佟廣香，楊笑星,2，董樂,2，張永泉，尹家勝，匡友誼

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

哲羅鮭Hucho taimen（Pallas）和細(xì)鱗鮭Brachymystax lenok（Pallas）肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，富含不飽和脂肪酸，是我國鮭形目Salmoniformes 鮭科Salmonidae 哲羅鮭屬Hucho 和細(xì)鱗鮭屬Brachymystax 珍稀、名貴的冷水性魚類[1-3]。近年來二者資源量不斷下降，為了保護(hù)和開發(fā)利用這兩種名貴魚類，研究人員相繼攻克人工繁殖和苗種培育技術(shù)，成功進(jìn)行了苗種規(guī)?；嘤约吧唐肤~養(yǎng)殖，豐富了我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的品種[4-7]。為了恢復(fù)野生資源，在部分哲羅鮭和細(xì)鱗鮭的原棲息地進(jìn)行了增殖放流[8]。哲羅鮭和細(xì)鱗鮭是近緣物種，分布區(qū)域相近，生活環(huán)境相似[9,10]，成魚根據(jù)外形易于區(qū)分，但幼魚形態(tài)學(xué)特征不明顯，無法依據(jù)形態(tài)學(xué)特征對(duì)二者鑒別。另外哲羅鮭和細(xì)鱗鮭均是人們喜愛的優(yōu)質(zhì)魚類，為名貴的水產(chǎn)品[11]，但進(jìn)一步加工后，失去了原有的外部形態(tài)特征，使得它們之間更加難于鑒別，因此亟需一種快捷方便、準(zhǔn)確可靠的方法鑒別二者。

核糖體ITS1（internal transcribed spacer 1）位于編碼基因18S 與5.8S 之間，雖然18S 與5.8S 均十分保守，但its1 基因卻在屬、種及種下水平進(jìn)化速率快、多態(tài)性高且信息量豐富，同時(shí)還具有長度適中、引物設(shè)計(jì)簡單和易于擴(kuò)增等特點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于屬、種水平，甚至科水平的系統(tǒng)演化分析[12-16]。武寶生等[17]用its1 分析了鱸形目的5 科11種魚類，包括尖吻鱸科、軍曹魚科、射水魚科、劍魚科及科，以鮣為外類群，發(fā)現(xiàn)its1 能夠很好地區(qū)分該類群物種；Huyse 等[18]用its1 將虎魚2 個(gè)屬（Pomatoschistus 和Gobiusculus）的不同魚類區(qū)分開，其結(jié)果與線粒體的12S 和16S 的分類結(jié)果一致。龔理等[19]用its1 研究鰨科4 屬5 種魚類時(shí)發(fā)現(xiàn)，its1 不但能夠?qū)⑦@些魚類在物種和屬級(jí)水平區(qū)分開，同時(shí)還能反映各魚類之間的親緣關(guān)系。本研究用its1 序列分析哲羅鮭和細(xì)鱗鮭，旨在建立一種簡單易行的DNA 分子標(biāo)記方法鑒定種質(zhì)，以期為哲羅鮭和細(xì)鱗鮭幼魚鑒定、加工品鑒定、種質(zhì)資源管理和保護(hù)提供有效的工具。

1 材料和方法

1.1 樣本采集及DNA 提取

本研究收集黑龍江虎頭、遜克、撫遠(yuǎn)等地的野生哲羅鮭和細(xì)鱗鮭成魚各60 尾，根據(jù)形態(tài)鑒定種類后采集鰭條，陰干保存。用100 μL 裂解液在PCR 板內(nèi)裂解消化樣本。裂解液成分為0.5 mg/mL 蛋白酶K、10 mmol/LTris（pH 8.0）、50 mmol/LKCl、0.3%Tween20、0.3%NP40；裂解程序?yàn)?5℃4 h，98℃10 min[20]。樣本裂解后用Vortex 混勻儀混勻，1 000～2 000 r/min離心1～2 min，取上清液備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI 上查找哲羅鮭its1 序列（序列登錄號(hào)：AY125130），用primer3 在線設(shè)計(jì)特異性引物2 對(duì)，同時(shí)對(duì)比哲羅鮭和細(xì)鱗鮭線粒體12S rRNA 序列，找出二者完全相同序列，設(shè)計(jì)12S rRNA 參照引物1對(duì)。為了能夠用瓊脂糖凝膠有效的檢測(cè)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，選擇12S rRNA 參照引物擴(kuò)增片段大小與特異性引物片段相差50 bp 以上。引物序列見表1。引物由金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為20 μL，各成分為：2×Dream Taq PCR mater mix（Thermo Fisher,USA）10 μL、DNA粗提液2 μL、10 μmol/L上下游引物各0.1～1 μL（表1），超純水補(bǔ)足20 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5℃3 min，32 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)設(shè)置為95℃30 s，64.5℃30 s，72℃30 s，之后72℃5 min。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，120 V 電泳30 min，掃描成像。

表1 PCR 引物列表Tab.1 PCR primers list

1.4 參照引物濃度優(yōu)化

為了避免DNA 降解、操作失誤和PCR 擴(kuò)增失敗等原因造成的條帶缺失，影響判定結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)引入線粒體12S rRNA 作為參照進(jìn)行雙重PCR 擴(kuò)增，以消除上述因素的影響。由于不同引物擴(kuò)增效率存不同，因此對(duì)濃度為10 μmol/L特異性引物和12S rRNA 參照引物的比例進(jìn)行了優(yōu)化，設(shè)置4 個(gè)梯度，1-its1 特異性上下游引物固定為1 μL，12S rRNA 參照上下游引物分別為1 μL、0.5 μL、0.25 μL和0.1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 its 1 標(biāo)記篩選

分別用4 尾哲羅鮭和細(xì)鱗鮭初步篩選its1 和12S rRNA 引物，篩選結(jié)果見圖1。由圖1 可知：1-its1 引物在哲羅鮭中能夠擴(kuò)增出334 bp 條帶，細(xì)鱗鮭中未能擴(kuò)增出條帶；2-its1 在哲羅鮭和細(xì)鱗鮭中均能夠擴(kuò)增出119 bp 條帶；12S rRNA 引物在哲羅鮭和細(xì)鱗鮭中均能夠擴(kuò)增出251 bp 條帶。當(dāng)12S rRNA 參照引物和特異性引物1-its1 均不能擴(kuò)增出條帶時(shí)，說明PCR 擴(kuò)增存在問題，如操作失誤，DNA降解等；當(dāng)12S rRNA 參照引物在樣本中能夠擴(kuò)增出條帶，而1-its1 引物不能擴(kuò)增出條帶時(shí)，說明條帶缺失是樣本基因組DNA 差異所致。本研究中細(xì)鱗鮭12S rRNA 參照引物能夠擴(kuò)增出條帶，而1-its1引物卻不能擴(kuò)增出條帶，說明細(xì)鱗鮭的基因組DNA不能與1-its1 引物有效匹配，造成了條帶的缺失，表明1-its1 可能為哲羅鮭特異性序列，可用于鑒別哲羅鮭和細(xì)鱗鮭種質(zhì)，但需要進(jìn)一步群體驗(yàn)證。

2.2 12S rRNA 引物濃度優(yōu)化

不同引物的擴(kuò)增效率存在差異，因此在雙重PCR 擴(kuò)增時(shí)有必要優(yōu)化引物濃度。由圖1 可知：同一個(gè)體相同條件下12S rRNA 擴(kuò)增條帶明顯比1-its1 擴(kuò)增條帶亮，說明12S rRNA 的擴(kuò)增效率高于1-its1。本研究中，20 μL 擴(kuò)增體系內(nèi)10 μmol/L 的1-its1 特異性上下游引物固定為1 μL。12S rRNA 參照上下游引物體積分別設(shè)置為1 μL、0.5 μL、0.25 μL 和0.1 μL，擴(kuò)增圖譜見圖2。由圖2 可知，當(dāng)1-its1 引物和12S rRNA 參照引物體積均為1 μL時(shí)，特異性引物未能擴(kuò)增出條帶，僅12S rRNA 參照引物能夠擴(kuò)增出251 bp 條帶（圖2-A）。隨著12S rRNA 引物濃度的減小，12S rRNA 引物的條帶逐漸減弱，哲羅鮭1-its1 特異性引物條帶變亮，細(xì)鱗鮭無1-its1 特異引物擴(kuò)增條帶。在20 μL 擴(kuò)增體系內(nèi)，特異性引物1-its1 和12S rRNA 參照引物分別為1 μL、0.25 μL 時(shí)（圖2-C），二者達(dá)到一種平衡，哲羅鮭能擴(kuò)增出清晰的334 bp 的1-its1 特異性條帶和251 bp 的12S rRNA 參照引物條帶；細(xì)鱗鮭樣本僅有251 bp 的12S rRNA 參照引物條帶。

圖1 3 對(duì)引物PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the 3 pairs of primers

圖2 引物1-its1 和12S rRNA 組合擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of 2-plex amplification with 1-its1 and 12S rRNA primers

2.3 種質(zhì)鑒定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證1-its1 引物的有效性，用優(yōu)化的1-its1 和12S rRNA 引物組合擴(kuò)增野生哲羅鮭和細(xì)鱗鮭成魚各60 尾，擴(kuò)增圖譜見圖3。由圖3 可知，哲羅鮭均能擴(kuò)增出334 bp 的1-its1 特異性條帶和251 bp 的12S rRNA 參照條帶；細(xì)鱗鮭僅有251 bp的12S rRNA 參照條帶，可見1-its1 引物能夠有效鑒定哲羅鮭和細(xì)鱗鮭種質(zhì)，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。

圖3 哲羅鮭和細(xì)鱗鮭樣品1-its1 和12S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of 1-its1 and 12S rRNA in taimen and lenok population

3 討論

本研究開發(fā)了一對(duì)能區(qū)分哲羅鮭和細(xì)鱗鮭種質(zhì)的DNA 分子標(biāo)記。DNA 分子標(biāo)記是通過分析生物體之間具有遺傳差異的DNA 片段，揭示生物內(nèi)在基因的分布規(guī)律及其各種表型性狀所表現(xiàn)的規(guī)律。DNA 分子標(biāo)記具有鑒定速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不受生物體生長發(fā)育階段、試驗(yàn)條件及供試部位等因素的影響，已廣泛應(yīng)用于生物體的基因組研究、起源進(jìn)化、遺傳育種和種質(zhì)鑒定等多個(gè)領(lǐng)域[21]。已有用DNA 分子標(biāo)記鑒定近源物種的報(bào)道。鞏高端等[22]用DNA 分子標(biāo)記鑒定了黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco、瓦氏黃顙魚Pelteobagrus vachelli 及其雜交種，發(fā)現(xiàn)瓦氏黃顙魚的inad-like 基因比黃顙魚缺失1 178 bp；周露等[23]建立了雙重實(shí)時(shí)熒光PCR 法鑒別同屬于鮭科魚類的大西洋鮭Salmo salar 和虹鱒Oncorhynchus mykiss，根據(jù)擴(kuò)增曲線對(duì)二者進(jìn)行鑒定；衣潔菡等[24]用SNP 標(biāo)記鑒定阿根廷滑柔魚Illex argentinus 和科氏滑柔魚Illex coindetii，建立了多重PCR 反應(yīng)體系，其中阿根廷滑柔魚擴(kuò)增條帶為516 bp，科氏滑柔魚擴(kuò)增條帶為419 bp。目前區(qū)分哲羅鮭和細(xì)鱗鮭的DNA 分子標(biāo)記還沒有報(bào)道，本研究是國內(nèi)外首次基于分子生物學(xué)技術(shù)原理建立的一種哲羅鮭和細(xì)鱗鮭種質(zhì)鑒別方法。它利用its1 基因的多態(tài)性和12S rRNA 基因的保守片段，以12S rRNA 基因?yàn)閰⒄?，避免了由于DNA 降解、加樣失誤及PCR 擴(kuò)增失敗等原因造成的結(jié)果誤判。本方法僅需一次PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)1-its1 引物擴(kuò)增條帶的有無就能夠?qū)⒍邊^(qū)分開，哲羅鮭擴(kuò)增條帶為雙帶，一條是251 bp 的12S rRNA 參照條帶，另外一條是334 bp 的1-its1 特異性條帶；細(xì)鱗鮭僅為單帶，是251 bp 的12S rRNA 參照條帶，無1-its1的特異性條帶。本方法無需依賴專業(yè)的分類學(xué)背景，也不需要具有長期從事魚類鑒別的豐富經(jīng)驗(yàn)，不僅可以區(qū)分哲羅鮭和細(xì)鱗鮭完整個(gè)體，還可以鑒別其加工產(chǎn)品，具有快捷準(zhǔn)確、客觀公正、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的特點(diǎn)。本方法還可以用于魚卵、剛孵出苗種的鑒定，能夠研究群落結(jié)構(gòu)、產(chǎn)卵位置及擴(kuò)散途徑，了解早期生活史，評(píng)估哲羅鮭和細(xì)鱗鮭種質(zhì)資源，鑒別商品苗種及淡水產(chǎn)品市場(chǎng)上存在的標(biāo)識(shí)錯(cuò)誤等問題，為哲羅鮭和細(xì)鱗鮭幼魚鑒定、加工品鑒定、種質(zhì)資源收集、保存、管理和保護(hù)提供有效的工具[25]。