王 崇，王連軍，田小海，雷 劍，柴沙沙，焦春海，楊新筍

(1 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 糧食作物研究所/湖北省甘薯工程技術(shù)研究中心/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064； 2 長江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434000； 3 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 武漢 430064)

甘薯Ipomoea batatas是旋花科Convolvulaceae番薯薯Ipomoea雙子葉植物，主要起源于南美洲等熱帶、亞熱帶地區(qū)，是世界第七大糧食作物、中國第五大糧食作物[1]。甘薯富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、維生素、胡蘿卜素、花青素、氨基酸、鈣、磷、鉀等多種物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值豐富[2-3]。甘薯抗旱性強(qiáng)，耐貧瘠能力強(qiáng)，具有極強(qiáng)的適應(yīng)性，在中國具有悠久的栽培歷史[4]。甘薯是無性繁殖作物，染色體數(shù)目多，遺傳背景復(fù)雜，在遺傳上高度雜合，中國的甘薯栽培種94%以上具有‘南瑞苕’和‘勝利百號(hào)’的遺傳信息，造成中國甘薯遺傳背景狹窄，嚴(yán)重制約甘薯品種的遺傳改良[5]。甘薯近緣野生種種質(zhì)資源豐富，在世界范圍內(nèi)分布有600～700種，具有豐富的遺傳多樣性和潛在的基因資源，如高淀粉含量、抗病蟲、抗病毒、抗旱等優(yōu)良特質(zhì)，可為改良甘薯品種和拓寬甘薯基因庫提供重要的基因資源[6-7]。

伴隨現(xiàn)代生物技術(shù)不斷發(fā)展、更新，DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等[8]。Yang等[9]使用SSR標(biāo)記分析了380個(gè)甘薯品種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；蘇一鈞等[10]篩選出30對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物，對(duì)303份甘薯地方材料進(jìn)行了遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)303份甘薯材料間親緣關(guān)系較近，遺傳多樣性豐富；季志仙等[11]選用6個(gè)ISSR標(biāo)記對(duì)17份甘薯品種進(jìn)行分析，顯示同類型品種間的遺傳相似性較高，親緣關(guān)系密切。SSR和ISSR等分子標(biāo)記技術(shù)主要是基于植物基因組DNA開發(fā)，在植物親緣鑒定和遺傳背景研究中具有極好的應(yīng)用價(jià)值。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，基于線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)和葉綠體DNA(Chloroplast DNA，cpDNA)開發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)也越來越廣泛地應(yīng)用于植物遺傳分析[12-13]。

mtDNA具有細(xì)胞質(zhì)遺傳特性，一些mtDNA參與編碼具有重要生物學(xué)功能的蛋白或亞基，如核糖體和生物氧化鏈上某些重要酶的部分亞基，還與細(xì)胞生命周期、真核細(xì)胞抗藥性有關(guān)[14]。在植物細(xì)胞中，mtDNA參與調(diào)控子葉大小、葉片形狀、植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育，還影響擬南芥、玉米和黃瓜等作物的葉綠體結(jié)構(gòu)以及光合作用[15-16]。mtDNA具有進(jìn)化速度快、缺少重組以及嚴(yán)格母系遺傳等特點(diǎn)，且線粒體基因組較小、易于測序，已經(jīng)成為研究植物遺傳進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育的理想工具[17]。cpDNA具有單倍型、母系遺傳、缺乏雜合細(xì)胞質(zhì)、不發(fā)生等位基因重組等特性，非編碼區(qū)不受選擇影響，核酸位點(diǎn)表現(xiàn)出豐富的多態(tài)性和變異，與mtDNA序列廣泛用于研究植物的系統(tǒng)發(fā)育、種間或種內(nèi)的親緣關(guān)系鑒定等研究[18]。Godbout等[19]采用nad3、nad5 等mtDNA序列對(duì)北美短葉松進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育研究，結(jié)果表明mtDNA可反映北美短葉松的地理關(guān)系；Hu等[20]使用mtDNA非編碼區(qū)序列分析薯蕷屬的遺傳背景，結(jié)果表明線粒體基因重組時(shí)存在豐富的變異位點(diǎn)，可用于鑒別區(qū)分不同薯蕷品種；馬麗等[21]使用matK基因序列對(duì)59個(gè)石榴品種進(jìn)行了鑒定和分類，結(jié)果表明matK可用于石榴的系統(tǒng)發(fā)育分析。

本研究通過對(duì)3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種進(jìn)行mtDNA和cpDNAmatK序列分析，綜合分析3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，為甘薯近緣野生種的保護(hù)及利用提供參考，為甘薯遺傳育種提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為3個(gè)甘薯栽培種(‘浙紫薯3號(hào)’‘鄂薯6號(hào)’‘皖薯7號(hào)’)及8個(gè)近緣野生種(何魯牽牛I. holubii、‘黃蔦蘿’I. hederifoliavar. lutea、空心菜I. aquaticaForsk、‘月光花’I.alba、‘黃色朝顏’I. obscuraKeniak、變色牽牛I.ndica、旋轉(zhuǎn)牽牛I. digitata huge caudex、樹牽牛I.carnea)，種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所。長勢旺盛時(shí)進(jìn)行樣品采集。

1.2 DNA 提取

采取試驗(yàn)樣品新鮮、幼嫩葉片后，參考Yang等[9]的方法，使用改良CTAB法提取甘薯栽培種及近緣野生種的基因組DNA。使用分光光度計(jì)測量DNA的濃度，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量。將 DNA 質(zhì)量濃度稀釋到 70～80 ng/μL，在?20 ℃冰箱中保存，備用。

1.3 PCR 擴(kuò)增

本研究選用6對(duì)mtDNA和1對(duì)cpDNA通用引物(表1)，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。將7對(duì)引物分別在試驗(yàn)材料中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：10× PAGE Buffer(Mg2+)2.5 μL，NTPs(10 mmol/L)2.0 μL，正向引物和反向引物各.0 μL，基因組 DNA(70～80 ng/uL)1.0 μL，EasyTaq?DNA Polymerase 0.5 μL，ddH2O 補(bǔ)至總體積為5 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，56～57 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 5 min；在 4 ℃ 條件下保存 min。使用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果，以單一、清晰、明亮條帶作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，將檢測合格的擴(kuò)增產(chǎn)物送到武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序。

表 1 試驗(yàn)采用引物信息Table 1 The information of primers used in this experiment

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件DNAstar對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行手動(dòng)校對(duì)，刪除兩端冗余堿基，將正向序列和反向序列進(jìn)行拼接，使用軟件MEGA X[25]對(duì)拼接好的序列進(jìn)行比對(duì)，使用軟件 DnaSP 6.0[26]對(duì)序列進(jìn)行多態(tài)性 (π)和單倍型(Hd)等序列特征分析。使用MEGA X軟件采用鄰接距離矩陣法(Neighbor-joining distance matrix method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，使用自展法(Bootstrap)進(jìn)行可信度檢測，重復(fù)1000次。使用軟件NetWork的中介鄰接網(wǎng)絡(luò)(Median-joining network，MJ)算法構(gòu)建單倍型關(guān)聯(lián)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征分析

對(duì)6個(gè)mtDNA序列和cpDNAmatK序列的測序結(jié)果進(jìn)行多態(tài)性分析，mtDNA序列ccb256在3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種中無堿基差異，其余6個(gè)序列表現(xiàn)出多態(tài)性。對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性的序列進(jìn)行分析，將ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5、nad7/1-2和matK在11個(gè)材料中的擴(kuò)增序列進(jìn)行對(duì)位排列后，上述序列的長度分別為494、1 247、1 503、1 665、964 和 840 bp。6 個(gè)序列擴(kuò)增片段GC堿基占比分別為46.52%～47.17%、53.90%～54.69%、48.02%～48.54%、45.93%～46.50%、56.39%～57.23%和32.90%～34.09%。在5個(gè)線粒體序列中，序列nad5/4-5的核酸多態(tài)性最高(0.003 95)，含有20個(gè)變異位點(diǎn)、10個(gè)單一突變位點(diǎn)、10個(gè)簡約信息位點(diǎn)、6個(gè)插入/缺失位點(diǎn)。ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5和nad7/1-2序列的核苷酸多態(tài)性、變異位點(diǎn)數(shù)、單一突變位點(diǎn)數(shù)、簡約信息位點(diǎn)數(shù)和插入/缺失位點(diǎn)數(shù)分別為 0.003 20、0.000 17、0.003 43、0.001 86，5、1、12、4，2、1、3、0，3、0、9、4，6、11、63、24。matK序列的核苷酸多態(tài)性、變異位點(diǎn)數(shù)、單一突變位點(diǎn)數(shù)比mtDNA序列的高，簡約信息位點(diǎn)數(shù)和插入/缺失位點(diǎn)數(shù)比mtDNA序列的低。6個(gè)序列合并后，序列長度為 6 713 bp，共有變異位點(diǎn) 69 個(gè)，其中單一突變位點(diǎn)39個(gè)、簡約信息位點(diǎn)30個(gè)，插入/缺失位點(diǎn)111個(gè)(表2)。

表 2 試驗(yàn)材料的序列多態(tài)性信息Table 2 Sequence polymorphism information of experiment materials

ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5、nad7/1-2和matK序列中，單倍型數(shù)量最多的是cpDNA序列matK，9 個(gè)；ccb203、nad2/1-2、nad2/4-5、nad5/4-5和nad7/1-2的單倍型數(shù)量分別是5、2、8、8和5。6個(gè)序列的單倍型多樣性分別為0.818、0.182、0.927、0.927、0.818 和 0.945，matK 區(qū)域的單倍型多樣性最高。單倍型多樣性方差和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差最大的區(qū)域是nad2/1-2，分別為0.020 61和0.144。6個(gè)序列合并后，單倍型數(shù)量、單倍型多樣性、單倍型多樣性方差和單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差分別是 9、0.945、0.004 34 和 0.066(表 3)。

表 3 試驗(yàn)材料的單倍型多樣性Table 3 Haplotype diversity of experiment materials

對(duì) 6 個(gè)序列進(jìn)行 Tajima’sD測驗(yàn)和 Fu and Li’sD*/F*測驗(yàn)，在5個(gè)mtDNA序列中，序列nad7/1-2 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值最大，序列nad2/1-2 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值最小，且 5 個(gè)mtDNA 序列的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和Fu and Li’sF*值均差異不顯著 (P>0.10)，符合中性進(jìn)化模型。cpDNAmatK 的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值分別為?1.627 84、?2.009 96 和?2.168 40，在 0.050.10)，符合中性進(jìn)化模型(表4)。

表 4 Tajima’s D 測驗(yàn)和 Fu and Li’s D＊/F＊測驗(yàn)Table 4 Tajima’s D test and Fu and Li’s D＊/F＊ test

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對(duì)3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種進(jìn)行遺傳多樣性分析，11份試驗(yàn)材料間的遺傳距離均在0.000 00～0.005 84 之間，‘月光花’與‘黃色朝顏’2個(gè)品種間的遺傳距離最大，為0.005 84，3個(gè)栽培種間的遺傳距離為0，3個(gè)栽培種及8個(gè)近緣野生種間的平均遺傳距離為 0.003 26 (表 5)。

基于鄰接法構(gòu)建甘薯栽培種及近緣野生種的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，可將3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種分為2大類(Ⅰ和Ⅱ) (圖1)，第一大類包括7個(gè)近緣野生種，第二大類包括3個(gè)栽培種和1個(gè)近緣野生種。第一大類又可分為2類，何魯牽牛、‘黃色朝顏’、樹牽牛和旋轉(zhuǎn)牽牛被歸為一類，‘黃蔦蘿’‘月光花’和變色牽牛被歸為一類；第二大類可分為2類，第一類為空心菜，第二類為‘浙紫薯3號(hào)’‘鄂薯6號(hào)’和‘皖薯7號(hào)’(圖 1)。

圖 1 鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig. 1 The phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

2.3 單倍型中介網(wǎng)絡(luò)

使用軟件NetWork中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法對(duì)3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種的單倍型繪制網(wǎng)絡(luò)圖，11份材料表現(xiàn)出9種單倍型，圖中無明顯主體單倍型(圖2)。單倍型H_1～H_8分別對(duì)應(yīng)何魯牽牛、‘黃蔦蘿’、空心菜、‘月光花’‘黃色朝顏’、變色牽牛、旋轉(zhuǎn)牽牛和樹牽牛，單倍型H_9對(duì)應(yīng)‘紫薯3號(hào)’‘鄂薯6號(hào)’和‘皖薯7號(hào)’。單倍型之間呈線狀排列，無主體單倍型，單倍型H_1與H_5有共同節(jié)點(diǎn)，單倍型H_3與H_8有共同節(jié)點(diǎn)，單倍型H_4與H_6有共同節(jié)點(diǎn)。中介鄰接網(wǎng)絡(luò)算法分析結(jié)果與鄰接聚類分析結(jié)果一致，甘薯栽培種與野生種之間存在界限。

圖 2 單倍型中介鄰接網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 2 Median-joining network for haplotypes

3 討論與結(jié)論

甘薯近緣野生種是重要的育種資源，基于mtDNA和cpDNA序列特征對(duì)甘薯近緣野生種進(jìn)行分析，可為甘薯育種提供新的資源。序列特征分析在甘薯及近緣野生種分析中被廣泛應(yīng)用，劉崢等[27]以及俞立璇等[28]使用ITS序列對(duì)甘薯栽培種和近緣野生種進(jìn)行序列特征分析，顯示ITS序列可用于旋花科的系統(tǒng)演化關(guān)系分析，為甘薯野生種的利用提供了理論依據(jù)。matK序列是葉綠體中進(jìn)化速率較快的基因之一，存在一定程度的分化，由于葉綠體基因組較為保守，其進(jìn)化速率遠(yuǎn)低于核基因的進(jìn)化速率[29]。低進(jìn)化速率限制了matK及其他葉綠體基因在低級(jí)分類層面(如屬、亞屬)中的應(yīng)用，matK序列不能應(yīng)用于甘薯屬內(nèi)間的親緣關(guān)系研究。線粒體基因在系統(tǒng)學(xué)研究中應(yīng)用較為廣泛，如nad1基因應(yīng)用于探討稻族Oryzeae的系統(tǒng)發(fā)育[30]；nad5序列應(yīng)用于秦艽組植物的分子系統(tǒng)發(fā)育分析及物種鑒定[31]；nad7/1-2序列用于分析突尼斯柑橘砧木種質(zhì)資源的遺傳多樣性[32]。與核基因相比，線粒體基因如nad1序列在較高等級(jí)類群的系統(tǒng)發(fā)育重建中有更高的信息量，變異水平更適于在高等級(jí)層面的系統(tǒng)發(fā)育重建。相較于核基因和葉綠體基因，線粒體基因變異速率低，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，但篩選出合適的線粒體序列片段仍能為植物的系統(tǒng)學(xué)研究和親緣關(guān)系鑒定提供新的證據(jù)。在植物系統(tǒng)學(xué)研究中，采用mtDNA對(duì)甘薯近緣野生種進(jìn)行分析的報(bào)道較少，通過mtDNA和cpDNA對(duì)甘薯近緣野生種進(jìn)行分析，可為研究旋花科的系統(tǒng)演化提供新的方法和指導(dǎo)。

本研究選用6個(gè)mtDNA序列和1個(gè)cpDNA序列的引物在3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種中進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在11個(gè)材料中，mtDNA序列ccb256無多態(tài)性，表現(xiàn)出多態(tài)性的序列占比為85.7%，表明基于mtDNA和cpDNA開發(fā)的通用引物在甘薯栽培種及近緣野生種的多態(tài)性分析中具有良好的多態(tài)性。具有多態(tài)性的5個(gè)mtDNA序列中，nad2/1-2和nad7/1-2序列中的GC占比大于AT占比，ccb203、nad2/4-5和nad5/4-5序列中的GC占比小于AT占比，表明nad2/1-2和nad7/1-2序列更為穩(wěn)定。matK序列的GC占比小于AT占比，matK序列的核苷酸多樣性高于mtDNA序列的，與Yang等[33]基于核基因組和葉綠體基因組分析中國橡樹的試驗(yàn)結(jié)果基本保持一致。對(duì)mtDNA序列的變異位點(diǎn)進(jìn)行分析，產(chǎn)生的變異位點(diǎn)以單一突變位點(diǎn)和插入/缺失突變?yōu)橹?，序列nad5/4-5的單一突變位點(diǎn)最多(10個(gè))，序列nad2/4-5插入/缺失位點(diǎn)在6個(gè)序列中最多(63個(gè))。與mtDNA序列相比，cpDNA序列matK的單一突變位點(diǎn)(23個(gè))比mtDNA序列的多，而插入/缺失位點(diǎn)(1個(gè))遠(yuǎn)少于mtDNA序列的。對(duì)6個(gè)序列的單倍型多樣性進(jìn)行分析，mtDNA序列中nad2/1-2序列的單倍型數(shù)量和單倍型多樣性最小(2、0.182)。matK序列的單倍型數(shù)量(9)和單倍型多樣性(0.945)比5個(gè)mtDNA序列的高，表明相較于mtDNA序列，cpDNA序列反映的序列特征信息更為豐富。對(duì)甘薯近緣野生種進(jìn)行分析時(shí)，mtDNA和cpDNA序列結(jié)合獲得的結(jié)果更為準(zhǔn)確。

中性檢驗(yàn)(Neutrality test)是通過統(tǒng)計(jì)學(xué)的檢驗(yàn)方法分析DNA數(shù)據(jù)，進(jìn)而檢驗(yàn)自然選擇[34]。本研究采用 Tajima’sD和 Fu and Li’sD*/F*檢驗(yàn)，結(jié)果顯示基于 mtDNA 序列分析的 Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*值均差異不顯著(P>0.10)，符合中性進(jìn)化模型；matK序列的Tajima’sD值、Fu and Li’sD*值和 Fu and Li’sF*在0.050.10)，符合中性進(jìn)化模型。中性檢驗(yàn)的結(jié)果表明，甘薯近緣野生種在遺傳進(jìn)化時(shí)表現(xiàn)穩(wěn)定，符合中性進(jìn)化模型，沒有出現(xiàn)種群擴(kuò)張的情況，單倍型網(wǎng)絡(luò)無中心再度證明甘薯近緣野生種在遺傳進(jìn)化時(shí)無種群擴(kuò)張的情況。本研究3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種間的遺傳距離在 0.000 00～0.005 84之間，平均遺傳距離為0.003 26，表明3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種的遺傳距離小，彼此間親緣關(guān)系近，遺傳多樣性低，如‘浙紫薯3號(hào)’‘鄂薯6號(hào)’和‘皖薯7號(hào)’之間的遺傳距離為0，親緣關(guān)系密切。使用5個(gè)mtDNA序列和1個(gè)cpDNAmatK序列對(duì)甘薯栽培種和近緣野生種進(jìn)行分析時(shí)，栽培種之間的遺傳距離為0，栽培種與近緣野生種的遺傳距離和近緣野生種之間的遺傳距離在0.000 94～0.005 84之間，說明mtDNA序列和matK序列在同屬種間的系統(tǒng)發(fā)育和種內(nèi)材料的親緣關(guān)系分析中具有一定的參考價(jià)值。使用鄰接法構(gòu)建3個(gè)栽培種及8個(gè)近緣野生種的系統(tǒng)進(jìn)化樹，11個(gè)材料被分為2大類：7個(gè)近緣野生種歸為Ⅰ類，3個(gè)栽培種和空心菜歸為Ⅱ類。甘薯栽培種和近緣野生種聚類在不同組別中，表明mtDNA序列和cpDNA序列可用于甘薯栽培種和近緣野生種的關(guān)系鑒定?？招牟撕?個(gè)甘薯栽培種歸為一類，空心菜與3個(gè)栽培種的遺傳距離一致，四者之間的遺傳距離小于空心菜與‘月光花’‘黃色朝顏’、變色牽牛和旋轉(zhuǎn)牽牛之間的遺傳距離，大于空心菜與樹牽牛之間的遺傳距離，推測空心菜是旋花科植物進(jìn)化的重要研究對(duì)象。系統(tǒng)發(fā)育樹中，‘黃色朝顏’與3個(gè)甘薯栽培種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離較大，‘月光花’與‘黃色朝顏’的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離較大，‘黃色朝顏’與‘月光花’可用于甘薯育種的親本選配。

3個(gè)甘薯栽培種及8個(gè)近緣野生種的mtDNA和cpDNA序列分析顯示，mtDNA序列和cpDNA序列可用于甘薯栽培種及近緣野生種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，為旋花科植物的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究提供指導(dǎo)，還可為甘薯種質(zhì)資源的開發(fā)利用和篩選提供理論依據(jù)。