潘倩 劉艷梅 周賢棟 潘學(xué)軍 楊本芹

摘 要：剩余污泥中蛋白質(zhì)的資源化利用是目前研究的熱點(diǎn)，污泥預(yù)處理則是實(shí)現(xiàn)污泥中蛋白質(zhì)釋放的重要途徑。為了進(jìn)一步提高剩余污泥中蛋白質(zhì)的溶出效果，選取熱堿預(yù)處理、超聲堿聯(lián)合預(yù)處理、溶菌酶預(yù)處理對污泥進(jìn)行溶胞，以蛋白質(zhì)提取濃度為主要指標(biāo)進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，并利用等電點(diǎn)法對粗提取蛋白進(jìn)行純化回收。結(jié)果表明：溶胞效果熱堿預(yù)處理（pH值13、溫度140 ℃、時間1.5 h，2 062.98 mg/L）>超聲堿聯(lián)合預(yù)處理（497.76 mg/L）>溶菌酶預(yù)處理（269.95 mg/L），且在pH值為3時熱堿預(yù)處理蛋白質(zhì)純化回收率可達(dá)62.42 %。試驗(yàn)結(jié)果表明：熱堿預(yù)處理在提取效果方面較另外兩種方法優(yōu)勢明顯，具有良好的利用前景。

關(guān)鍵詞：剩余污泥;熱堿預(yù)處理;超聲堿聯(lián)合預(yù)處理;溶菌酶預(yù)處理;蛋白質(zhì)

中圖分類號：X703?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?? 文章編號：2096-6717（2020）04-0132-09

收稿日期：2020-11-11

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（No. 51608241）

作者簡介：潘倩（1996- ），女，主要從事剩余污泥的資源化利用研究，E-mail：547078323@qq.com。

楊本芹（通信作者），女，博士，副教授，E-mail：ynybq87@kust.edu.cn。

Received：2020-11-11

Foundation items：National Natural Science Foundation of China （No. 51608241）

Author brief：PAN Qian （1996- ）， main research interest： resource utilization of residual sludge， E-mail： 547078323@qq.com.

YANG Benqin （corresponding author）， PhD， associate professor， E-mail： ynybq87@kust.edu.cn.

Optimal research on methods to extract protein from residual sludge of recycling

PAN Qian， LIU Yanmei， ZHOU Xiandong， PAN Xuejun， YANG Benqin

（Faculty of Environmental Science and Engineering，Kunming University of Science and Technology， Kunming 650500， P. R. China）

Abstract： The resource utilization of protein in excess sludge is a research hotspot at home and abroad， and sludge pretreatment is an important way to realize protein release from sludge. In order to further improve the dissolution efficiency of protein in excess sludge， this paper selected thermal-alkali pretreatment， ultrasonic-alkali pretreatment and lysozyme pretreatment as the method of disintegration in sludge， and optimized the parameters with the protein extraction concentration as the main index. The isoelectric point method was also used to purify and recover crude protein. The results showed that the cellulolytic effect： thermal-alkali pretreatment （pH 13， temperature 140 ℃， time 1.5 h， 2 062.98 mg/L） > ultrasonic-alkali pretreatment （497.76 mg/L） > lysozyme pretreatment （269.95 mg/L）， and the protein purification recovery of thermal-alkali pretreatment at pH 3 can reach 62.42%. It can be seen from the above test results that the thermal-alkali pretreatment has obvious advantages over the other two methods in terms of extraction effect， deserving of exploitation and utilization.

Keywords：excess sludge; thermal-alkali pretreatment; ultrasound-alkali pretreatment; lysozyme pretreatment; protein

剩余污泥是指污水處理廠在對污水進(jìn)行生化處理時產(chǎn)生的不同廢棄物的混合物。近年來，隨著污水處理量的不斷增多，剩余污泥的產(chǎn)量也逐年上升，預(yù)計(jì)2020年—2025年間，污泥的年產(chǎn)量有望突破6 000萬t（以含水率80%計(jì)算）[1]。研究表明，剩余污泥的處理處置費(fèi)用高達(dá)整個污水廠總運(yùn)行費(fèi)用的65%[2]，超過80%的污泥因處理不當(dāng)成為環(huán)境的二次污染源[3]。因此，將污泥進(jìn)行有效處理，以減少其對環(huán)境的污染是目前水處理行業(yè)發(fā)展的重中之重。

剩余污泥中含有大量蛋白質(zhì)（約占污泥總量的30%～60%），充分利用其中的蛋白質(zhì)，一方面可以達(dá)到污泥資源化的目的，另一方面還能減輕剩余污泥對環(huán)境的危害[4]。蛋白質(zhì)資源化途徑包括動物飼料、木材粘合劑、泡沫滅火劑以及混凝土發(fā)泡劑等。Hwang等[5]發(fā)現(xiàn)，在污泥中提取出來的蛋白質(zhì)重金屬含量低于法定標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果中也不含黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和沙門氏菌D組等有毒有害物質(zhì)，且對其進(jìn)行白鼠試驗(yàn)無明顯影響，證實(shí)其應(yīng)用于動物飼料具有可行性。Pervaiz等[6]發(fā)現(xiàn)，從污泥中回收的蛋白質(zhì)較未處理的污泥抗剪強(qiáng)度有很大提升，有作為木材粘合劑的巨大潛能。Li等[7]發(fā)現(xiàn)，對啤酒廠污泥進(jìn)行處理后，其中提取出的蛋白質(zhì)可作為復(fù)合蛋白發(fā)泡劑使用。由此可見，剩余污泥中提取回收的蛋白質(zhì)有很大的利用空間。

截至目前，剩余污泥中蛋白質(zhì)的提取技術(shù)還未得到廣泛應(yīng)用，其原因主要是效率低、不經(jīng)濟(jì)。污泥預(yù)處理是目前使用最多的提高蛋白質(zhì)溶出效率的方法，其中主要包含熱預(yù)處理[8]、堿預(yù)處理[9]、臭氧預(yù)處理[10]、超聲預(yù)處理[11]、酶預(yù)處理[12]以及其中幾種處理方式形成的聯(lián)合預(yù)處理。在單獨(dú)預(yù)處理方式中，不同的預(yù)處理方式都存在其相應(yīng)的缺點(diǎn)，例如，熱預(yù)處理能耗較高，堿預(yù)處理對儀器腐蝕較大，臭氧預(yù)處理適用范圍過窄，超聲預(yù)處理難以應(yīng)用到實(shí)際工程中等[13]。聯(lián)合預(yù)處理是基于不同預(yù)處理方式的作用條件，充分考慮其協(xié)同作用，進(jìn)一步提高污泥細(xì)胞的溶解效率的一種高效預(yù)處理方法。目前，大部分研究者對單獨(dú)的預(yù)處理提取蛋白質(zhì)進(jìn)行了許多條件優(yōu)化，但很少有對不同預(yù)處理方法進(jìn)行比較并對所提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化回收的研究。

筆者采用熱堿聯(lián)合預(yù)處理[14]、超聲堿聯(lián)合預(yù)處理[15]和溶菌酶預(yù)處理[16]3種預(yù)處理方法，通過對溶出蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行分析，探究其發(fā)揮破胞作用的最優(yōu)條件，并分別比較3種方法提取蛋白質(zhì)的效果，最后優(yōu)化等電點(diǎn)法，確定回收純化蛋白質(zhì)的最佳pH值，旨在為污泥中蛋白質(zhì)的提取利用提供相應(yīng)參考。

1 材料與方法

剩余污泥取自昆明市污水廠的污泥濃縮池，該廠內(nèi)采用A2/O（Anaerobic-Anoxic-Oxic）工藝進(jìn)行污水生物處理。剩余污泥主要理化性質(zhì)如表1所示。

試驗(yàn)以蛋白質(zhì)濃度為主要指標(biāo)來確定各項(xiàng)預(yù)處理方法的最優(yōu)破胞條件。原始污泥總蛋白濃度使用凱氏定氮法[17]測定，離心后的上清液中蛋白質(zhì)采用BCA蛋白質(zhì)試劑盒[18]結(jié)合酶標(biāo)儀（MultiskanTM FC，賽默飛世爾科技）測定。

凱氏定氮法蛋白質(zhì)計(jì)算見式（1）。

X=（V1-V2）×c×0.014m×V3/100×F×100（1）

式中：X為蛋白質(zhì)含量，g/（100 g）;V1為試液消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL;V2為試劑空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，mL;c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的濃度，mol/L;m為試樣的質(zhì)量，g;V3為吸取消化液的體積，mL;F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，取6.25。

2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將污水廠所取剩余污泥濃度調(diào)至約20 000 mg/L，然后分別進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1 熱堿破解剩余污泥試驗(yàn)

熱堿破解污泥試驗(yàn)主要從pH值、溫度、時間3個影響因素來考察污泥溶胞效果，設(shè)置如下單因素試驗(yàn)：

1）pH優(yōu)化試驗(yàn)。? 參照崔靜等[19]和翟世民等[20]的研究，在破胞溫度為140 ℃、時間為2 h的條件下，在5個燒杯中分別取100 mL的剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液將pH值分別調(diào)至9、10、11、12和13后在恒溫箱（XMTD-8222，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）中進(jìn)行溶胞，優(yōu)化出最優(yōu)pH值。

2）溫度優(yōu)化試驗(yàn)。? 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，恒溫箱溫度分別調(diào)節(jié)為100、120、140、160、180、200 ℃，在優(yōu)化得到的最優(yōu)pH值條件下破胞2 h，得到最優(yōu)溫度。

3）時間優(yōu)化試驗(yàn)。? 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優(yōu)pH值和溫度下，分別破胞0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時間重復(fù)前兩個步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

2.2 超聲堿聯(lián)合破解污泥試驗(yàn)

超聲聯(lián)合堿破解污泥試驗(yàn)主要從pH值、超聲功率、超聲時間3個影響因素考察污泥破胞效果，設(shè)定如下單因素試驗(yàn)：

1）pH值優(yōu)化試驗(yàn)。? 參照康曉榮[21]的研究，在溶胞功率為3 W/mL（超聲期間超聲3 s停1 s）、時間為30 min的條件下，在5個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，用4 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值，依次為9、10、11、12和13，進(jìn)行破胞，優(yōu)化出最優(yōu)pH值。

2）功率優(yōu)化試驗(yàn)。? 在6個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在最優(yōu)pH值條件下調(diào)節(jié)超聲功率，依次為1、2、3、4、5、6 W/mL，破胞30 min，優(yōu)化出最優(yōu)功率。

3）時間優(yōu)化試驗(yàn)。? 在5個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，在得到的最優(yōu)pH值和超聲功率條件下依次破胞10、20、30、40、50 min，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時間重復(fù)前兩個步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

2.3 溶菌酶破解污泥試驗(yàn)

溶菌酶（溶菌酶凍干粉，北京索萊寶科技有限公司）破解試驗(yàn)主要從pH值、酶濃度、處理時間3個影響因素來考察污泥的破胞效果，設(shè)定如下單因素試驗(yàn)：

1）pH值優(yōu)化試驗(yàn)。? 溶菌酶試驗(yàn)參照陸鈞皓[22]的研究，在12個燒杯中分別取100 mL剩余污泥，其中6個保持酶濃度在200 mg/g，依次調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h;另外6個在不加酶的情況下，依次調(diào)節(jié)pH值為4、5、6、7、8、9，于室溫下破胞4 h;依據(jù)兩者差值即可分析酶單獨(dú)作用時的最優(yōu)pH值。

2）酶濃度優(yōu)化試驗(yàn)。? 在7個燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，依次調(diào)節(jié)燒杯酶濃度為60、90、120、150、200、250、280 mg/g，在確定的最優(yōu)pH值和室溫下破胞4 h，優(yōu)化出最優(yōu)酶濃度。

3）時間優(yōu)化試驗(yàn)。? 在7個燒杯中分別取100 mL等濃度的剩余污泥，調(diào)節(jié)酶濃度及pH值為確定的最優(yōu)值，室溫下依次反應(yīng)2、3、4、5、6、7、8 h，若此步優(yōu)化得出的試驗(yàn)結(jié)果與前兩步優(yōu)化時所用時間不一致，則用該步驟得到的最優(yōu)時間重復(fù)前兩個步驟，得出最終試驗(yàn)結(jié)果。

經(jīng)以上每種因素預(yù)處理后的污泥溶液均在8 000 rpm高速冷凍離心機(jī)上離心20 min，離心后上清液過0.45 μm濾膜，取濾液進(jìn)行蛋白質(zhì)的濃度測定，以得到高效經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法及其最優(yōu)作用條件。

2.4 溶菌酶對提取后蛋白質(zhì)的影響

以熱堿預(yù)處理為例，測定熱堿預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液，得到蛋白質(zhì)濃度值P1。再分別稱取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g的溶菌酶凍干粉加入100 mL水中，得到6種不同濃度的溶菌酶溶液，測定蛋白質(zhì)濃度依次為Q1、Q2、Q3、Q4、Q5、Q6。取預(yù)處理后的蛋白質(zhì)溶液，分別與6種配制溶菌酶溶液各5 mL進(jìn)行混合，得到10 mL不同濃度蛋白質(zhì)混合液，測定蛋白質(zhì)濃度依次為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6。最后檢驗(yàn)等式（2）是否成立，以探究溶菌酶對提取后蛋白質(zhì)濃度的影響。

P1×5+Qx×510=Zx（2）

式中，x的取值范圍為1～6。

2.5 等電點(diǎn)回收蛋白質(zhì)試驗(yàn)條件優(yōu)化

將試驗(yàn)得到的上清液稱為蛋白溶液。在6個燒杯中分別取100 mL 蛋白溶液，利用2 mol/L的硫酸溶液調(diào)節(jié)其pH值，依次為1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5，然后于-4 ℃冰箱靜置1.5 h，將靜置后的蛋白溶液于8 000 rpm下離心20 min，得到的上清液過0.45 μm濾膜，取部分濾液分別進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，剩下的濾液再分別通過纖維素透析袋（截留分子量20 000 Da）純化備用。

3 結(jié)果與討論

3.1 熱堿預(yù)處理參數(shù)的確定

如圖1（a）所示，隨著pH值的升高，溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高，在pH為12～13區(qū)間顯著增加。當(dāng)pH=13時，溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最大值2 515.55 mg/L（考慮到堿性過高對污泥處理實(shí)際意義不大，較高pH值會使污泥產(chǎn)生大量褐變反應(yīng)[23]，使其中小分子發(fā)生聚集，預(yù)處理效果反而會降低，故將pH=13設(shè)為最大值）。這說明當(dāng)pH<12時，污泥細(xì)胞的溶解程度不高，當(dāng)pH>12時，污泥溶胞率明顯上升。在高溫的協(xié)助作用下，強(qiáng)堿可以與細(xì)胞中的脂類物質(zhì)發(fā)生皂化反應(yīng)[24]，加速破壞污泥中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外，強(qiáng)堿具有化學(xué)和電離的雙重作用，更容易使污泥中的微生物細(xì)胞發(fā)生溶解，進(jìn)而使胞內(nèi)物質(zhì)溶出[25]，故選取pH值為13為最佳堿強(qiáng)度。

如圖1（b）所示，熱堿處理中蛋白質(zhì)濃度隨著溫度的升高而逐漸升高，在140 ℃時達(dá)到最大值1 810.87 mg/L，當(dāng)溫度超過140 ℃后，蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢。熱堿處理過程中，隨著溫度的升高，污泥中的微生物絮體結(jié)構(gòu)開始分散，細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)也在高溫的作用下溶解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量有機(jī)物溶出。大分子蛋白質(zhì)也在高溫作用下變成小分子蛋白質(zhì)，使溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高[26]。與此同時，在堿性條件下，過高的溫度會使蛋白質(zhì)水解為氨基酸，β-氨基酸是其主要成分，而β-氨基酸在高溫條件下會發(fā)生脫氨反應(yīng)，生成氨氣和不飽和羧酸鹽，在強(qiáng)堿條件下，氨氣會從溶液中溢出故溶液中溶解性蛋白質(zhì)的濃度會降低[27]。

圖1（c）所示為熱堿預(yù)處理時間對蛋白質(zhì)濃度的影響，熱堿處理前期，溶液中蛋白質(zhì)濃度隨時間逐漸增加，在處理時間為1.5 h時達(dá)到最大值2 068.46 mg/L，后期隨著時間的增加，蛋白質(zhì)濃度緩慢下降。這是因?yàn)樵跓釅A反應(yīng)中胞內(nèi)物質(zhì)的釋放和蛋白質(zhì)的水解是同時進(jìn)行的，在前1.5 h，參照Fan等[28]的試驗(yàn)結(jié)論，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放速率大于蛋白質(zhì)的堿性水解作用，故蛋白質(zhì)濃度呈現(xiàn)上升趨勢，1.5 h后，蛋白質(zhì)的水解速率大于胞內(nèi)蛋白質(zhì)溶出速率，故蛋白質(zhì)濃度呈現(xiàn)下降趨勢。Li等[29]的研究結(jié)果表明，堿破解污泥細(xì)胞的過程分為快速和慢速階段，大部分的胞內(nèi)有機(jī)物質(zhì)會在前30 min被釋放出來，因此，考慮到經(jīng)濟(jì)和溶胞效果，選取1.5 h為最佳預(yù)處理時間。

以上3個單因素試驗(yàn)結(jié)果確定了熱堿處理的最優(yōu)條件為：pH值13、時間1.5 h、溫度140 ℃，與預(yù)設(shè)條件存在相應(yīng)誤差，可能是因?yàn)槲勰嘈再|(zhì)和試驗(yàn)條件的差異。考慮到試驗(yàn)誤差情況，取三者蛋白質(zhì)最大濃度的平均值，即熱堿預(yù)處理在最佳條件下可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到2 062.98 mg/L。

3.2 超聲堿聯(lián)合預(yù)處理參數(shù)的確定

由圖2（a）可知，在超聲聯(lián)合堿預(yù)處理污泥時，堿的強(qiáng)度至關(guān)重要。當(dāng)pH<12時，隨著堿強(qiáng)度的增加，溶液中蛋白質(zhì)濃度不斷增加，在pH值為12時達(dá)到最大值488.73 mg/L，當(dāng)pH>12時，蛋白質(zhì)濃度開始下降。因?yàn)槌暡ň哂衅茐奈勰嘈躞w結(jié)構(gòu)的作用，當(dāng)聲波能量達(dá)到一定值時，污泥絮體結(jié)構(gòu)分散，加大污泥顆粒與堿的接觸面積，提高堿對細(xì)胞壁的破壞作用，堿性越強(qiáng)對污泥的溶胞效果越明顯[30]。但在超聲作用下，堿性過強(qiáng)會加快溶液中部分有機(jī)物的分解，進(jìn)而導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)含量降低。

圖2（b）顯示，在預(yù)處理時間為30 min、pH值為12的條件下，當(dāng)功率為1 W/mL時，蛋白質(zhì)濃度達(dá)到388.35 mg/L，當(dāng)功率繼續(xù)增加至4 W/mL時，蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，但當(dāng)功率為5 W/mL時，蛋白質(zhì)濃度迅速增加至最大值497.89 mg/L，后期隨著功率的增加，蛋白質(zhì)濃度再次呈下降趨勢。超聲波在聯(lián)合堿預(yù)處理時，主要憑借其空化作用[31]（通過剪切液體形成空化核）和聲化學(xué)作用[32]（通過超聲波加速反應(yīng)的進(jìn)行或產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì)）達(dá)到溶胞的目的。在功率由1 W/mL增加到4 W/mL的階段，蛋白質(zhì)濃度降低的原因可能是污泥絮體粒徑過大，堿未能很好地發(fā)揮作用，超聲功率的增加反而加快了蛋白質(zhì)的水解速率。超聲與堿聯(lián)合作用時存在最適功率和最佳粒徑的說法[33]，只有污泥經(jīng)過一定功率的超聲后，在剪切作用下分散成最佳粒徑大小，這時堿才能發(fā)揮其最大破壞作用使細(xì)胞內(nèi)容物流出。試驗(yàn)證明了5 W/mL為該試驗(yàn)條件下的最優(yōu)功率。

如圖2（c）所示，當(dāng)時間小于30 min時，蛋白質(zhì)濃度隨著時間的增加呈現(xiàn)上升趨勢，30 min時達(dá)到499.48 mg/L，30 min以后蛋白質(zhì)濃度趨于平穩(wěn)。在試驗(yàn)前期，超聲波和堿同時起作用，加速了污泥絮體結(jié)構(gòu)的分解和細(xì)胞壁的破碎，促使蛋白質(zhì)濃度不斷增加。但反應(yīng)持續(xù)一段時間后，一方面由于堿的消耗導(dǎo)致堿性下降，未能起到跟初期相同的堿解作用，另一方面超聲波單獨(dú)作用時破解細(xì)胞需要的能量更大，隨著堿解作用的降低，單獨(dú)的超聲作用只能破壞很小一部分污泥細(xì)胞，導(dǎo)致后期蛋白質(zhì)濃度不再有明顯增加[34]。

試驗(yàn)結(jié)果確定了超聲聯(lián)合堿預(yù)處理的最佳條件為：pH值12、功率5 W/mL、時間30 min。相同地，考慮到試驗(yàn)誤差取三者蛋白質(zhì)最大濃度的平均值，即在超聲聯(lián)合堿預(yù)處理的最優(yōu)作用條件下可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到497.76 mg/L。

3.3 溶菌酶預(yù)處理參數(shù)的確定

在酶濃度為200 mg/g、時間為6 h的條件下，在pH值跨度4～9的條件下試驗(yàn)研究了pH值的單獨(dú)作用效果，同時，以相同pH值跨度研究溶菌酶的作用效果，兩者的差值即為溶菌酶單獨(dú)作用時的效果。如圖3（a）差值變化曲線所示，當(dāng)pH值等于7時，酶單獨(dú)起作用時溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到241.06 mg/L，且高于其他任何pH值下的濃度。pH值是影響溶菌酶水解污泥的一個重要因素，過酸或過堿都會對酶發(fā)揮其最大活性產(chǎn)生影響。酶分子在不同的pH值溶液中具有不同解離狀態(tài)，固定的某種解離狀態(tài)只能與一種底物結(jié)合酶活性才能達(dá)到最高。除此之外，pH值也會影響酶分子中某些基團(tuán)的解離，酶底物的專一性、酶分子活性中心的構(gòu)象等都會影響這些基團(tuán)的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶的活性[35]。

如圖3（b）所示，當(dāng)酶濃度較低時，溶液中蛋白質(zhì)濃度隨著酶濃度的增高而增高，后期隨著酶濃度的增高，蛋白質(zhì)濃度增加趨勢較為平緩。當(dāng)溶菌酶濃度為200 mg/g時，溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到最高值297.14 mg/L。這是因?yàn)殡S著前期酶濃度的增加，底物開始與酶接觸反應(yīng)，促使大量的有機(jī)物質(zhì)由固相轉(zhuǎn)移到液相中，使得溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸升高。但當(dāng)反應(yīng)體系中所有底物與所投加溶菌酶充分接觸后，底物幾乎已全部與酶分子結(jié)合形成絡(luò)合物[36]，故當(dāng)酶量增加時，溶液中蛋白質(zhì)濃度不再顯著增加。

如圖3（c）所示，當(dāng)反應(yīng)時間小于6 h時，隨著反應(yīng)時間的增加，溶液中蛋白質(zhì)濃度逐漸增加，在6 h時達(dá)到271.65 mg/L，當(dāng)反應(yīng)時間大于6 h時，蛋白質(zhì)濃度呈明顯降低的趨勢。反應(yīng)時間是酶發(fā)揮活性的一個重要因素，只有當(dāng)在酶與底物充分接觸，充分反應(yīng)之后，污泥才能最大程度地釋放其內(nèi)含物，進(jìn)而使得溶液中蛋白質(zhì)濃度上升。在反應(yīng)的前6 h內(nèi)，在外界振蕩和恒溫條件下，酶與剩余污泥不斷反應(yīng)，使得污泥被水解并釋放出大量胞內(nèi)物，導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)濃度上升，當(dāng)大于6 h后，溶菌酶已與底物充分接觸反應(yīng)，此時蛋白質(zhì)的水解速度大于其釋放速度，進(jìn)而溶液中蛋白質(zhì)濃度呈下降趨勢。

由以上3個因素影響試驗(yàn)確定溶菌酶預(yù)處理的最優(yōu)條件為：pH值7、酶濃度200 mg/g，時間6 h，在最優(yōu)作用條件下，可使溶液中蛋白質(zhì)濃度達(dá)到269.95 mg/L。

通過對3種方法的結(jié)果對比，得出熱堿法（2 062.98 mg/L）>超聲聯(lián)合堿法（497.76 mg/L）>溶菌酶法（269.95 mg/L），故選取熱堿法進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

經(jīng)過預(yù)處理后的蛋白質(zhì)可能會發(fā)生部分變性，但不影響后期對提取蛋白質(zhì)粘度特性[37]，故暫時不用考慮蛋白質(zhì)變性對試驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.4 溶菌酶對提取后蛋白質(zhì)的影響結(jié)果

如圖4所示，A、B、C、D、E、F分別代表提取蛋白質(zhì)溶液分別與0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/mL的溶菌酶溶液混合得到的蛋白質(zhì)濃度理論值與實(shí)際值。由圖4可以看出，理論值與實(shí)際值差距很小，幾乎可以忽略，溶菌酶對提取蛋白質(zhì)濃度幾乎無影響。溶菌酶的作用機(jī)制主要是針對細(xì)胞壁上的肽聚糖，通過肽鍵上的活性部位水解切斷N-乙酰葡萄糖胺與N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，從而達(dá)到破壞細(xì)胞壁的作用，對蛋白質(zhì)沒有破壞作用，這與試驗(yàn)得出的結(jié)論一致[38]。

3.5 等電點(diǎn)回收蛋白質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果

圖5顯示了由熱堿法提取的上清液采用等電點(diǎn)法回收蛋白質(zhì)隨pH值的影響，蛋白質(zhì)回收率隨pH值的增加呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)pH值為3時，蛋白質(zhì)的回收率達(dá)到最大值62.42%。蛋白質(zhì)是由多種氨基酸連接而成的生物大分子，兩性電解質(zhì)，在偏酸和偏堿溶液中會分別帶正電和負(fù)電。通過調(diào)節(jié)pH值的大小可破壞或削弱分子表面的水化膜和雙電層，使分子間引力增加，進(jìn)而降低蛋白質(zhì)在溶液中的溶解度，變?yōu)槌恋砦龀鯷39]。Hwang等[5]發(fā)現(xiàn)，在pH值為3.3時城市污泥蛋白質(zhì)回收率最高，其結(jié)論與本研究相符。

4 結(jié)論與展望

采用熱堿法、超聲堿聯(lián)合法、溶菌酶法分別對剩余污泥進(jìn)行預(yù)處理，得出最優(yōu)預(yù)處理?xiàng)l件，對比提取效率可看出：熱堿法（pH值13、溫度140 ℃、時間1.5 h，2 062.98 mg/L）>超聲聯(lián)合堿法（pH值12、功率5 W/mL、時間30 min，497.76 mg/L）>溶菌酶法（pH值7、酶濃度200 mg/g、時間6 h，269.95 mg/L），對熱堿法提取的上清液采用等電點(diǎn)法回收蛋白質(zhì)，在pH值為3時蛋白質(zhì)的回收率最高，為62.42 %。

剩余污泥中的蛋白質(zhì)具有較大的利用潛能，但目前蛋白質(zhì)的提取方法仍存在能耗大、二次污染等問題，許多技術(shù)和應(yīng)用環(huán)節(jié)還不夠成熟，仍需要不斷完善。因此，在剩余污泥蛋白質(zhì)的提取及應(yīng)用上還可開展大量的研究工作。參考文獻(xiàn)：

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（編輯 章潤紅）