麻玉瑩， 邊祥雨， 于藝婧， 楊忍忍， 高蔚娜， 郭長(zhǎng)江

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津，300050)

蓮藕是植物蓮的根莖，是亞洲地區(qū)常見(jiàn)的食藥兩用植物。近年來(lái)，人們對(duì)蓮藕的功能成分進(jìn)行了廣泛的研究，為闡明蓮藕的醫(yī)藥特性以及驗(yàn)證其作為功能性食品的有效性提供了可靠的證據(jù)。據(jù)報(bào)道，蓮藕具有多種藥理作用，如降血糖、護(hù)腎、抗炎、止血作用，此外還具有保肝護(hù)肝、精神藥理和免疫調(diào)節(jié)作用〔1〕。 探索天然抗氧化劑以抵抗氧化應(yīng)激已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)〔2〕。目前關(guān)于蓮藕的抗氧化功能多集中于藕節(jié)部位，關(guān)于蓮藕可食部提取物的抗氧化功能報(bào)道較少。體外抗氧化作用包括自由基清除率、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等，常采用化學(xué)法或建立細(xì)胞模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。本研究以蓮藕可食部提取物為研究材料，測(cè)定蓮藕提取物的總抗氧化力及DPPH、羥自由基清除率；選用C2C12細(xì)胞，以H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化損傷，檢測(cè)細(xì)胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量來(lái)評(píng)價(jià)蓮藕提取物的抗氧化作用，為蓮藕產(chǎn)業(yè)的深加工奠定基礎(chǔ)，為今后抗氧化產(chǎn)品的研發(fā)開(kāi)辟新徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器蓮藕(天津市王頂?shù)滩耸袌?chǎng))；小鼠成肌(C2C12)細(xì)胞(美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清、CCK-8(美國(guó)Invigentech公司)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)；抗壞血酸(阿拉丁試劑有限公司)；MDA、GSH-Px、CAT、SOD測(cè)試盒(南京建成生物工程研究院)；DPPH、羥自由基清除能力、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。 細(xì)胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)；超級(jí)酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio Tek 公司)；旋渦混合器(無(wú)錫杰瑞安儀器設(shè)備有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1蓮藕提取物的制備 將購(gòu)買的新鮮蓮藕洗凈、晾干后去皮，將日常食用部分切成小塊，采用榨汁機(jī)榨汁后，對(duì)新鮮蓮藕汁進(jìn)行真空冷凍干燥，干燥后得到蓮藕粉末狀樣品。按照文獻(xiàn)〔3〕方法進(jìn)行提取。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上后，進(jìn)行傳代。

1.2.3蓮藕提取物清除DPPH、羥自由基作用及總抗氧化能力的檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書，測(cè)定蓮藕提取物對(duì)DPPH、羥自由基清除作用及總抗氧化能力。設(shè)置蘆丁與抗壞血酸(VC)為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.4蓮藕提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 建立氧化損傷模型：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞，接種于96孔板中，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×104個(gè)/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白對(duì)照組與梯度濃度的H2O2處理組(0、100、200、400、600、800、1000 μmol/L)，空白對(duì)照組加入DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，H2O2處理組加入各濃度的H2O2進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1h，通過(guò)酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書計(jì)算細(xì)胞存活率〔4〕，確定H2O2適宜濃度。 CCK-8法檢測(cè)蓮藕提取物對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞，接種于96孔板中，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×104個(gè)/孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后，棄去舊培養(yǎng)基，然后進(jìn)行分組：空白對(duì)照組、H2O2模型組、不同濃度的蓮藕提取物保護(hù)組(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL)。按照上述分組，首先不同濃度的蓮藕提取物要預(yù)先處理12 h，然后加入200 μg/mL H2O2溶液(根據(jù)上文結(jié)果測(cè)得)處理6 h，空白對(duì)照組加入DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，H2O2模型組加入200 μg/mL H2O2溶液進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀測(cè)出各孔OD值，根據(jù)CCK-8試劑盒說(shuō)明書計(jì)算細(xì)胞存活率，確定蓮藕提取物適宜濃度。

1.2.5蓮藕提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的影響 細(xì)胞SOD、CAT、GSH-Px活性與MDA含量測(cè)定：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C2C12細(xì)胞，稀釋細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×104個(gè)/mL，接種于96孔板中，每孔接種2 mL。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行分組：正常對(duì)照組、H2O2模型組、蓮藕提取物組。細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同樣品和H2O2處理后，收集培養(yǎng)液進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。分別用試劑盒提供的方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、GSH-Px 活性和MDA含量。

2 結(jié)果

2.1 蓮藕提取物清除DPPH自由基、羥自由基能力與總抗氧化力如圖1所示，當(dāng)濃度為5mg/ml時(shí)，蓮藕提取物具有較好的清除DPPH、羥自由基的能力與總抗氧化力。

圖1 DPPH自由基、羥自由基清除能力與總抗氧化力LRE：蓮藕提取物；Rutin：蘆丁；VC：抗壞血酸a：DPPH自由基清除率；b：羥自由基清除率；c：總抗氧化力*P<0.05,**P<0.01

2.2 蓮藕提取物對(duì)H2O2作用下C2C12細(xì)胞存活率的影響如圖2所示，H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷隨濃度的增大而增強(qiáng)，一般應(yīng)選擇細(xì)胞存活率在50%～70%范圍內(nèi)，便于試驗(yàn)觀察研究〔5〕。因此，選擇200μmol/L H2O2進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞損傷保護(hù)試驗(yàn)。

圖2 不同濃度H2O2對(duì)C2C12細(xì)胞存活率的影響

如圖3所示，在C2C12細(xì)胞中，不同濃度的蓮藕提取物預(yù)處理24h，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用，且當(dāng)蓮藕提取物濃度為40 mg/mL時(shí)，對(duì)C2C12細(xì)胞的保護(hù)作用基本達(dá)到上限(P<0.01)，當(dāng)蓮藕提取物濃度為100 mg/mL時(shí)，保護(hù)作用反而下降。上述結(jié)果表明，一定濃度的蓮藕提取物能夠減輕H2O2暴露造成的細(xì)胞氧化損傷。

圖3 蓮藕提取物對(duì)H2O2作用下C2C12細(xì)胞存活率的影響*P<0.05,**P<0.01

2.3 蓮藕提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞MDA產(chǎn)生的抑制作用我們選擇保護(hù)作用最為顯著的蓮藕提取物濃度為40 mg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖4所示)，與對(duì)照組細(xì)胞相比，H2O2模型組細(xì)胞MDA含量明顯增加(P<0.01)；與H2O2模型組細(xì)胞相比，蓮藕提取物處理組可以明顯減少H2O2暴露導(dǎo)致的C2C12細(xì)胞的MDA產(chǎn)生(P<0.01)。

2.4 蓮藕提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞抗氧化酶系(SOD、CAT、GSH-Px)活性的影響SOD、CAT和GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶。我們選擇保護(hù)作用最為顯著的蓮藕提取物濃度為40mg/mL對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果表明(如圖5所示)，與對(duì)照組相比，H2O2暴露可以顯著降低C2C12細(xì)胞SOD、GSH-Px與CAT活性(P<0.05)；蓮藕提取物處理后可以顯著增加SOD、GSH-Px與CAT活性，與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。以上結(jié)果提示蓮藕提取物可以通過(guò)保護(hù)抗氧化酶活性來(lái)減輕H2O2所致的氧化應(yīng)激損傷。

圖 4 蓮藕提取物對(duì)H2O2引起的C2C12細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物 MDA的影響figure_titleControl：空白對(duì)照組；Model：H2O2模型組；LRE：蓮藕提取物組**P<0.01

圖5 蓮藕提取物對(duì)H2O2引起的C2C12細(xì)胞抗氧化酶活性的影響Control：空白對(duì)照組；Model：H2O2模型組；LRE：蓮藕提取物組**P<0.01

以上結(jié)果表明，蓮藕提取物能抑制H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞氧化損傷，對(duì)H2O2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，能夠提高細(xì)胞SOD、CAT和GSH-Px活性，降低MDA含量，表明蓮藕提取物對(duì)C2C12細(xì)胞有明顯的抗氧化作用。

3 討論

氧化應(yīng)激是指自由基產(chǎn)生與抗氧化防御之間的不平衡，與許多慢性退行性疾病有關(guān)。目前，水果、蔬菜及其抗氧化劑提高人體內(nèi)抗氧化水平的研究已引起廣泛關(guān)注，其抗氧化活性的產(chǎn)生可歸因于多種機(jī)制。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的酶生物標(biāo)志物和終產(chǎn)物，細(xì)胞膜釋放的MDA能與蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生反應(yīng)，引起交聯(lián)聚合，使蛋白質(zhì)無(wú)法正常合成，MDA還能引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的異常，從而導(dǎo)致機(jī)體生理狀態(tài)的異常，故MDA可以間接顯示機(jī)體清除氧化產(chǎn)物能力和抗氧化活性〔6〕。SOD、CAT和GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)主要的抗氧化酶，所有的細(xì)胞都具有天然的抗氧化防御系統(tǒng)來(lái)中和活性氧的影響，其中，SOD、GSH-Px和CAT起核心作用，SOD將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，H2O2的毒性比超氧物小得多，SOD能夠有效清除超氧陰離子自由基，通過(guò)抗氧化應(yīng)激來(lái)緩解疲勞，是最重要的自由基清除劑之一，其活性是自由基清除的間接指標(biāo)，對(duì)維持體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要〔7-8〕；GSH-Px使用GSH作為氫供體將H2O2還原為H2O和O2，GSH-Px是細(xì)胞內(nèi)對(duì)抗活性氧的主要酶抗氧化防御物質(zhì)，在減輕細(xì)胞氧化損傷中起著重要作用；CAT將H2O2分解為H2O和O2，以保護(hù)機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境和細(xì)胞的正常功能〔9-11〕。因此，本研究選用C2C12細(xì)胞，以H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化損傷，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力以及SOD、GSH-Px、CAT的活性和MDA的含量，來(lái)評(píng)價(jià)蓮藕提取物的體外抗氧化作用。

本研究結(jié)果顯示，H2O2暴露導(dǎo)致C2C12細(xì)胞存活率降低，各劑量蓮藕提取物預(yù)處理之后，各組細(xì)胞活力明顯高于H2O2模型組，表明蓮藕提取物H2O2誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞具有較好的保護(hù)作用，減輕了H2O2引起的細(xì)胞損傷程度；H2O2暴露后細(xì)胞抗氧化酶SOD 、CAT和GSH-Px 活性顯著降低及細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 明顯增加，加入蓮藕提取物進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞SOD活性增強(qiáng)，SOD是機(jī)體抵抗自由基的主要酶防御系統(tǒng)，SOD活性的增加表明機(jī)體正在進(jìn)行抗氧化，以防止自由基誘導(dǎo)的損傷，減少細(xì)胞損傷；同時(shí)，CAT和GSH-Px活性顯著增強(qiáng)、MDA含量減少，顯示蓮藕提取物對(duì)于C2C12細(xì)胞氧化損傷具有較好的保護(hù)作用，能通過(guò)降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生、提高抗氧化酶活性來(lái)抑制H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷。以上研究結(jié)果將有助于蓮藕作為食源性抗氧化劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，并為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的預(yù)防與治療提供理論依據(jù)。