朱春月 孫志賓 馬愛軍 劉志峰 楊敬昆 趙亭亭

大菱鲆()熱休克蛋白Hsp47相互作用蛋白His-pull down和質譜鑒定*

朱春月1, 2, 3孫志賓2, 3①馬愛軍2, 3①劉志峰2, 3楊敬昆2, 3趙亭亭1, 2, 3

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 2. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業(yè)農村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 山東省海洋漁業(yè)生物技術與遺傳育種重點實驗室 青島市海水魚類種子工程與生物技術重點實驗室 青島 266071; 3. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋生物學與生物技術功能實驗室 青島 266237)

首次克隆了大菱鲆()熱休克蛋白基因。該基因cDNA序列全長為1 927 bp, 其中開放閱讀框長度為1 218 bp, 編碼一條長度為405個氨基酸的多肽鏈。結果表明, 大菱鲆基因在肝臟、皮膚、鰓和腸等4個組織中都有表達, 表達量最高的組織是肝臟, 表達量最低組織是鰓; 25 °C處理6 h后Hsp47在皮膚中的表達量增加150多倍。利用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)表達了Hsp47的his標簽融合蛋白, 然后利用His-pull down技術捕獲了Hsp47的相互作用蛋白質, 通過質譜分析鑒定出31種候選蛋白, 其中大部分蛋白為參與翻譯后修飾, 蛋白轉換及分子伴侶; 此外還包括參與脂轉運與代謝、能量產生與轉換、細胞骨架、防御機制等過程的蛋白質。從31種候選蛋白中進一步篩選出3種分值較高的蛋白: 未知蛋白(uncharacterized protein, A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B (Fetuin B, A0A2U9C388)和膠原結合蛋白(collagen-binding protein, A0A2U9B608), 可為后續(xù)的研究提供方向。

大菱鲆();Hsp47; 蛋白相互作用; His-pull down

熱休克蛋白(heat shock protein, Hsp)是有機體受到高溫脅迫后大量合成的一類蛋白, 普遍存在于各類生物中(Feder, 1999)。熱休克蛋白主要功能是分子伴侶, 具有多種功能, 能夠輔助新合成肽鏈正確折疊、消除變性或者錯誤折疊的肽鏈, 避免應激狀態(tài)下蛋白質的變性, 減少因疏水基團暴露而導致的蛋白質聚集等(田倪妮, 2014)。根據(jù)相對分子量、氨基酸序列特征以及功能可以劃分為如下幾類: Hsp110、Hsp90、Hsp70、Hsp60和小分子量HSP (Hsp47, Hsp27, Hsp22等)等(陳鵬宇等, 2020)。

Hsp47屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine proteinase inhibitor, Serpin)家族進化枝H (Serpin H), 具有絲氨酸蛋白酶抑制劑折疊和抑制劑環(huán), 但不具備抑制活性(Hirayoshi, 1991)。Hsp47是一種內質網(wǎng)(ER)駐留的分子伴侶, 與其他分子伴侶(如Hsp60, Hsp70和Hsp90)具有廣泛的底物特異性(Niwa, 2012)不同, 通常認為Hsp47特異識別前膠原蛋白, 對于膠原蛋白分子的成熟是必不可少的。已有研究表明, Hsp47在膠原蛋白合成途徑中起兩種作用: 抑制原膠原的局部展開, 以及抑制三螺旋形成后的原膠原聚集(高輝等, 2020)。因此Hsp47在膠原蛋白的生物合成、結構裝配以及分泌中發(fā)揮著重要作用。最近的研究表明, Hsp47還可以與多種蛋白相互作用, 如: 核心蛋白聚糖(decorin)、纖維調節(jié)素(fibromodulin)和光蛋白聚糖(lumican)等, 進而促進這些蛋白的分泌(Ishikawa, 2018), 以及與KDEL內質網(wǎng)蛋白駐留受體2(KDELR2)相互作用(van Dijk, 2020)。

Hsp47在魚類中的研究相對較少, 已有研究發(fā)現(xiàn)Hsp47可能在斑馬魚(Lele, 1997a; Murtha, 2003)、青鳉(Hirayama, 2006)、大西洋鱈(Hori, 2010)、硬頭鱒(Narum, 2013)、虹鱒(Wang, 2016)、鯡形白鮭(Stefanovic, 2016)、斑尾小鲃(Mahanty, 2017)、三刺魚(Li, 2018)等魚的高溫應激或熱適應中發(fā)揮重要作用。這些研究都集中在Hsp47基因在不同魚類脅迫后的表達模式分析檢測上, 而更進一步的功能研究未見報道, 并且迄今未見對大菱鲆Hsp47的研究報道。大菱鲆()是我國北方沿海重要的經(jīng)濟魚類, 由于是冷溫性魚類, 其養(yǎng)殖業(yè)的進一步發(fā)展受到養(yǎng)殖環(huán)境溫度的嚴重影響。為減少不利環(huán)境因素對大菱鲆養(yǎng)殖產業(yè)的影響, 科研工作者開展了一些基礎生理性研究、分子標記輔助育種等研究, 其目的是提高大菱鲆的優(yōu)良種質, 解決生產實際問題(Yang, 2020; 高進等, 2021)。本文克隆了大菱鲆基因cDNA全長, 檢測了基因在大菱鲆肝臟、皮膚、腸和鰓等組織中mRNA的表達水平以及在皮膚中溫度脅迫前后的誘導表達情況, 獲得了該基因的體外原核重組表達蛋白, 利用His-pull down技術, 篩查與Hsp47具有相互作用的蛋白, 有助于進一步了解溫度脅迫下Hsp47在魚體中發(fā)揮作用的機制, 為大菱鲆溫度脅迫應答機制提供新的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

實驗選用平均體重為(100.0±12.3) g的大菱鲆幼魚, 飼養(yǎng)于煙臺開發(fā)區(qū)天源水產有限公司室內養(yǎng)殖水泥池。實驗用魚先在水溫(14.0±0.5) °C的實驗水池內馴化暫養(yǎng)一周。馴化暫養(yǎng)和實驗期間每天上午9:00投喂一次餌料, 每天上午10:00換水1次, 靜水養(yǎng)殖通氣供氧。

1.2 試驗方法

1.2.1 溫度脅迫實驗 隨機挑選經(jīng)過1周馴化的大菱鲆幼魚, 將其分為2組: 對照組(14 °C)和實驗組(25 °C)。升溫方法參考Ndong等(2007), 略有修改: 首先按照每6 h提升1 °C的速度將水溫逐步從14 °C升至20 °C, 接著按每12 h提升1 °C的速度將水溫從20 °C提升至25 °C為實驗組。對照組和實驗組分別設制3個平行, 每個平行組均隨機投放15尾幼魚。在25 °C溫度脅迫6 h后, 在每個平行隨機選取3尾幼魚, 放置于下方為冰塊的預冷解剖盤中迅速解剖, 取皮膚、肝臟、鰓、腸道等組織凍存于液氮中, 用于后續(xù)mRNA的提取。

1.2.2 總RNA的提取及cDNA的合成 提取方法參照天根生化科技(北京)有限公司動物組織總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Tissue Kit)說明書, 提取完成后利用Thermo NanoDrop 2000微量紫外分光光度計檢測RNA的含量和純度, 再用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整度。使用北京全式金生物技術(TransGen Biotech)有限公司反轉錄試劑盒(TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)合成cDNA, 存放于–20 °C冰箱保存。將提取的肝臟總RNA, 按照寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司RACE試劑盒(SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit)說明書分別合成用于3′和5′末端PCR擴增的RACE模板, –20 °C冰箱保存。

1.2.3 大菱鲆基因cDNA全長克隆 根據(jù)本實驗室已有的基因部分序列, 利用Primer Premier5.0軟件在保守區(qū)域設計引物Hsp47-F與Hsp47-R (表1), 擴增大菱鲆基因的開放閱讀框(ORF)序列。測序驗證后, 再依據(jù)獲得的ORF序列設計3′RACE和5′RACE引物(表1), 擴增得到3′和5′片段后, 再進行測序驗證, 最終獲得基因cDNA全長序列。

1.2.4基因的序列的生物信息學分析 分別利用軟件ORF Finder、EditSeq、ExPASy (compute_pi)、SignalP、SOPMA、SWISS-MODEL等進行開放閱讀框、氨基酸序列、分子量、信號肽、等電點以及二/三級結構等生物信息學分析預測(唐啟政等, 2019); 利用軟件DNAMAN進行序列同源性比對分析, 從GenBank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi)中獲取其他魚類基因編碼的氨基酸序列, 利用MAGE 7.0軟件構建該其NJ系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR 根據(jù)基因cDNA全長設計引物Hsp47-RTF和Hsp47-RTR (表1), 以β-actin基因為內參, 利用ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀檢測大菱鲆基因的表達量。反應程序為: 94 °C 30 s; 94 °C 5 s, 60 °C 30 s, 40個循環(huán); 95 °C 15 s, 60 °C 1 min, 95 °C 15 s。利用2–ΔΔCt法計算基因的相對表達量, 依據(jù)軟件SPSS 19進行數(shù)據(jù)差異顯著性統(tǒng)計分析。

表1 引物名稱及序列

Tab.1 The primer name and the sequence

1.2.6基因成熟肽原核表達載體構建及表達菌株轉化 綜合分析成熟肽編碼區(qū)和pET-28a載體中的限制性內切酶位點, 分別設計帶有H I和d III酶切位點序列的表達引物MPF和MPR (表1), 以1.3.3中提取的質粒作為模板進行PCR擴增, 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后, 切取目的條帶用試劑盒回收。將目的條帶與H I和d III雙酶切后純化的pET-28a載體相連接, 將連接產物轉化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細胞, 在含終濃度為100 μg/mL的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)并挑選單克隆菌斑, 經(jīng)PCR檢測后, 將符合條件的菌液送公司測序。將測序結果正確的菌落擴大培養(yǎng), 提取質粒保存于–20 °C備用, 命名為pET-28a-Hsp47。取1 μL pET-28a-Hsp47重組質粒轉化到50 μL剛解凍的大腸桿菌transettea (DE3)感受態(tài)細胞中, 涂布在含終濃度為100 μg/mL的卡那霉素LB固體培養(yǎng)基平板上, 將平板以石蠟膜封口后倒置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng), 挑取單菌落并進行PCR驗證, 保存陽性克隆菌株。

1.2.7Hsp47重組蛋白誘導表達、純化及復性 將目的菌液接種于含終濃度為100 μg/mL的卡那霉素LB液體培養(yǎng)基中, 接種比例按體積分數(shù)為1︰100, 37 °C 200 r/min震蕩培養(yǎng)至菌液的OD600約為0.6時, 加入終濃度為0.5 mm IPTG, 37 °C 200 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。隨后在室溫條件下, 將菌液以5 000 r/min離心10 min, 棄掉上清, 收集菌體。加入30 mL預冷的裂解液重懸菌體, 利用超聲破碎儀裂解菌體。將超聲破碎后的菌體在4 °C條件下12 000 r/min離心30 min, 分別收集上清和沉淀, 沉淀即為包涵體。沉淀通過幾次重復的洗滌、離心過程進一步進行純化。將洗滌后的包涵體沉淀溶解于20mL溶解液中, 再轉移到至50 mL小燒杯中, 放置于4 °C條件下磁力攪拌器攪拌過夜, 使包涵體充分溶解。隨后在4 °C下12 000 r/min離心20 min, 去掉沉淀, 收集上清并用0.22 μm孔徑的濾膜去除細菌和雜質。得到的包涵體加入裝有鎳離子螯合親和層析樹脂填料的柱殼中, 反復上樣四次后, 將柱殼堵口于4 °C靜置30 min, 使目的蛋白和填料充分結合。然后分別用30 mL預冷的20、30、50 mmol/L的咪唑溶液清洗雜蛋白, 最后用10 mL預冷的250 mmol/L咪唑溶液進行目的蛋白洗脫, 收集流出溶液獲得目的蛋白。SDS-PAGE檢測洗脫情況。將收集的目的蛋白液體加到預先處理好的透析袋中, 透析袋用透析夾加緊兩端。透析袋放入提前預冷的透析液I中, 在4 °C條件下用磁力攪拌器攪拌, 透析12 h。按照相同的方法, 每隔12 h更換一次透析液, 直至完成透析液VII中的透析。為避免其他透析液成分的殘留, 可以適當延長目的蛋白在透析液VII中的透析時間。透析結束后, 收集透析袋中的液體, 于4 °C條件下12 000 r/min離心20 min, 收集上清, 上清即為復性后的大菱鲆Hsp47蛋白, 隨后采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.8 大菱鲆魚體總蛋白提取 將100 mg大菱鲆組織剪切成小塊, 盡量去除脂肪組織和結締組織等非目的組織, 加入適量的預冷的1×PBS, 在4 °C條件下3 000 r/min離心3 min, 棄掉上清, 重復洗滌組織塊兩次。將洗滌后的組織加入1 mL預冷的抽提試劑, 轉移至玻璃勻漿器中在冰上均質30—50次直至組織完全成勻質狀液體無明顯組織小塊。放置在渦旋振蕩器上最大速度渦旋10 s, 然后在冰上放置20 min, 期間取出振蕩3—5次, 隨后于4 °C條件下12 000 r/min離心10 min去除組織或細胞碎片, 收集上清, 上清即為大菱鲆組織活性總蛋白, 分裝并保存于–80 °C, 用于后續(xù)實驗。

1.2.9 His-pull down實驗及質譜鑒定 先將1 mgHsp47重組蛋白加入鎳柱中4 °C堵口靜置30 min, 收集上樣后溶液, 再將1 mg魚體總蛋白加入鎳柱中, 4 °C堵口孵育30 min, 孵育完成后進行純化。魚體總蛋白作空白對照, 其他條件均相同。取樣后進行SDS-PAGE檢測, 對比差異性條帶。將差異條帶切下來送北京諾禾致源科技股份有限公司進行基于Thermo Q Exactive質譜儀的液相色譜-串聯(lián)質譜法鑒定樣品中的肽段, 進而鑒定蛋白種類。

2 結果

2.1 大菱鲆SmHsp47基因的cDNA克隆及序列分析

大菱鲆基因, GenBank登錄號: MW115941。其cDNA序列全長為1 927 bp, 包含一個1 218 bp開放閱讀框, 5′端非編碼區(qū)核苷酸長度143 bp, 3′端非編碼區(qū)長度566 bp (圖1)。基因ORF可編碼一個長度為405個氨基酸殘基的肽段, 其預測分子質量為43.50 kDa, 理論等電點為8.72, 氨基端有信號肽序列長度為18個氨基酸, 羧基端帶有內質網(wǎng)靶向序列(RDEL)。

注: 起始密碼子ATG和終止密碼子TAA均用粗下劃線標出, 信號肽與反應中心環(huán)(RCL)分別用青色和深青色陰影標出

2.2 大菱鲆SmHsp47蛋白的生物信息學分析

經(jīng)SOPMA在線軟件預測顯示,Hsp47含有三種二級結構, 其中α螺旋(alpha helix)占44.44%, β折疊(extended strand)占17.28%, 無規(guī)則卷曲(random coil)占38.27%。如圖2所示, 藍線表示α螺旋, 紅線表示β折疊, 紫線表示無規(guī)則卷曲。

利用SWISS-MODEL分析軟件根據(jù)同源蛋白建模的方法構建蛋白質三維結構, 推測出大菱鲆Hsp47蛋白的高級結構, 如圖3所示。

利用DNAMAN軟件進行Hsp47與其他魚類同源基因蛋白的多序列比對, 其結果顯示: 大菱鲆與狹鱗庸鰈和赤鋸鱗魚的Hsp47最為相似, 相似度分別為89.54%、85.43%; 與半滑舌鰨Hsp47相似度最低為76.73%。利用MEGA7.0以鄰接法(Neighbor-Joining)構建大菱鲆Hsp47蛋白的系統(tǒng)進化樹, 結果顯示, 大菱鲆Hsp47與狹鱗庸鰈和赤鋸鱗魚Hsp47親緣關系最為接近(圖4)。

圖2 SmHsp47蛋白質的二級結構預測

圖3 SmHsp47蛋白質的三級結構預測

2.3 大菱鲆SmHsp47基因的組織特異表達及溫度脅迫誘導表達分析

利用熒光實時定量PCR技術檢測大菱鲆基因分別在肝臟、皮膚、腸和鰓等4個組織中的表達情況(圖5), 結果顯示,基因在上述4種組織中均有表達, 并且不同組織中的表達水平存在顯著差異。其在肝臟中表達水平最高(<0.05), 皮膚次之, 鰓和腸中較低。水溫25 °C處理組在處理后6 h時在皮膚中的表達顯著上調(圖6), 為對照組(14 °C)的164.23±70.19倍(<0.05)。

2.4 大菱鲆SmHsp47蛋白的表達、純化

以轉化原核表達載體pET-28a空載的大腸桿菌細胞蛋白作為空白對照, 以轉化有pET-28a-Hsp47載體的大腸桿菌在ITPG誘導前的細胞蛋白作為陰性對照, 泳道4為細胞破碎液上清樣, 泳道5為細胞破碎液沉淀樣, 可以看出Hsp47蛋白主要以包涵體形式存在, 并且分子量大小符合預期值(圖7)。隨后對Hsp47蛋白包涵體用鎳離子樹脂進行純化, 反復上樣后, 利用咪唑濃度梯度洗脫, 洗脫濃度分別為20、30、50、250 mmol/L (圖8)。由結果可以看出20 mmol/L咪唑可以洗脫下來雜質蛋白和極少量目的蛋白, 含250 mmol/L咪唑的緩沖液可以洗脫下來大量的目的蛋白, 并且條帶蛋白單一, 可以得到比較純的蛋白, 顯示出很好的洗脫效果。利用酶標儀和BCA蛋白定量試劑盒測得純化后的蛋白質量濃度為0.38 mg/mL。

圖4 使用NJ構建的Hsp47的進化樹

注:: 尼羅羅非魚;: 奧尼羅非魚;: 斑馬擬麗魚;: 尼加拉瓜湖始麗魚;: 大刺鰍;: 條紋鱸;: 貝氏隆頭魚;: 黃鱔;: 大菱鲆;; 狹鱗庸鰈;: 赤鋸鱗魚;: 半滑舌鰨;: 細紋鳳鳚;: 海洋青鳉魚;: 眼斑雙鋸魚

圖5 大菱鲆SmHsp47基因在不同組織中的表達情況

圖6 大菱鲆SmHsp47基因在皮膚組織中25 °C脅迫6 h后的表達變化情況

圖7 SmHsp47蛋白表達SDS-PAGE結果

注: M. 蛋白Marker; 1. 全菌蛋白(pET-28a, 未誘導); 2. 全菌蛋白(pET-28a-Hsp47, 未誘導); 3. 全菌蛋白(pET-28a-Hsp47, 誘導); 4. 細胞破碎液上清(pET-28a-Hsp47, 誘導); 5. 細胞破碎液沉淀(pET-28a-Hsp47, 誘導); 黑色箭頭指示位置為Hsp47融合蛋白目的條帶

2.5 大菱鲆SmHsp47相互作用蛋白的His-pull down

利用酶標儀和BCA蛋白定量試劑盒測得提取的大菱鲆魚體總蛋白質量濃度為3 mg/mL。取1 mgHsp47重組蛋白和1 mg魚體總蛋白混合孵育, 獲得his-Hsp47-魚體總蛋白相互作用復合體, 以魚體總蛋白作為空白對照。用250 mmol/L的咪唑洗脫出的未加魚體蛋白的Hsp47重組蛋白作為陰性對照, 用250 mmol/L的咪唑洗脫液將捕獲到的含有his標簽的蛋白復合體洗脫下來, 并進行SDS-PAGE分離, 結果如圖9所示。通過比較泳道2與泳道3, 發(fā)現(xiàn)泳道3中多出1條比較明顯的條帶, 此條帶中所含蛋白則很可能與Hsp47具有相互作用。

圖8 SmHsp47蛋白咪唑梯度洗脫SDS-PAGE結果

注: M. 蛋白Marker; 1. 上樣流穿溶液; 2. 20 mmol/L咪唑洗脫液; 3. 30 mmol/L咪唑洗脫液; 4. 50 mmol/L咪唑洗脫液; 5. 250 mmol/L咪唑洗脫液; 黑色箭頭指示位置為SmHsp47融合蛋白目的條帶

圖9 His-pull down實驗SDS-PAGE結果

注: M. 蛋白maker; 1. 魚體總蛋白; 2.Hsp47重組蛋白; 3. His-pull down孵育后蛋白; 黑色箭頭指示位置為獲得的Hsp47可能的相互作用蛋白條帶

2.6 大菱鲆SmHsp47相互作用蛋白的鑒定

將2.5中獲得的差異蛋白條帶切下后, 經(jīng)質譜分析后共鑒定得到31種候選蛋白, 具體信息如表2所示。通過搜索COG數(shù)據(jù)庫對鑒定到的肽段進行功能注釋, 用于了解不同蛋白質的功能特性。從COG注釋結果(圖10)可以看出, 大部分蛋白為參與翻譯后修飾, 蛋白轉換, 分子伴侶, 此外, 還包括參與能量產生與轉換、脂質轉運與代謝、防御機制、一般功能預測等過程的蛋白質。

表2 大菱鲆Hsp47相互作用候選蛋白鑒定結果

Tab.2 Identification of interactive candidate proteins with SmHsp47

續(xù)表

注: 分值是對蛋白匹配度的打分, 是肽段分數(shù)的加和, 分數(shù)越高可信度越高

圖10 COG數(shù)據(jù)庫注釋結果

注: 橫坐標為注釋的功能分類, 縱坐標為注釋到相應功能的蛋白數(shù)目

然后根據(jù)蛋白的預測分子量(MW)、鑒定到的肽段數(shù)量(Peptides)、特有肽段數(shù)量(Unique Peptides)以及得分值(Score)等參數(shù)對質譜鑒定結果進行了嚴格篩選, 結果見表3。

表3 大菱鲆Hsp47相互作用蛋白鑒定結果再篩選

Tab.3 The re-screened result of proteins interacted with SmHsp47

注: 分值是對蛋白匹配度的打分, 是肽段分數(shù)的加和, 分數(shù)越高可信度越高

3 討論

本研究中, 基因在大菱鲆的肝臟、皮膚、腸和鰓等4種組織中都有表達, 養(yǎng)殖水溫14 °C時在肝臟中的表達量最高, 25 °C處理6 h后皮膚中的表達量較14 °C急劇升高150多倍, 而肝臟中的變化幅度很小(未展示)。魚類的肝臟在魚體中發(fā)揮著不可替代的解毒等代謝功能, 還是具有重要吞噬功能的免疫器官, 并且?guī)缀跛械哪蜃佣加筛闻K制造, 因此健康魚類的肝臟一直保持著旺盛的自我修復能力。有研究表明Hsp70在多種魚類的肝臟中發(fā)揮重要的作用, 且表達水平明顯受外界脅迫誘導而升高(Forsyth, 1997; Eddie, 2004)。本研究中Hsp47在正常條件下的肝臟組織中有極高的表達水平, 表明在大菱鲆中Hsp47也可能與其他熱激蛋白一樣參與肝臟的各項重要機能, 以發(fā)揮其對肝臟的保護作用。目前Hsp47在魚類皮膚中的作用還沒有研究, 已有研究發(fā)現(xiàn)Hsp47在斑馬魚胚胎發(fā)育期參與熱激應答反應, 并且還有組織部位特異性(Pearson, 1996; Krone, 1997; Lele, 1997a, 1997b), 也參與成熟斑馬魚的熱應答反應, 同樣具有組織特異性(Murtha, 2003)。研究還發(fā)現(xiàn)基因在虹鱒(Wang, 2016)及其性腺細胞系(Ojima, 2005)、青鳉(Hirayama, 2006)、大西洋鱈(Hori, 2010)、硬頭鱒(Narum, 2013)、鯡形白鮭(Stefanovic, 2016)、斑尾小鲃(Mahanty, 2017)、三刺魚(Li, 2018)等魚的高溫應激或者不同地理群體的熱適應中發(fā)揮重要作用。因此可以推斷, 大菱鲆Hsp47在高溫脅迫后的皮膚組織中高表達, 是其高溫誘導表達的組織特異性的一種表現(xiàn), 這種時空特異的誘導表達對魚體的高溫應激具有重要意義。

本研究中構建了大菱鲆基因成熟肽不包含羧基端內質網(wǎng)靶向序列片段的重組表達載體, 嘗試了多個溫度、搖床轉速、IPTG誘導濃度和時間等誘導條件(未展示), 始終得到的都是包涵體蛋白, 并且在本報道中提及的誘導條件下能夠大量地表達重組蛋白。因該基因的體外原核重組蛋白的表達未見研究報道, 猜測可能是由于人工誘導條件下蛋白快速合成, 蛋白本身又含有強疏水氨基酸殘基, 例如第368位的亮氨酸、第370位的酪氨酸(圖1), 使得重組蛋白在原核表達系統(tǒng)中不能正確折疊而形成包涵體。

膠原蛋白是哺乳動物中最豐富的蛋白質, 約占人體所有蛋白質的三分之一。迄今為止, 已經(jīng)鑒定出29種膠原蛋白(S?derh?ll, 2007)。Hsp47瞬時結合到ER中的膠原蛋白上, 以pH依賴的方式在順式高爾基體或ER-高爾基體中隔室(ERGIC)中解離, 然后通過其RDEL保留序列運回ER(Satoh, 1996)。Hsp47可以識別三螺旋原膠原蛋白上的Gly-Xaa-Arg重復序列(Koide, 2002, 2006), 可以防止原膠原蛋白的局部展開和/或聚集(Thomson, 2000)。小鼠的基因破壞由于基底膜受損和膠原原纖維形成而導致胚胎致死率。在基因敲除細胞中, I型膠原三螺旋結構異常形成, 可導致纖細。I型膠原蛋白的分泌緩慢且合理, 可在敲除的成纖維細胞的ER中產生前膠原蛋白的聚集體, 這些聚集體最終會被自噬降解。中的突變與成骨不全癥有因果關系(Sillence, 1979; Thomson, 2005; Dr?gemüller, 2009)。Hsp47的表達與多種類型的細胞和組織中的膠原蛋白表達密切相關。因此, Hsp47代表了治療膠原蛋白相關疾病(包括肝、肺和其他器官纖維化)的有希望的靶標。關于Hsp47與膠原蛋白關系的研究多應用于哺乳動物, 對于魚體兩者之間的作用于關系還知之甚少, 僅有的研究表明Hsp47在斑馬魚鰭條再生過程中的骨骼生長和模式化中必不可少(Bhadra, 2015), 而在魚類熱應激中Hsp47與膠原蛋白相互作用的生理學意義需要進行更深一步的探討。

胎球蛋白(fetuin)分為胎球蛋白-A (Fetuin-A) (基因符號: AHSG/FETUA)和胎球蛋白-B (Fetuin-B) (FETUB), 以及富含組氨酸的糖蛋白(HRG)和激肽原(KNG), 是胱抑素(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)超家族的3型家族成員蛋白質(Lee, 2009; Jahnen-Dechent, 2011)。3型家族成員均為分泌型和二硫鍵結合型的多結構域糖蛋白, 具有多個半胱氨酸蛋白酶抑制劑結構域(Abrahamson, 1994)。胎球蛋白-A最早分離于1944年, 因其在牛胎血中含量最高而被命名為“胎球蛋白”(Pedersen, 1944)。在2000年發(fā)現(xiàn)了第二種胎球蛋白, 稱為胎球蛋白-B。至此, 將原來的“胎球蛋白”被重命名為胎球蛋白-A (Olivier, 2000)。Fetuin-B蛋白大小大約50—60 kDa, 主要在肝臟中表達(Olivier, 2000; Denecke, 2003), 并分泌到血液中, 從而到達所有軟組織。最近的研究表明Fetuin-B在皮膚鱗狀細胞癌細胞中的過度表達導致裸鼠體內腫瘤生長受到抑制(Hsu, 2004), 而且Fetuin-B缺陷小鼠表現(xiàn)出自發(fā)性腫瘤發(fā)生的趨勢增加(Dietzel, 2013), 有研究指出, 人體中的Fetuin-B對于受精是必不可少的(Jahnen-Dechent, 1997; Dietzel, 2013), 并且參與糖脂代謝過程。從本研究結果來看, Fetuin-B與Hsp47之間也可能存在相互作用關系, 提示Fetuin-B可能參與魚體高溫脅迫某些代謝過程, 后續(xù)可再進一步展開深入研究探討。

4 結論

本研究首次克隆了大菱鲆基因cDNA全長, 研究發(fā)現(xiàn)14 °C時其在大菱鲆肝臟組織中具有較高的表達量, 而在25 °C處理6 h后其在皮膚中的表達量升高了150多倍; 然后構建了大菱鲆基因的原核表達載體, 獲得了去掉信號肽和內質網(wǎng)靶向序列的重組蛋白, 重組蛋白主要以包涵體形式表達; 又通過His-pull down實驗獲得了Hsp47可能的相互作用蛋白, 最后通過質譜分析得到31種可能與Hsp47蛋白發(fā)生互作的蛋白。通過嚴格篩選得到3種最有可能的相互作用蛋白, 分別為: 未知蛋白(uncharacterized protein, A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B (Fetuin B, A0A2U9C388)和膠原結合蛋白(collagen-binding protein, A0A2U9B608)。本研究為Hsp47在魚體中的作用研究提供了新的參考, 也為大菱鲆高溫脅迫應答機制提供了新的理論基礎和研究方向。

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IDENTIFICATION OF PROTEINS INTERACTION WITHHEAT SHOCK PROTEINHsp47 by His-PULL DOWN COMBINED WITH MASS SPECTROMETRY

ZHU Chun-Yue1, 2, 3, SUN Zhi-Bin2, 3, MA Ai-Jun2, 3, LIU Zhi-Feng2, 3, YANG Jing-Kun2, 3, ZHAO Ting-Ting1, 2, 3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Shandong Key Laboratory of Marine Fisheries Biotechnology and Genetic Breeding; Qingdao Key Laboratory for Marine Fish Breeding and Biotechnology, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

We cloned theHsp47 gene of turbotusing the RACE technique. The cDNA sequence ofHsp47 is 1 927 bp in length and includes a 1 218 bp open reading frame encoding a 405 amino acid. The results show that SmHsp47 gene was expressed in liver, skin, intestines, and gills, with the highest expression in liver and the lowest in gill. The relative expression ofHsp47 was increased by 150 times in 25 °C treatment group for 6 h. Using prokaryotic expression technology, the His tag fusion protein ofHsp47 was expressed. The interactive proteins ofHsp47 were captured in the His-pull down technology. By LC-MS/MS analysis, 31 candidate proteins were identified and most of them were involved in the modification after translation, protein conversion, and molecular partner, and also energy production and conversion, lipid transport and metabolism, carbohydrate transport and metabolism, defense mechanism, and cytoskeleton proteins. Three high-scored proteins were screened, i.e., uncharacterized protein (A0A6A4TFV0), Fetuin B (A0A2U9C388), and collagen-binding protein (A0A2U9B608), providing a reference for future studies in this regard.

;Hsp47; protein interaction; His-pull down technology

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馬愛軍, 博士, 研究員, 博士生導師, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn; 孫志賓, E-mail: sunzb@ysfri.ac.cn

2020-12-12,

2021-02-19

Q955; Q789; S965

10.11693/hyhz20201200331