劉艷秋，侯改霞，習(xí)雪峰，王 勇

（1.三明學(xué)院 體育與康養(yǎng)學(xué)院，福建 三明 365004；2.河南大學(xué) 體育學(xué)院，河南 開(kāi)封 475001）

糖尿病腦?。╠iabetic encephalopathy，DE）是2型糖尿病的主要并發(fā)癥之一[1]，臨床上主要表現(xiàn)為輕、中度認(rèn)知功能障礙，大腦神經(jīng)結(jié)構(gòu)及生理功能改變，行為缺陷和獲得性認(rèn)知障礙。海馬是與大腦記憶功能相關(guān)的重要核團(tuán)，CA1區(qū)是海馬主要功能區(qū)。海馬對(duì)高血糖反應(yīng)敏感，糖尿病機(jī)體大腦海馬可表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少，突觸功能失常，胞體形態(tài)異常[2]。故研究2型糖尿病大鼠海馬結(jié)構(gòu)和生理功能的變化對(duì)揭示高血糖導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制有重要意義。糖尿病導(dǎo)致的血糖升高可使糖基化終末產(chǎn)物 （advanced glycation end product,AGEs）產(chǎn)生增加，AGEs與其受體RAGE（advanced glycation end product receptors，RAGE）結(jié)合，激活A(yù)GEs-RAGE信號(hào)通路，活化的AGEs-RAGE通路是糖尿病靶器官損害的重要原因之一[3-5]。Nardin P等[6]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠血清和腦脊液中的AGEs水平升高，海馬RAGE表達(dá)增高，與糖尿病認(rèn)知障礙關(guān)系密切。升高的AGEs可通過(guò)與其受體RAGE結(jié)合啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）等信號(hào)途徑，從而加重海馬的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[7-8]。反過(guò)來(lái)，NF-κB的上調(diào)、炎癥因子的增多、氧化應(yīng)激反應(yīng)的增加會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)RAGE的表達(dá)，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致海馬結(jié)構(gòu)和生理功能的異常，進(jìn)一步加重認(rèn)知障礙。運(yùn)動(dòng)是防治2型糖尿病的常用輔助方法之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)可通過(guò)降低糖尿病大鼠腎臟AGEs水平，改善腎臟纖維化[9]。那么，運(yùn)動(dòng)能否通過(guò)降低2型糖尿病大鼠海馬AGEs水平及減弱AGEs-RAGE信號(hào)通路改善糖尿病腦??？這方面的研究還比較少見(jiàn)。本研究擬復(fù)制2型糖尿病大鼠模型，通過(guò)12周的游泳運(yùn)動(dòng)干預(yù)，來(lái)探討運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠認(rèn)知功能及AGEs/RAGE/NOX2/氧化應(yīng)激/NF-κB信號(hào)通路的影響，為運(yùn)動(dòng)防治2型糖尿病腦病方面的作用和機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 2型糖尿病大鼠模型的建立、分組及運(yùn)動(dòng)干預(yù)

雄性SD大鼠30只，SPF級(jí)，購(gòu)于鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為對(duì)照組（C組，6只）和高脂組（24只）。

高脂組飼喂高脂飼料6周，空腹12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，30 mg/kg），72 h后檢測(cè)隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為暫時(shí)成模標(biāo)準(zhǔn)。1周后復(fù)查暫時(shí)成模大鼠，隨機(jī)血糖仍≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠建模成功，將建模成功大鼠隨機(jī)分為糖尿病組（D組，8只）和糖尿病運(yùn)動(dòng)組（DS，8 只）。

糖尿病運(yùn)動(dòng)組（DS）大鼠采用無(wú)負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)，水溫（36±1）℃，游泳干預(yù)共12周，每周5 d。游泳運(yùn)動(dòng)具體時(shí)間安排為：第1周15 min/d，第2～6周以每周15 min遞增延長(zhǎng)，直到第6周延長(zhǎng)至90 min/d；第 7～12 周，每天運(yùn)動(dòng) 90 min/d。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，氧化型谷胱甘肽（GSSG）和還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購(gòu)自碧云天生物研究所，丙二醛（MDA）和HE染色試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所，兔抗大鼠多克隆抗體晚期糖基化末端產(chǎn)物 （AGEs）、晚期糖基化末端產(chǎn)物受體 （RAGE）、NADPH氧化酶2(NOX2)、二抗、DAB顯色試劑購(gòu)自武漢博奧森生物有限公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 取材及指標(biāo)測(cè)定

為了避免最后一次游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)物造成的應(yīng)激反應(yīng)，在最后一次游泳運(yùn)動(dòng)結(jié)束48 h后，過(guò)夜禁食12 h，麻醉處死大鼠取材。

1．3．1 海馬HE染色及AGEs免疫組化檢測(cè)

腦組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片4 μm，HE染色。AGEs免疫組化染色采用SABC法，DAB顯色，中性樹(shù)脂封片，在Olympus顯微鏡400倍光鏡視野下，每張切片隨機(jī)選出6個(gè)視野并獲取圖像，采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)分析，得到平均光密度值（IOD）。

1．3．2 海馬 RAGE、NOX2 免疫印跡（WB）檢測(cè)及結(jié)果分析

取海馬組織，加入裂解液，勻漿，裂解，離心，取上清備用。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備分離膠和濃縮膠。經(jīng)SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，將膜移至封閉液封閉 1 h。將RAGE、NOX2一抗用5%的脫脂奶液稀釋至適當(dāng)濃度后與膜接觸（RAGE、NOX2稀釋比例均為1∶500），4℃孵育過(guò)夜。二抗室溫下孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光、顯影和定影。用生物凝膠成像分析儀掃描采圖，采用Quantityone軟件進(jìn)行分析，計(jì)算目的條帶與GAPDH條帶的光密度值之比值。

1．3．3 RT-PCR 法檢測(cè)海馬 NF-κB mRNA 表達(dá)

取大鼠海馬組織，采用TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度與純度，用DNase處理提取的RNA，以總RNA為模板，使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。SYBR Green法檢測(cè)基因，進(jìn)行PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參?；蛳鄬?duì)定量△Ct法計(jì)算各基因表達(dá)量。以2-△△Ct表示該基因相對(duì)表達(dá)量。mRNA引物合成由北京鼎國(guó)生物公司完成。

表1 目的基因的引物序列

1．3．4 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

黑色開(kāi)放檢測(cè)箱（50 cm×50 cm×80 cm），頂部安裝攝像頭觀察動(dòng)物的探索過(guò)程及活動(dòng)情況。檢測(cè)過(guò)程由適應(yīng)期、熟悉期和測(cè)試期3個(gè)階段組成。第1～3天為適應(yīng)期，每天將大鼠放入檢測(cè)箱內(nèi)，熟悉環(huán)境10 min；第4天為熟悉期，將兩個(gè)紅色、形狀、體積完全相同的正方體積木對(duì)稱放在盒子一端，將大鼠背向積木放入盒內(nèi)，大鼠自由探索10 min。測(cè)試期：間隔1 h后，開(kāi)始測(cè)試。將一個(gè)紅色積木替換為大小相近的綠色圓柱形積木，記錄5 min內(nèi)大鼠對(duì)新穎物體（綠色圓柱形積木）和熟悉物體（紅色正方體）的探索時(shí)間，應(yīng)用識(shí)別指數(shù)（recognition index，RI）來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，與新穎物體觸碰次數(shù)記為TN，與熟悉物體觸碰次數(shù)記為TF，計(jì)算公式為RI=TN/(TN+TF)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，正常組（C）CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列整齊致密，層次清楚，邊界清晰，胞核飽滿；糖尿病組（D）CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞腫脹，膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞間隙增寬。與糖尿病組（D）相比，糖尿病運(yùn)動(dòng)組（DS）CA1區(qū)的錐體細(xì)胞排列偏整齊，細(xì)胞稍腫脹，細(xì)胞間隙縮小。

圖1 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，×400）

2.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠學(xué)習(xí)記憶

由圖2可知，與正常組（C組）相比，2型糖尿病大鼠（D 組）RI顯著降低（P﹤0.01）；與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)顯著升高了2 型糖尿病大鼠的 RI（P﹤0.05）。

圖2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠認(rèn)知指數(shù)（RI）的影響

2.3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs平均光密度值（IOD）的影響

由圖3～4可知，與正常組（C組）相比，2型糖尿病大鼠（D組）海馬CA1區(qū)AGEs平均光密度值（IOD）顯著升高（P﹤0.01）；與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)顯著降低了2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs的平均光密度值（IOD）（P﹤0.05），但仍高于正常組（C 組）（P﹤0.05）。

圖3 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs平均光密度值（IOD）的影響（免疫組化，×400）

圖4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs平均光密度值（IOD）的影響

2.4 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬RAGE、NOX2蛋白表達(dá)的影響

由圖5可知，與正常組（C組）相比，2型糖尿病大鼠（D組）海馬RAGE、NOX2蛋白表達(dá)顯著升高（P﹤0.01）；與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)顯著降低了2型糖尿病大鼠海馬RAGE、NOX2蛋白表達(dá)（P﹤0.05），但仍高于正常組（C 組）（P﹤0.01 或 P﹤0.05）。

圖5 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì) 2 型糖尿病大鼠海馬RAGE、NOX2蛋白表達(dá)的影響

2.5 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬NF-κB mRNA表達(dá)的影響

由圖6可知，與正常組（C組）相比，2型糖尿病大鼠（D組）海馬NF-κB mRNA表達(dá)顯著升高（P﹤0.01）；與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)顯著降低了2型糖尿病大鼠海馬NF-κB mRNA表達(dá)（P﹤0.05），但仍高于正常組（C組）（P﹤0.05）。

圖6 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬NF-κB mRNA表達(dá)的影響

2.6 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬MDA、GSSG/GSH 的影響

由表2可知，與正常組 （C組）相比，2型糖尿病大鼠（D組）海馬 MDA、GSSG/GSH顯著升高 （P﹤0.01）；與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)顯著降低了2型糖尿病大鼠海馬 MDA、GSSG/GSH（P﹤0.01 或 P﹤0.05），但仍高于正常組（C 組）（P﹤0.01 或 P﹤0.05）。

表2 游泳運(yùn)動(dòng)對(duì)2型糖尿病大鼠海馬MDA、GSSG/GSH的影響

3 討論

作為氧化應(yīng)激和慢性高血糖產(chǎn)物的糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）一直被作為研究糖尿病各種慢性并發(fā)癥的重要地位。AGEs的發(fā)生需要幾周甚至幾個(gè)月，因此多發(fā)生于半衰期長(zhǎng)、轉(zhuǎn)換率低的蛋白質(zhì)。AGEs可通過(guò)交聯(lián)形成大分子物質(zhì)，沉積在大腦、腎臟、心血管等各種組織器官，從而導(dǎo)致腦組織以及其他器官的病變。

腦組織中AGEs的聚集主要產(chǎn)生以下毒性反應(yīng)：①AGEs與其特異性受體RAGE結(jié)合，促進(jìn)NADPH氧化酶（NADPH oxidase）活化，產(chǎn)生大量活性氧（ROS），進(jìn)而激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，引起大量促炎細(xì)胞因子的生成，觸發(fā)炎癥反應(yīng)，造成組織細(xì)胞的損傷[10]；②Tau蛋白是神經(jīng)細(xì)胞骨架成分含量最高的微管相關(guān)蛋白，可參與多種細(xì)胞功能。腦組織內(nèi)Tau蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)，造成微管結(jié)構(gòu)受損，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙[11]；③ β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用。腦中Aβ被糖基化修飾后誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能激活神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞并使其獲得吞噬功能，進(jìn)而引起神經(jīng)元損傷[12]?？傊珹GEs介導(dǎo)的損害作用可影響糖尿病動(dòng)物海馬神經(jīng)元的產(chǎn)生，這或許是糖尿病相關(guān)抑郁癥以及認(rèn)知能力下降發(fā)病的潛在機(jī)制[13]。

AGEs與其受體RAGE結(jié)合過(guò)程中產(chǎn)生ROS，NADPH氧化酶在此過(guò)程中起著重要作用。AGEs可誘導(dǎo)表達(dá)野生型NADPH氧化酶的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生ROS和細(xì)胞因子，而NADPH氧化酶中心亞基gp91phox缺失的巨噬細(xì)胞與AGEs共同作用，沒(méi)有ROS和細(xì)胞因子的生成增加，提示NADPH氧化酶的活化在AGEs/RAGE介導(dǎo)的氧化應(yīng)激中起了重要作用，RAGE或AGEs抑制劑均可阻止此信號(hào)通路[14]。 Zhang等[15]在心肌細(xì)胞、Nitti等[16]在神經(jīng)細(xì)胞也證實(shí)AGEs/PKC-α/NADPH氧化酶活化通路的存在。NADPH氧化酶活化所誘導(dǎo)的ROS增多可激活MAPK、NF-κB和JAK/STAT等多條信號(hào)通路[17]。NADPH氧化酶介導(dǎo)核因子-κB（NF-κB）的活化可使炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，NADPH氧化酶抑制劑DPI（diphenyleneiodonium）可阻止此效應(yīng)[18]。 Kim等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)老年大鼠腎臟AGEs/RAGE表達(dá)增多可激活NADPH氧化酶，進(jìn)而促進(jìn)NF-κB的表達(dá)，山奈酚（kaempferol）可通過(guò)抑制NADPH氧化酶的活性進(jìn)而下調(diào)NF-κB依賴的促炎基因的表達(dá)。

本文的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組（C組）相比，2型糖尿病大鼠（D組）海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，具體表現(xiàn)為排列紊亂，細(xì)胞腫脹，膠質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞間隙增寬等。2型糖尿病大鼠（D組）海馬CA1區(qū)AGEs集聚增多，海馬RAGE和NOX2（NADPH氧化酶2）蛋白表達(dá)增多，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，NF-κB mRNA表達(dá)顯著升高，糖尿病大鼠認(rèn)知指數(shù)（RI）顯著降低。由此推測(cè)，由于糖尿病導(dǎo)致的大鼠海馬AGEs集聚增多，AGEs及其所引發(fā)的AGEs/RAGE/NOX2/氧化應(yīng)激/NF-κB信號(hào)通路的增強(qiáng)可能在損害糖尿病大鼠認(rèn)知能力中起著重要的作用。運(yùn)動(dòng)是防治2型糖尿病及其并發(fā)癥的常用輔助方法之一。已有研究表明運(yùn)動(dòng)可降低糖尿病機(jī)體的血糖[20]和AGEs水平，提高糖尿病機(jī)體的抗氧化狀態(tài)和胰島素敏感性。本研究還表明，與糖尿病組（D組）相比，游泳運(yùn)動(dòng)降低了2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs的集聚，海馬RAGE和NOX2（NADPH氧化酶2）蛋白表達(dá)下降，氧化應(yīng)激減弱，NF-κB mRNA表達(dá)下降，糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)的錐體細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，糖尿病大鼠認(rèn)知指數(shù)（RI）得到提高。總之，運(yùn)動(dòng)在改善糖尿病大鼠認(rèn)知功能及海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能方面起著一定的作用，具體機(jī)制可能與運(yùn)動(dòng)可以降低2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs的集聚，進(jìn)而減弱AGEs所引發(fā)的AGEs/RAGE/NOX2/氧化應(yīng)激/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，12周游泳運(yùn)動(dòng)可降低2型糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)AGEs的集聚、RAGE和NOX2蛋白表達(dá)，減弱大鼠海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)和NF-κB mRNA表達(dá)，進(jìn)而改善糖尿病大鼠海馬的形態(tài)結(jié)構(gòu)和認(rèn)知功能。