最后轉(zhuǎn)移到電極上。黃素/丙二酸的外源添加只增強(qiáng)/阻礙這一間接電子傳遞過程，也進(jìn)一步證實(shí)了合成的納米線可促進(jìn)間接電子傳遞過程。基于類似的策略，其他具有適當(dāng)氧化還原電勢的納米材料，如α-Fe2O3、γ-Fe2O3和Fe3O4可以匹配細(xì)菌OMCs的能級并縮小電荷轉(zhuǎn)移間隙，也被開發(fā)為可以有效介導(dǎo)EET 的納米材料[46-47]。O'Loughlin[48]采用多種納米材料介導(dǎo)S. putrefaciensCN32 還原纖鐵礦，研究顯示納米材料在表觀電勢為-254～+11 mV條件下與Fe還原速率具有較好的相關(guān)性，其中r2高達(dá)0.973。因此，熱力學(xué)因素氧化還原電勢不僅決定著納米材料介導(dǎo)EET 的順利進(jìn)行，還對納米材料介導(dǎo)EET 的速率具有很大影響。表1總結(jié)了部分納米材料的氧化還原電勢和電子轉(zhuǎn)移能力。

2.3 納米材料的表面結(jié)構(gòu)與性質(zhì)

納米材料的微納拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能有效直接影響微生物的黏附、增殖以及分化等生物學(xué)行為[52]。比如納米顆粒、納米管、納米線、納米纖維和納米片，不同的形貌會造成電子傳導(dǎo)距離和接觸活性位點(diǎn)面積的不同，因此會影響電子傳遞效率。Xie等[53]使用溶劑誘導(dǎo)平面基底上的碳納米管薄膜先溶脹后收縮，形成三維的褶皺結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理后形成的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)會促進(jìn)細(xì)胞和納米材料之間的相互作用從而影響細(xì)胞功能。起皺的碳納米管膜利于微生物的附著、生長和電子轉(zhuǎn)移，這種表面結(jié)構(gòu)構(gòu)建的陽極，使微生物燃料電池的輸出電流提高了2.6倍。三維的孔道結(jié)構(gòu)無論是在化學(xué)催化領(lǐng)域還是生物催化領(lǐng)域，都是目前納米材料結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的熱點(diǎn)方向，主要是因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)不僅允許微生物的內(nèi)部定殖，還有利于底物和介質(zhì)的暢通運(yùn)輸，保證了生物膜中細(xì)胞的高生存能力和高效的EET[54]。另外，層級有序的三維連通孔道可提供多方向、高通量離子運(yùn)輸通道，有助于提升表/界面反應(yīng)動力學(xué)。Holder 等[55]采用分凝成冰誘導(dǎo)的自組裝技術(shù)制備了3D 殼聚糖/真空剝離石墨烯復(fù)合材料并將其用于生物電化學(xué)系統(tǒng)。證明了大孔和中微孔的協(xié)同作用，其中相互交聯(lián)的大孔可以提供細(xì)菌進(jìn)入材料內(nèi)部和緩沖離子進(jìn)而縮短擴(kuò)散距離，薄壁上的中孔以及由于石墨烯堆垛而形成的微孔提高了接受電子的面積。一些特殊巧妙的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)也被開發(fā)用于增強(qiáng)EET，如Wang 等[50]使用電化學(xué)聚合法制備出了帶有吸盤結(jié)構(gòu)聚吡咯納米線陣列，當(dāng)其用于微生物燃料電池的陽極時(shí)，陣列上附著的細(xì)菌在新陳代謝過程會消耗陣列內(nèi)管的氧氣導(dǎo)致形成真空態(tài)，從而促使電極與細(xì)菌的強(qiáng)烈吸力，加快它們的相互作用，進(jìn)而驅(qū)使微生物基于細(xì)胞色素c的直接電子傳遞。這種結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的微生物燃料電池功率密度高達(dá)728 mW/m2，未來有望通過優(yōu)化陣列的尺寸進(jìn)一步提高電池性能。

表1 納米材料介導(dǎo)微生物EETTable 1 Nanomaterials mediated microbial extracellular electron transfer

納米材料的表面性質(zhì)（親水性或者疏水性）也會對細(xì)胞行為產(chǎn)生影響。Ding等[56]研究發(fā)現(xiàn)納米材料表面的濕潤性極大地影響了Shewanella loihicaPV-4的EET能力，該菌在親水性的電子表面的EET能力比在疏水性表面高5 倍。研究表明，納米材料表面的濕潤性會影響胞外膜細(xì)胞色素的氧化還原態(tài)，胞外膜細(xì)胞色素為還原態(tài)時(shí)更利于外膜細(xì)胞色素與黃素結(jié)合，使胞內(nèi)傳遞出來的電子能以黃素-細(xì)胞色素輔因子的形式進(jìn)行傳遞，結(jié)合作用下EET效率比黃素單獨(dú)作用快103～105倍。

2.4 納米材料的生物相容性

使用納米材料與細(xì)菌結(jié)合，容易對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，限制了微生物的催化效率。納米材料對細(xì)胞的毒害有直接物理破壞，或者產(chǎn)生活性氧自由基間接破壞[57]。有研究報(bào)道石墨烯是一種具有良好生物相容性的碳基材料，但也有研究發(fā)現(xiàn)石墨烯具有一定的生物毒性，其尺狀的邊緣容易損害細(xì)胞膜，從而影響細(xì)胞的活性[58]。Li 等[43]將石墨烯與聚乙烯醇混合，通過真空抽濾制成薄膜用于鉻還原，不僅增加生物相容性，而且制膜可循環(huán)利用，利于經(jīng)濟(jì)效益。納米材料的生物相容性并不絕對，與其形狀大小、表面電荷、官能團(tuán)及添加量密切相關(guān)[59]。另外，研究也發(fā)現(xiàn)同一納米材料作用于不同種微生物時(shí)會呈現(xiàn)出完全迥異的生物毒性。

除了降低納米材料的生物毒性外，還可以開發(fā)具有保護(hù)細(xì)胞活性的納米材料與結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。Ji 等[60]設(shè)計(jì)合成的MOF（metal-organic framework），能與Morella thermoacetica表面的壁磷酸結(jié)合形成薄膜包覆結(jié)構(gòu)，細(xì)胞表面的MOF 可以催化降解氧應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧自由基，降低了這種厭氧微生物在有氧條件下的5 倍死亡率。半導(dǎo)體材料如CdS[61]、ZnS[62]、InP[63]等也被廣泛用于微生物系統(tǒng)，它不僅可以利用半導(dǎo)體材料優(yōu)異的光吸收性能，而且通過微生物和半導(dǎo)體的緊密接觸可以降低電子轉(zhuǎn)移的電阻，實(shí)現(xiàn)將太陽能高效轉(zhuǎn)化為電能/化學(xué)能。光激發(fā)下CdS空穴產(chǎn)生的活性氧物種（·OH、O2-·和H2O2）對細(xì)菌會產(chǎn)生一定的毒性并影響其生物活性，進(jìn)而限制微生物的催化活性。針對這一問題，Chen 等[64]通過簡單快速的方法在CdS 表面修飾Mn3O4納米酶，Mn3O4對CdS產(chǎn)生的活性氧物種有及時(shí)分解和物理分離的作用，原位修飾Mn3O4后·OH、O2-·和H2O2的濃度分別減少了90%、77.6%和26%，氮還原提高了28%，N2O 的生成量減少了78%。解決納米材料與微生物作用的生物相容性問題，進(jìn)而有效地增強(qiáng)微生物的催化活性。

2.5 納米材料-微生物界面構(gòu)筑

除了考慮納米材料本身的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)外，納米材料與微生物相互作用的界面也決定二者間的能量和電荷傳遞[65]?？偨Y(jié)以往的納米材料與電活性微生物界面構(gòu)筑的研究進(jìn)展來看，從最早期研究者使用納米材料對電子受體（如最常用的電極）進(jìn)行修飾，電活性菌自然生長在納米材料表面；到后面發(fā)展了一種新策略，納米材料與微生物混合形成雜化的生物膜；為了更充分利用細(xì)菌胞外膜上的每一個(gè)活性位點(diǎn)，使用納米材料原位修飾在細(xì)胞表面；緊接著，為了使納米材料與微生物作用更緊密一步，將微小的納米材料插入到細(xì)胞膜或周質(zhì)空間，與細(xì)胞膜上的電子鏈的蛋白進(jìn)一步作用；最后到近期，將超小的納米材料引入到細(xì)胞內(nèi)部，拓展了界面構(gòu)筑的新思路。納米材料介導(dǎo)微生物胞外電子傳遞的過程，通常同時(shí)受多種因素影響，對于納米材料的選取、構(gòu)筑方式，一般都以研究目的或?qū)嶋H應(yīng)用進(jìn)行兼容考慮。因此，接下來選取納米材料-微生物界面構(gòu)筑這個(gè)角度，闡述界面構(gòu)筑對EET 的增強(qiáng)機(jī)理以及優(yōu)缺點(diǎn)，為具有類似功能的納米材料提供構(gòu)筑思路。

3 納米材料-電活性微生物界面構(gòu)筑及胞外電子傳遞的研究進(jìn)展

3.1 電子受體表面修飾的電子傳遞

圖2 氧化石墨烯介導(dǎo)S.xiamenensis還原Cr(Ⅵ)的胞外電子傳遞路徑圖(a)[66]；IO-ITO|G.sulfurreducens電極組裝成三電極體系,G.sulfurreducens置于硅片上的原子力顯微鏡圖像,G.sulfurreducens在IO-ITO骨架上形成生物雜化電極的示意圖(b)[69]Fig.2 The pathway diagram of graphene oxide films mediates extracellular electron transfer of S.xiamenensis to reduce Cr(Ⅵ)(a)[66];An IO-ITO|G.sulfurreducens electrode is assembled into a three-electrode system;Atomic force microscopy(AFM)image of G.sulfurreducens on a silicon wafer;Schematic representation of a biohybrid electrode where G.sulfurreducens colonized on the IO-ITO scaffold(b)[69]

自然條件下電活性微生物在固體胞外受體表面形成的生物膜薄且導(dǎo)電性差，為此很多研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一系列的功能納米材料以改善細(xì)菌和胞外受體的相互作用。Li 等[66]使用GO/PVA 復(fù)合膜作為外源電子中介體，介導(dǎo)ShewanellaEET用于Cr(Ⅵ)還原體系，使還原效率提高了3.13 倍[圖2(a)]。研究發(fā)現(xiàn)，在還原過程中，GO/PVA 膜不僅作為氧化還原中介體傳遞電子，GO/PVA 膜的添加還會影響細(xì)胞的生理變化，提高電子傳遞鏈上的細(xì)胞色素c相關(guān)基因表達(dá)量。分別提高這些相關(guān)基因（mtrA、mtrB、mtrC、mtrD、mtrF和omcA）的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)水平的提升能顯著促進(jìn)Cr(Ⅵ)的還原速率。Zhao等[67]通過在負(fù)載石墨烯的陽極表面修飾一層離子液體，帶負(fù)電荷的陽極表面變?yōu)閹д姾?。由于靜電作用，經(jīng)離子液體修飾的電極可以緊密地吸引帶負(fù)電的希瓦氏菌，增強(qiáng)且加速了細(xì)菌的附著，其輸出的生物電流提高了7倍。雖然電子受體表面修飾對微生物的遠(yuǎn)距離傳輸作用甚微，但可以有效縮短電極表面生物膜的形成時(shí)間，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的研究價(jià)值。Du 等[68]使用聚多巴胺對電極表面進(jìn)行修飾，聚多巴胺改善了電極表面的親水性，縮短電池的啟動時(shí)間，經(jīng)聚多巴胺修飾后形成的生物膜具有長期穩(wěn)定性和耐久性，并且制備簡單可以很好地放大規(guī)模。近年來，考慮到電子受體修飾是通過胞外膜細(xì)胞色素c和納米導(dǎo)線的直接電子傳遞來直觀有效地增強(qiáng)EET 性能，諸多研究團(tuán)隊(duì)致力于開發(fā)制備3D 大孔結(jié)構(gòu)，增加電極表面電活性細(xì)菌的載量。如Fang 等[69]設(shè)計(jì)了一種反蛋白石三維結(jié)構(gòu)的錫化銦電極[圖2(b)]，這種電極結(jié)構(gòu)有著相互連接且均勻的大孔隙（8～10 μm），細(xì)菌很容易進(jìn)入到電極內(nèi)部并富集生長，這樣的孔結(jié)構(gòu)利于電極結(jié)構(gòu)內(nèi)部與外界的物質(zhì)傳遞，極大地增強(qiáng)細(xì)菌通過胞外膜細(xì)胞色素c的直接電子傳遞，產(chǎn)生的電流可達(dá)3 mA/cm2。此外，Zou 等[70]通過高溫碳化細(xì)菌纖維素制備了3D復(fù)合多孔碳納米纖維氣凝膠，通過調(diào)節(jié)碳化溫度巧妙地調(diào)控其納米孔結(jié)構(gòu)（<10 nm）。研究表明，隨著碳化溫度的升高而使得碳纖維氣凝膠中微孔逐漸轉(zhuǎn)換為介孔，通過電子穿梭體傳遞電子的能力增強(qiáng)，介孔不但增加了3D多孔碳纖維電極中電子穿梭體可利用的表面積，并且由于其孔內(nèi)凹凸不平的表面和適當(dāng)?shù)呐でY(jié)構(gòu)克服了黃素分子（RF、FMN）的空間位阻，從而實(shí)現(xiàn)高效的兩電子傳遞。因此，目前修飾電子受體的策略已經(jīng)非常多樣化，是比較容易操作和實(shí)現(xiàn)的，且在放大系統(tǒng)中也較穩(wěn)定。

3.2 生物膜雜化的電子傳遞

微生物在自然條件下形成的生物膜，電子受體表面的負(fù)載量有限，且不利于生物膜內(nèi)的細(xì)菌遠(yuǎn)距離傳輸。為了解決這一問題，用導(dǎo)電材料與微生物混合，形成電活性雜化生物膜可以加強(qiáng)電活性微生物遠(yuǎn)距離電子傳輸效率。Yong 等[71]通過將氧化石墨烯（GO）添加到MFC 陽極中[圖3(A)]，有效提高S.oneidensisMR-1的EET 效率。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌會將與其緊密接觸的GO 還原為還原型石墨烯（rGO），rGO自組裝成三維大孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，大量的細(xì)菌黏附在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，形成細(xì)菌-rGO 導(dǎo)電網(wǎng)絡(luò)的雜化生物膜，最終提高了細(xì)胞與電極間的雙向電子傳遞，其中氧化電流（電子從細(xì)菌轉(zhuǎn)移到陽極）增強(qiáng)了25倍，還原電流（電子從陰極轉(zhuǎn)移到細(xì)菌）提高了74 倍。另一項(xiàng)研究報(bào)道ShewanellaPV-4 利用溶液中的游離態(tài)離子通過生物礦化作用形成FeS 納米顆粒，混合在微生物之間的FeS納米能介導(dǎo)遠(yuǎn)距離細(xì)胞外電子轉(zhuǎn)移和連接空間離散的氧化還原環(huán)境[46]。這不僅導(dǎo)致了生物礦化以形成納米顆粒的發(fā)展，而且合成的生物納米顆粒進(jìn)而提高了微生物的EET 效率。此外，Ma 等[72]研究發(fā)現(xiàn)納米材料還可以促進(jìn)微生物種間的直接電子傳遞，促使電活性微生物直接通過微生物之間的物理性接觸和納米導(dǎo)線的生成，通過添加TiO2不僅提高了反應(yīng)體系的導(dǎo)電性，還明顯改變了反應(yīng)體系中的微生物群落結(jié)構(gòu)，介導(dǎo)并促進(jìn)互營菌與產(chǎn)甲烷菌間種間直接電子傳遞，從而加速了厭氧產(chǎn)甲烷過程[圖3(B)]?？梢钥闯?，生物膜雜化結(jié)構(gòu)能有效改善微生物的遠(yuǎn)距離傳輸，并且在實(shí)際體系中具有重要的研究價(jià)值。

圖3 (A)三維多孔的還原氧化石墨烯/細(xì)菌雜交生物膜的自組裝過程（a）及提出的雙向EET機(jī)制（b）[71]；(B)二氧化鈦介導(dǎo)微生物共生產(chǎn)甲烷的原理圖[72]Fig.3 (A)Self-assembly of the 3D microporous rGO/bacteria hybrid biofilm by a fishing process(a),and the proposed mechanism of bidirectional EET(b)[71];(B)Schematic diagram of TiO2-mediated methane production by microbial syntrophism[72]

3.3 細(xì)胞表面修飾的電子傳遞

用納米材料制備電活性雜化生物膜雖然可提高微生物的EET 速率，但是由于納米材料不能與生物膜中的所有微生物完全接觸并且與微生物的活性位點(diǎn)存在一定的空間位阻，導(dǎo)致EET 效率降低。因此，用導(dǎo)電材料對單個(gè)細(xì)菌進(jìn)行修飾是一種解決方案。如Liu等[39]采用原位聚合的方法，將聚多巴胺（PDA）這種具有醌/半醌結(jié)構(gòu)的氧化還原介質(zhì)[73]修飾在細(xì)菌表面，在不影響細(xì)胞生存能力的情況下明顯提高了希瓦氏菌的電活性，顯著改善了微生物與電極之間的相互作用[圖4(a)]。其中，在以乳酸為電子供體時(shí)，修飾有PDA 的希瓦氏菌的EET 能力得到了明顯提高，其催化的MFCs 的最大輸出功率密度提高了5倍。研究表明，細(xì)胞外膜上的c型細(xì)胞色素能夠通過細(xì)胞表面形成的氧化還原中介體PDA 涂層進(jìn)行電子傳遞，即使細(xì)菌遠(yuǎn)離電極，也可以通過PDA 將產(chǎn)生的電子有效地傳遞到電極，從而增強(qiáng)了細(xì)胞色素c介導(dǎo)的EET。更重要的是，細(xì)菌表面PDA 涂層還可以吸附細(xì)菌自分泌的電子穿梭體——黃素增強(qiáng)間接電子傳遞，從而在細(xì)胞表面形成了多重傳遞電子路徑。Chen 等[51]報(bào)道了一種簡單、高效的提高地桿菌Geobacter sulfurreducens生物發(fā)電能力的方法[圖4(b)]。通過生物礦化作用原位在細(xì)菌表面形成Au納米粒子，使得該菌的胞外電子轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。在生物電化學(xué)系統(tǒng)中，表面負(fù)載Au的細(xì)胞與未負(fù)載相比，最大電流密度提升了40%，有機(jī)質(zhì)（乙酸）的去除增強(qiáng)了2.2 倍。這些研究表明，用納米材料對單個(gè)微生物細(xì)胞進(jìn)行修飾也能顯著加強(qiáng)微生物EET 能力，提高細(xì)胞與電極間電子傳遞效率。但由于細(xì)胞的分化生長可能會影響系統(tǒng)的穩(wěn)定，因此比較適用于小型化如生物傳感等應(yīng)用。

圖4 在活細(xì)胞表面修飾聚多巴胺以增強(qiáng)細(xì)胞外電子傳遞的機(jī)制示意圖(a)[39]；原位制備的金納米顆粒增強(qiáng)BES電流的機(jī)理圖(b)[51]Fig.4 Proposed mechanism of coating polydopamine(PDA)on individual live cells to enhance extracellular electron transfer(a)[39];Proposed mechanism of a current enhanced of BES with in situ Au-NP fabrication(b)[51]

3.4 跨細(xì)胞膜的電子傳遞

有報(bào)道稱，適當(dāng)尺度的金屬和低聚物納米材料可以結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞膜，突破EET 的第一道屏障進(jìn)而加速細(xì)胞跨膜的電子傳遞過程。Wu 等[74]通過以脫硫弧菌Desulfovibrio desulfuricans為模型生物來研究膜結(jié)合生物合成的Pd 納米顆粒對該菌EET過程的影響[圖5(a)]。研究表明了Pd 納米顆粒可出現(xiàn)于細(xì)胞周質(zhì)空間并代替細(xì)胞色素蛋白傳遞電子，其可沿著天然酶介導(dǎo)的EET 途徑來加快電子轉(zhuǎn)移。生物合成的納米材料優(yōu)勢在于它們可以對氧化還原蛋白具有較高的識別能力，并能充分地插入膜中，這是設(shè)計(jì)合成的納米材料無法輕易實(shí)現(xiàn)的。共軛聚合物不僅具有高導(dǎo)電性，并且該分子的π-共軛芳族骨架可以使電荷離域化，而側(cè)鏈的離子基團(tuán)則賦予了其良好的水溶性，這種兩親分子可以與細(xì)胞膜發(fā)生物理相互作用或直接穿過細(xì)胞膜插入細(xì)胞中，從而可以使細(xì)胞進(jìn)行直接EET[75]。Kirchhofer等[76]通過用二茂鐵基的共軛聚合物分子——DSFO+與希瓦氏菌作用，該方法極大地改善了細(xì)菌和電極之間的EET，DSFO+首先通過靜電力與希瓦氏菌相互作用，然后通過疏水作用插入細(xì)菌細(xì)胞壁，從而與細(xì)胞色素c緊密接觸，調(diào)節(jié)希瓦氏菌跨膜的電子傳遞過程[圖5(b)]。因此，DSFO+可以直接催化跨膜的呼吸電流，這種策略為加強(qiáng)納米材料和微生物的相互作用更推進(jìn)一步。然而，目前仍然無法明確低聚物促進(jìn)微生物EET 過程的具體機(jī)制，包括促進(jìn)細(xì)胞膜通透性、細(xì)菌附著和加快電子傳遞速率等方面都需要在未來進(jìn)行研究。

圖5 細(xì)胞和電極之間胞外電子傳遞鏈的假設(shè)途徑(a)[74]；膜插層共軛氧化還原分子（DSFO+）催化跨膜電子轉(zhuǎn)移(b)[76]Fig.5 Hypothesized pathways for the extracellular electron-transfer chain between the cell and the electrode(a)[74];Membraneintercalating conjugated redox molecule(DSFO+)catalyzes transmembrane electron transfer(b)[76]

3.5 細(xì)胞內(nèi)化的電子傳遞

納米材料的細(xì)胞內(nèi)在化可引起廣泛的生物反應(yīng)，也可激活細(xì)胞內(nèi)信號通路[77]。由于驅(qū)動EET 通路的生物催化電子池位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，納米材料穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)可能會產(chǎn)生額外的相互作用，影響電子傳遞、細(xì)菌生理和細(xì)胞功能。近期，Liu 等[78]通過一步水熱法合成直徑約為7 nm 的碳量子點(diǎn)（CDs），僅通過簡單添加的方式，合成的碳量子點(diǎn)可以被希瓦氏菌內(nèi)化進(jìn)胞內(nèi)，且具有優(yōu)良的生物相容性（圖6）。在黑暗條件下，內(nèi)化的碳量子點(diǎn)不僅增強(qiáng)了細(xì)菌的電導(dǎo)性，而且還刺激了細(xì)菌的生理反應(yīng)使其分泌大量的黃素。另外，在模擬的太陽光照射下，胞內(nèi)的碳量子點(diǎn)受光激發(fā)產(chǎn)生的電子進(jìn)入到胞內(nèi)代謝中，驅(qū)動了希瓦氏菌的厭氧呼吸進(jìn)而增強(qiáng)了EET。該研究工作不僅為改善EET性能提供了一種簡便且有效的策略，更為重要的是為探究碳基半導(dǎo)體與微生物的相互作用奠定了基本認(rèn)識。但關(guān)于其生理應(yīng)激的反應(yīng)機(jī)理和電子轉(zhuǎn)移途徑的闡明目前仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。另外，除了單獨(dú)的生物電催化，引入其他驅(qū)動力如太陽能來主動驅(qū)動細(xì)胞內(nèi)的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多維能量轉(zhuǎn)換也是一種有效策略。

4 展 望

EET是近年來土壤、生物、能源和環(huán)保等研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，EET 效率的提高是其能否從實(shí)驗(yàn)室走向?qū)嶋H應(yīng)用的核心。納米材料與電活性微生物的結(jié)合能夠有效增強(qiáng)EET 效率。微生物的自身特性、納米材料的性質(zhì)以及微生物細(xì)胞與納米材料的結(jié)合形式都會對納米材料與微生物的界面相互作用起決定性作用。因此，后續(xù)的研究當(dāng)致力于以下幾個(gè)方面：（1）從電活性微生物本身出發(fā)，在引入納米材料強(qiáng)化的同時(shí)，借助分子生物學(xué)、生物化學(xué)、電化學(xué)、物理學(xué)等方法進(jìn)行機(jī)理解析，不僅能夠明確與電活性細(xì)菌EET 相關(guān)的組分及傳遞途徑，還可以為使用基因工程手段進(jìn)一步強(qiáng)化作指導(dǎo)。（2）從納米材料制備角度來看，用于增強(qiáng)EET 過程的納米材料需要特定的設(shè)計(jì)來匹配不同的EET 途徑，并解決納米材料自身獨(dú)特的理化性質(zhì)與微生物催化更好的結(jié)合與兼容性問題，在材料的生物相容性和微生物的化學(xué)相容性之間探索出平衡點(diǎn)。另外，新材料的合成也迫切需要開發(fā)，如具有特殊結(jié)構(gòu)的材料、仿生材料和天然材料等。（3）納米材料與細(xì)胞膜結(jié)合或進(jìn)入到胞內(nèi)的策略，目前僅包括低聚物和部分金屬/半導(dǎo)體的改性，這表明在材料設(shè)計(jì)挖掘方面還有很大的發(fā)展空間。另外，納米材料與細(xì)胞相互作用的機(jī)制也亟待研究。（4）根據(jù)微生物的特性和最終的應(yīng)用需求選擇合適的材料體系，包括納米材料-電活性微生物界面構(gòu)筑的策略，可以從這些策略的適用性和局限性進(jìn)行拓展以及改善。（5）目前的方法主要通過電化學(xué)技術(shù)觀察納米材料-電活性微生物整體電流或輸出功率來評估復(fù)合材料的性能。但是，傳統(tǒng)電化學(xué)技術(shù)不能揭示EET 的亞種群差異，不能將觀察到的電化學(xué)電流與單個(gè)修飾材料的細(xì)胞聯(lián)系起來，忽略了生物電化學(xué)系統(tǒng)活動的潛在復(fù)雜空間模式，無法明確區(qū)分在整體電化學(xué)性能變化背后的機(jī)理。后續(xù)在控制并成像單細(xì)胞水平的納米材料-電活性微生物/電極相互作用的工作也會推動對EET的進(jìn)一步理解。