高 青，楊 濤，張洪艷，王琦玉，關(guān)艷中

(牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

酒精成癮是一種復(fù)雜的慢性腦病，高復(fù)發(fā)率是酒精成癮在臨床治療中面臨的重大挑戰(zhàn)之一，既往研究指出酒精成癮治療后3個(gè)月的復(fù)發(fā)率達(dá)到60%～70%，1年后復(fù)發(fā)率達(dá)到80%～90%，因此預(yù)防復(fù)發(fā)十分必要[1]。研究表明，酒精可通過對(duì)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)神經(jīng)元的抑制作用來激活VTA中的多巴胺能環(huán)路[2]。cGMP在谷氨酸能、膽堿能和多巴胺能信號(hào)通路中起重要作用，cGMP參與酒精引起的抑制性突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long-Term Potentiation of GABAergic synapse,LTPGABA)[3]。然而，cGMP對(duì)VTA區(qū)大鼠飲酒偏好的研究比較少見。本實(shí)驗(yàn)我們通過建立SD大鼠主動(dòng)飲酒模型，外源性注射cGMP類似物以及鳥苷酸環(huán)化酶的抑制劑觀察對(duì)大鼠飲酒偏好的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠48只，體重170～210 g。哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYKX(黑)2015-007。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)安靜整潔，溫度控制在(22±2)℃，單籠飼養(yǎng)(12 h黑夜/12 h白晝，早8:00開燈)，食物和水供應(yīng)充足。動(dòng)物適應(yīng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，所有動(dòng)物飼養(yǎng)與使用均符合牡丹江醫(yī)學(xué)院動(dòng)物福利和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑食用酒精(濃度≥95%)，8-Br-cGMP(美國(guó)Sigma公司)，ODQ(美國(guó)Sigma公司)，cGMP ELISA試劑盒(美國(guó)abcam公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器腦立體定位儀(上海玉妍公司)，微量進(jìn)樣針(上海玉妍公司)，微型顱骨鉆(深圳瑞沃德有限公司)，雙管套管針、帽芯、注射內(nèi)管(深圳瑞沃德有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 制作動(dòng)物模型 選取雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=6)和飲酒組(n=12)。每個(gè)鼠籠放置兩個(gè)做好標(biāo)記的瓶子，一瓶為20%的酒精水溶液，另一瓶為飲用水，24 h后將20%酒精瓶換成水瓶(此時(shí)兩瓶均為飲用水)，再過24 h，20%酒精瓶替換其中一瓶飲用水，并且交換兩個(gè)瓶子的位置，以排除位置偏好的影響。每天早8:30～9:30配置新酒精溶液并更換隔離服進(jìn)動(dòng)物房，飲水瓶每天更換新鮮飲用水。每天分別記錄酒精和水的消耗量，如此重復(fù)28 d，大鼠飲酒量及飲酒偏好達(dá)到穩(wěn)定水平，并且每天酒精攝入量低于3.15 g/(kg·24 h)的大鼠被淘汰[4]，即成功制作酒精成癮大鼠模型。所有大鼠于每周固定時(shí)間稱重一次用于觀察體重變化以及排除個(gè)體差異。20%酒精的飲酒偏好[5](%)=酒精消耗量/(酒精消耗量+水消耗量)×100。

1.4.2 VTA區(qū)cGMP含量的測(cè)定 在1.4.1制作動(dòng)物飲酒模型基礎(chǔ)上，建模成功后再把飲酒組分為末次飲酒與戒斷72 h組。ELISA法檢測(cè)cGMP含量。步驟如下：將大鼠麻醉后斷頭取腦，切取VTA腦組織于液氮下快速冷凍，冷凍后將組織取出用研磨棒充分研磨，液氮蒸發(fā)后，快速稱重。然后以10體積0.1 M鹽酸裂解組織，10000 rpm離心約10 min。離心后取上清液按照試劑盒操作步驟加樣檢測(cè)。

1.4.3 藥物對(duì)間歇性飲酒模型飲酒偏好的檢測(cè) 選取SD大鼠30只，按照1.4.1制作動(dòng)物飲酒模型，并在建模第21天時(shí)VTA區(qū)埋置套管，然后繼續(xù)間歇性飲酒至28 d。建模成功后酒精戒斷72 h，隨機(jī)分成假手術(shù)組(n=6)、8-Br-cGMP組(VTA區(qū)微量注射8-Br-cGMP，n=6)、8-Br-cGMP的溶劑對(duì)照組即ACSF組(VTA區(qū)微量注射ACSF，n=6)、ODQ組(VTA區(qū)微量注射ODQ，n=6)、ODQ的溶劑對(duì)照組即DMSO組(VTA區(qū)微量注射DMSO：ACSF=1的混合液，n=6)。將大鼠用七氟烷麻醉后固定于腦立體定位儀上，經(jīng)套管在每側(cè)VTA區(qū)注射給藥0.5 L，注射時(shí)間為1 min，注射后留針1 min以便藥物擴(kuò)散。其中8-Br-cGMP溶于ACSF中，給藥濃度是10 g/0.5 L；ODQ溶于DMSO中，給藥之前用ACSF按1∶1稀釋，最終給藥濃度是0.187 g/0.5 L[6]。觀察給藥后6 h內(nèi)飲酒偏好情況[7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)處理均采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，作圖采用GraphPad Prism 7.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One way ANOVA方差分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 建模期間體重變化實(shí)驗(yàn)前對(duì)照組與飲酒組大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組與飲酒組大鼠體重亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖1。

圖1 對(duì)照組與飲酒組體重變化

2.2 建模期間飲酒量及酒精偏好變化隨著飲酒次數(shù)的增加大鼠酒精攝入量逐漸升高，經(jīng)過14次飲酒循環(huán)后酒精消耗量及飲酒偏好達(dá)到穩(wěn)定基線，酒精攝入量為(4.23±0.55)g/(kg·24 h)，飲酒偏好為(58.25±5.14)%，見圖2、圖3。

圖2 飲酒組酒精攝入量變化

圖3 飲酒組飲酒偏好變化

2.3 VTA區(qū)cGMP含量的變化經(jīng)ELISA檢測(cè)，與對(duì)照組比較，末次飲酒組和戒斷72 h組cGMP含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖4。

圖4 VTA區(qū)cGMP含量

2.4 藥物對(duì)間歇性飲酒模型飲酒偏好的影響

2.4.1 8-Br-cGMP對(duì)間歇性飲酒大鼠飲酒偏好的影響 給藥后6 h內(nèi)飲酒偏好結(jié)果：與假手術(shù)組和ACSF組比較，8-Br-cGMP組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.89，P=0.005)，見圖5。

圖5 戒斷72 h后給藥6 h內(nèi)飲酒偏好結(jié)果

2.4.2 ODQ對(duì)間歇性飲酒大鼠飲酒偏好的影響 給藥后6 h內(nèi)飲酒偏好結(jié)果：與假手術(shù)組和DMSO組比較，ODQ組明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.47，P<0.001)。見圖 6。

圖6 戒斷72 h后給藥6 h內(nèi)飲酒偏好結(jié)果

3 討論

酒精成癮是一種失控且紊亂的飲酒行為，被定義為一種病理狀態(tài)行為綜合征[8]。酒精成癮除了機(jī)體對(duì)酒精產(chǎn)生耐受，停止飲酒后出現(xiàn)戒斷癥狀(如出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知障礙，特別是在智力、記憶、和運(yùn)動(dòng)技能等方面)外，還突出表現(xiàn)為強(qiáng)迫性覓酒行為，對(duì)酒的強(qiáng)烈渴求和反復(fù)濫用[9]。酒精成癮患者的病程較長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率較高、治療難度大、危害程度重，其影響因素一直是科學(xué)研究的焦點(diǎn)問題。

VTA是一個(gè)已知的編碼獎(jiǎng)賞和厭惡的大腦區(qū)域，酒精在VTA中的作用可誘導(dǎo)神經(jīng)適應(yīng)，導(dǎo)致酒精的獎(jiǎng)勵(lì)效應(yīng)相對(duì)增強(qiáng)[10-11]。所以我們本次實(shí)驗(yàn)主要研究VTA腦區(qū)。cGMP作為細(xì)胞內(nèi)重要第二信使，由鳥苷酸環(huán)化酶作用產(chǎn)生。以往研究已證明cGMP與中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central Nervous System，CNS)的認(rèn)知、焦慮、成癮、精神分裂癥和抑郁癥等多個(gè)方面有關(guān)[12]。cGMP能抑制與成癮相關(guān)腦區(qū)多巴胺的釋放，急性酒精刺激可增加大鼠某些神經(jīng)元中cGMP水平[13]。也有研究表明，酒精成癮患者戒斷后腦脊液中cGMP含量在急性震顫譫語(yǔ)狀態(tài)下顯著升高?？梢奵GMP與酒精成癮之間關(guān)系密切。

本實(shí)驗(yàn)采用雄性SD大鼠間歇性主動(dòng)飲酒28 d，飲酒量及酒精偏好達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)，成功建立了酒精成癮大鼠模型，模型建立成功后給予酒精戒斷72 h，ELISA法檢測(cè)到此時(shí)VTA區(qū)cGMP含量明顯增加。已知8-Br-cGMP是一種cGMP的可溶類似物；ODQ被認(rèn)為是大腦中有用的鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑，并被用于探索cGMP在參與阿片類藥物戒斷相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)和行為反應(yīng)中的作用[14]。當(dāng)鳥苷酸環(huán)化酶被ODQ抑制時(shí)，突觸刺激和外源性一氧化氮供體均不能誘導(dǎo)LTPGABA[15]。當(dāng)向大鼠VTA區(qū)外源性注射8-Br-cGMP和ODQ后再飲酒時(shí)，結(jié)果證明8-Br-cGMP可以增加酒精戒斷大鼠的飲酒偏好，ODQ可減輕飲酒偏好。由此可見cGMP在VTA區(qū)確實(shí)對(duì)酒精成癮大鼠的酒精偏好行為具有調(diào)節(jié)作用。有研究表明在慢性高濃度(7.2%，v/v)飲酒模型中大鼠大腦皮層、紋狀體和海馬中cGMP水平均明顯升高，即使在戒斷24 h后，海馬cGMP水平仍顯著升高[16]；Shen[6]曾指出在SD大鼠海馬內(nèi)注射8-Br-cGMP對(duì)嗎啡誘導(dǎo)的條件性位置偏愛鞏固過程有增強(qiáng)作用；KURAUCHI[17]曾指出ODQ可消除酒精引起的cGMP升高和心肌氧消耗的降低；在慢性嗎啡依賴的大鼠中，ODQ可以抑制藍(lán)斑核中納洛酮誘導(dǎo)的戒斷癥狀，這與我們的結(jié)果是一致的。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)cGMP在間歇性主動(dòng)飲酒大鼠酒精戒斷后再飲酒時(shí)的飲酒偏好中具有重要調(diào)節(jié)作用，外源性注射cGMP類似物或鳥苷酸環(huán)化酶的抑制劑可明顯增強(qiáng)或降低酒精戒斷大鼠的飲酒偏好，這為預(yù)防酒精復(fù)發(fā)的臨床治療提供了新方向。