趙改名,李珊珊,崔文明,祝超智*,王晗,銀峰,焦陽陽,李佳麒,韓明山

1(河南農業(yè)大學 食品科學技術學院,河南 鄭州,450002)2(通遼綜合實驗站,內蒙古 通遼,028000)

臘肉主要是以畜肉為原料,經過腌制、烘干(風干)等加工工藝制成的肉制品,從廣義上講也屬于低酸發(fā)酵肉制品(pH≥5.5)[1],具有風味濃郁、耐貯藏、方便食用等特點,深受消費者喜愛。但目前臘肉生產過程中仍面臨一些問題:生產工藝落后、周期長、成本較高；自然發(fā)酵過程中易受雜菌的污染,從而導致產品的質量不穩(wěn)定且不可控[2-3]。因此,使臘肉加工實現工業(yè)化已成為必然趨勢。近幾年,企業(yè)采用快速腌制和高溫烘烤的工藝,大幅度縮短了生產周期、并使衛(wèi)生狀況得以改善,但因成熟期較短,且采用高溫烘干的方式,加速了脂肪的氧化,并缺失了微生物發(fā)酵對產品風味的貢獻,致使最終產品與傳統(tǒng)工藝生產的臘肉相比,仍存在一定的差距[4]。

傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉通常會有來自原料以及生產環(huán)境中存在的微生物,而細菌是參與發(fā)酵的主要微生物,因此,了解臘肉中細菌微生物群落結構組成是調控和提升產品品質的關鍵。目前關于臘肉中微生物的報道較多,但多數研究對以傳統(tǒng)培養(yǎng)法為基礎的微生物學手段進行分析,該方法的缺陷是不能全面、準確地反映樣品的微生物信息[5]。高通量測序技術是目前研究微生物多樣性中應用最廣泛的測序技術,不僅能夠快速地分析復雜微生物群落多樣性,還能檢測到低存在率以及不可培養(yǎng)的微生物[6],目前該技術已經被廣泛應用于酸奶[7]、泡菜[8]、白酒[9]、醋[10]等生物群落結構研究。

本研究以來源于湖北、云南、重慶、貴州、河南的傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉為研究對象,采用 Illumina MiSeq高通量測序平臺對細菌的16S rDNA V3-V4區(qū)進行測序,更全面地呈現臘肉的細菌群落結構和多樣性；同時結合電子鼻分析,探究細菌群落結構與臘肉風味品質的關系,以期為傳統(tǒng)臘肉的生產研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2019年3月在湖北(HB)、云南(YN)、重慶(CQ)、貴州(GZ)、河南(HN)5個地區(qū)分別購買當地農家自制臘肉,樣品均為2019年1月左右制作,使用采樣袋在常溫下運回實驗室,保存在-40 ℃?zhèn)溆?采用信息見表1。

表1 采樣信息

DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒,北京天根生物科技有限公司；Taq酶、引物等,上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD無菌操作臺,美國Airtech公司；TGradient梯度PCR儀,德國Biometra公司；EC3-310凝膠成像系統(tǒng),美國UVP公司；DYY-12電泳儀,北京市六一儀器廠；DHP—9272低溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；Easy MIX拍擊式均質儀,梅里埃診斷產品(上海)有限公司；PEN3電子鼻,德國AIR-SENSE公司。

1.3 儀器與設備

1.3.1 樣品處理

在無菌條件下,將樣品剪碎,混勻后稱取25 g樣品裝入無菌的均質袋中,加入 225 g 無菌生理鹽水,拍擊式均質器拍打2 min提取細菌,均質液采用4層無菌紗布過濾,收集濾液,濾液裝入無菌的離心管中,在4 ℃、2 000 r/min下離心5 min,取離心后的上清液放入另外的無菌離心管中,在4 ℃、9 500 r/min下離心10 min,棄去上清液,即為菌體沉淀。每個樣品做3次平行處理。

1.3.2 DNA提取和PCR擴增

按照細菌DNA 試劑盒使用說明書提取細菌DNA。用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物對V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增；擴增程序：95 ℃預變性3 min,27個循環(huán)(95 ℃ 變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),最后72 ℃延伸10 min。擴增體系:20 μL,4 μL 5×FastPfu緩沖液,2 μL 2.5 mmol/L dNTPs,0.8 μL引物(5 μmol/L),0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.3.3 文庫構建和上機測序

使用2%瓊脂糖凝膠對PCR產物進行回收,利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進行純化,Tris-HCl進行洗脫,2%瓊脂糖進行電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST微型熒光劑檢測定量。根據 Illumina MiSeq平臺標準操作規(guī)程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.4 電子鼻測定

參考文獻[11]和[12]的方法,略有改動。將臘肉絞碎,稱取15 g肉樣放入250 mL的錐形瓶中,用3層保鮮膜密封,40 ℃恒溫水浴鍋中加熱5 min后立即測定。參數設置：頂空進樣,清洗時間60 s,傳感器歸零時間5 s,樣品準備時間5 s,數據采集時間80 s。

1.5 數據處理

每個樣品做3 次重復試驗,實驗數據采用SPSS 16.0 軟件進行數據處理。測序序列使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據97%的相似度對序列進行操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU)聚類；使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用RDPclassifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva數據庫(SSU123)。利用生物云平臺(www.i-sanger.com)、R語言作圖工具等繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等。利用Origin 2017繪制揮發(fā)性物質信號強度和相關性熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同來源臘肉樣品測序深度和OTU分析

采用Illumina MiSeq高通量測序獲得了5個來源臘肉樣品的原始序列數據,15個樣本經Trimmomatic及FLASH軟件優(yōu)化后,共得到了636 675條有效序列。稀釋曲線是根據序列條數和測序深度與其所聚類得到OTU數(97%相似性)進行繪制得到。由圖1-a可知,在樣品量大于30 000時,樣品的稀釋曲線逐漸趨于平坦,說明各樣品測序數量較為充分合理,符合后續(xù)的生物信息學分析要求。OTU數可以反映樣品中細菌的豐度,對樣品進行OTU聚類分析,共獲得的OTU數量為258個,涵蓋了7門、10綱、33目、56科、83屬。不同來源樣品中OTU數目存在差異,其中HB樣品中包含的OTU數目最多(238個),特有的OTU數目也最多(165個),說明所含有的細菌種類及特有的細菌種類均最多；CQ和YN樣品的OTU數較為接近,分別為62和57,特有的OTU數目分別為5和4；GZ樣品中包含的OTU數目最少(28個),無特有的OTU種類。除HB樣品外,其他4個樣品特有的OTU數所占比例均<10.81%,說明雖然臘肉來源不同,但大多數樣品的細菌多樣性特異性較小,相似性較高。

a-稀釋曲線；b-Venn圖

2.2 不同來源臘肉樣品的Alpha多樣性分析

根據97%相似性水平下的OTU信息,采用Alpha多樣性指標中的Shannon、ACE、Chao1及Coverage指數對樣品中細菌的多樣性和豐富度進行評估。由表2可知,各樣品的Coverage指數均達到了0.99以上,說明樣品文庫中序列基本上都被測出,即樣本測序結果可以反應樣品真實情況,測序結果合理。HB樣品的ACE、Chao1指數均最高,說明該樣本中物種豐富度最高；CQ樣品中Shannon指數最高,ACE、Chao1指數僅次于HB樣品,說明其微生物多樣性最高,物種豐富度也較高；GZ樣品中ACE、Chao1及Shannon指數均為最低,說明樣品中的細菌豐富度和多樣性都最低,這與OTU分析結果一致(圖1)。

表2 Alpha多樣性指數

2.3 不同來源臘肉樣品中的細菌群落組成分析

2.3.1 基于門分類水平的分析

5個來源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉樣本序列經RDP classifier軟件進行分類分析,在門水平上,共檢測到7個細菌門,其樣本群落組成如圖2所示。不同來源樣品中共有的細菌門有3個,分別為變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria),其中Proteobacteria和Firmicutes為絕對優(yōu)勢菌門,兩者的相對豐度達到98%以上。這與多數研究一致,在風干肉[11]、發(fā)酵香腸[13]、腐乳[14]等多種傳統(tǒng)發(fā)酵產品中,均發(fā)現Proteobacteria和Firmicutes為優(yōu)勢菌門。HB、GZ、HN、CQ樣品中的第1優(yōu)勢細菌門為Firmicutes,相對豐度分別高達59.59%、88.28%、80.64%、85.98%；第2優(yōu)勢細菌門Proteobacteria,相對豐度分別為39.40%、11.70%、19.29%、13.87%。而YN樣品中的第1優(yōu)勢細菌門為Proteobacteria,相對豐度為64.66%；第2優(yōu)勢細菌門為Firmicutes,相對豐度為35.05%。Actinobacteria在各樣品中相對豐度較少,比例為0.01%～0.13%。

圖2 門水平物種分布柱狀圖

此外,除GZ樣品外,其他樣品均含有unclassified_k_norank_d_Bacteria。HB和CQ樣品還包含極少量的擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍菌門(Cyanobacteria),相對豐度分別為0.07%、0.01%和0.08%、0.02%。

2.3.2 基于屬分類水平的分析

5個來源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中共鑒定出83個細菌屬,圖3顯示了主要優(yōu)勢菌屬(前15位)的分布情況。前15個屬中,HB和CQ樣品所包含的屬種類最多,均為14個屬,YN樣品包含13個屬,HN樣品包含11個屬,GZ樣品中包含的屬種類最少,為10個屬,這與Alpha多樣性分析結果一致(表2)。5個來源樣品中共有的屬包括葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、環(huán)絲菌(Brochothrix)、魏斯氏菌屬(Weissella)、氣球菌屬(Aerococcus)、肉食桿菌屬(Carnobacterium)和未識別的芽孢桿菌(unclassified_c_Bacilli)。以相對豐度>10% 統(tǒng)計,CQ樣品中的優(yōu)勢菌屬為Lactobacillus(32.43%)、Staphylococcus(31.93%)、Weissella(14.07%)、Psychrobacter(13.37%)；YN樣品中的優(yōu)勢菌屬為Psychrobacter(63.80%)、Brochothrix(20.76%)；HN、GZ、HB樣品中的優(yōu)勢細菌屬均為Staphylococcus和Psychrobacter,所占比例分別為79.72%、86.30%、48.71% 和15.69%、11.70%、38.05%。除YN樣品外,Staphylococcus和Psychrobacter均為樣品中的優(yōu)勢細菌屬。GZ和HN樣品中Staphylococcus和Psychrobacter所占的比例分別高達98.00%和95.41%,其他菌屬所占比例較低且菌種多樣性較差,這與樣品多樣性分析一致(表2)。樣品中還檢測到乳球菌屬(Lactococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)等,Lactococcus和Leuconostoc在YN樣品中相對豐度最高,分別為3.41%和3.58%,在其他樣品中的相對豐度均<2%。此外,在HN樣品中檢測出Cobetia；在CQ、HB樣品中檢測出Aerococcus；在超過3個地區(qū)樣品中檢測出unclassified_c_Bacilli、Carnobacterium和Acinetobacter,柱狀圖中未顯示的并不代表該樣品中無此菌屬,可能是因為所占比例較小(<0.5%),歸類為others。

圖3 屬水平物種分布柱狀圖

乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌(coagulase-negativeStaphylococcus,CNS)被認為是發(fā)酵肉制品成熟過程中的2種主要微生物,對產品品質特性有至關重要的影響[15-16]。葡萄球菌中的木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)等具有較強的蛋白酶和脂肪酶活性,有利于產生多肽、游離氨基酸和游離脂肪酸,對發(fā)酵肉制品的質地和風味起關鍵作用[17],并有研究表明,S.xylosus和S.carnosus具有硝酸鹽還原酶活性,可以有效促進發(fā)酵肉制品的發(fā)色作用。清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosus)等一般都具有較好的產酸能力,能抑制部分有害微生物的生長,甚至具有抗氧化、降低膽固醇等功能性作用[18]。Weissella作為乳酸菌的一種,也具有提高發(fā)酵產品質量、縮短發(fā)酵周期等重要作用[19]。

作為參與肉制品發(fā)酵的菌種,乳酸菌被認為是安全的,但對于其他菌種,對產品品質和安全性的影響有待進一步研究。Psychrobacter在各樣品中均為優(yōu)勢菌屬,相對豐度為11.70%～63.80%。相關研究報道,Psychrobacter屬于低溫冷藏食品中的優(yōu)勢腐敗菌[20-22],能夠引起產品產生輕微腥味和發(fā)霉的氣味[23-24]。在多種發(fā)酵肉制品[25]中也檢測出Psychrobacter,若發(fā)酵完成的產品在冷藏過程中蛋白質和脂肪繼續(xù)被分解,會嚴重影響產品的品質。Brochothrix均存在于5個來源樣品中,相對豐度為0.06%～20.76%,該菌能夠在好氧和厭氧條件下生長,被認為是使肉類產生異味和肉類腐敗的因素之一[26-27]。除HB樣品外,在其他4個地區(qū)樣品中均檢測到Carnobacterium,相對豐度為0.02%～0.82%,有研究表明Carnobacterium是低溫冷藏小龍蝦中的優(yōu)勢腐敗菌,同時,也有報道稱Carnobacterium參與不飽和脂肪酸的代謝,從而促進了酸價、過氧化值上升。在YN、CQ、HB這3個地區(qū)樣品中檢測到Acinetobacter,該菌種在發(fā)酵產品中較為常見,雖然在臘肉細菌群落中相對豐度較小(HB樣品中相對含量為0.83%、CQ和YN樣品中均為0.01%),但會使產品產生異味和腐敗,并且作為條件性致病菌,應注意其潛在危險性。在YN、GZ、CQ 3個地區(qū)樣品中檢測到unclassified_c_Bacilli,相對豐度為0.03%～1.93%,該類菌會產芽孢且耐高溫,部分芽孢桿菌可能還會產生毒素,危害人體健康。CQ、HB樣品中檢測到Aerococcus,相對豐度分別為0.02%和2.87%,該菌屬于革蘭氏陽性球菌,對食鹽和膽鹽有一定的耐受性,但目前有研究報道一些疾病的產生與Aerococcus屬中的一些菌有關[28-29],應注意該菌種在發(fā)酵肉制品中的潛在危害。多數地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品在生產過程中對原料肉不做殺菌處理,衛(wèi)生質量主要依靠原料肉自身和周邊的環(huán)境條件,容易被致病菌或腐敗菌污染。因此,發(fā)酵肉制品因被致病菌或腐敗菌污染而引起的風險應該被廣泛關注。雖然不同來源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉的原料、加工工藝和環(huán)境條件等不盡相同,但Psychrobacter、Brochothrix、Carnobacterium、Aerococcus、Bacilli和Acinetobacter在多個地區(qū)產品中出現,對產品品質和產品安全性存在潛在威脅。關于產品的安全性,可以通過使用發(fā)酵劑代替自然發(fā)酵,規(guī)范加工生產工藝,保證產品的品質和安全性。

2.4 不同來源臘肉樣品中細菌群落比較

主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)是結合聚類分析與主成分分析的方法,用較少的主坐標對分類單元進行有效地排序,樣本組成越相似反映在PCoA圖中的距離越近[11]。如圖4-a所示,主成分1和主成分2分別解釋了不同來源臘肉樣品中細菌群落 62.68%和 23.28%的信息,2個主成分所占比例之和超過85%,表明這2個成分能較好地代表樣品中的細菌群落信息。同一來源的樣品在主坐標分析圖中比較聚集,說明樣品測序結果重復性較好。在主成分1水平上,YN、HB樣品與GZ、HN、CQ樣品能較好地區(qū)分；GZ和HN樣品距離最近,甚至出現交叉重疊現象,差異不大,這與Heatmap中聚類結果一致(圖4-b),說明GZ和HN來源的樣品中細菌群落較為相似。YN樣品與HN、GZ樣品在圖4-a中距離較遠,說明細菌群落差異較大。不同來源臘肉的原料、加工工藝和環(huán)境條件等都可能導致樣品中細菌群落的差異,從而導致樣品風味等品質的差異性。

圖4 細菌群落主坐標分析圖(a)和屬水平Heatmap(b)

2.5 不同來源臘肉樣品中的菌群結構與產品風味

使用電子鼻技術對不同來源傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉的風味品質進行了評價。由圖5可知,電子鼻10個傳感器對臘肉樣品中的風味物質均有很好的響應。不同地區(qū)樣品對電子鼻傳感器的響應值存在顯著性差異(P<0.05),說明不同樣品的風味存在一定差異。W5S和W1W傳感器的響應值相對最高,W1S和W2S的響應值次之,W1C和W3C的響應值最低。GZ和HN樣品的傳感器響應值有50%不存在顯著性差異(P>0.05),而YN與GZ樣品和YN與HN樣品的傳感器響應值分別有70%和90%存在顯著性差異(P<0.05)。這可能與GZ和HN樣品的群落相似性較高,而YN樣品與GZ、HN樣品相似性較低有關(圖4)。

圖5 不同來源臘肉中揮發(fā)性物質信號強度

對平均相對含量>1.00%的優(yōu)勢細菌屬與風味品質評價指標之間的相關性進行分析,結果如圖6所示,Psychrobacter和Brochothrix菌株均與W5S、W1W、W2W顯著正相關(P<0.05),而W1W和W2W代表傳感器對硫化物較為敏感,W5S代表對氮氧化合物較為敏感。孫娜等[30]的研究中表明,一些硫化物呈現的氣味描述為腐臭味和惡臭味等不良風味,這與之前的研究和前文中推測相符,說明Psychrobacter和Brochothrix可能會對產品品質產生負面的影響。揮發(fā)性物質與細菌菌群結構關系復雜,某一種揮發(fā)性成分可能與多種細菌菌群均存在一定的相關性,可能是多種微生物協(xié)同作用的結果。如W1W和W2W還與Staphylococcus存在顯著的負相關關系(P<0.05),這可能是因為葡萄球菌屬中部分菌株具有硝酸鹽還原和抗氧化能力,可以阻止不飽和脂肪酸的氧化和其他不良風味的形成。另外,Staphylococcus與W1C、W3C、W5C有較高的正相關關系,而W1C、W3C、W5C主要對芳香類物質敏感,說明葡萄球菌對風味物質形成發(fā)揮著重要作用。周慧敏等[4]研究發(fā)現添加木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌可以有效促進氨基酸代謝類風味物質的產生,同時可以降低脂質氧化類物質的形成速率。BECK等[31]研究中表明木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌能夠轉換氨基酸和游離脂肪酸,從而協(xié)調風味的形成。Lactobacillus和Weissella與W1S、W2S和W3S均有正相關關系,而W1S、W2S和W3S代表的傳感器主要對烷類、醇類和酯類敏感。這與孫娜等[30]的研究結果相似,均表明乳桿菌等乳酸菌與醇類、酯類具有較高的相關性。這可能是因為乳酸菌對發(fā)酵肉制品風味的貢獻主要是通過分解代謝碳水化合物、氨基酸等產生有機酸[32-33],且異型發(fā)酵的乳酸菌對碳水化合物的代謝和脂質氧化可產生并不斷積累醇類物質,是形成酯類及其他香味成分的重要物質基礎[34]。原料肉中的肌原纖維和肌漿蛋白會經過內源酶或乳酸菌胞外酶的作用降解生成呈味氨基酸或寡肽,氨基酸進一步通過轉氨反應、氧化脫氨、脫羧反應以及降解反應形成其他物質,其中醛類物質進一步發(fā)生氧化還原反應形成酸類、醇類、酯類[35]。這都會直接或間接引起乳酸菌與醇類、酯類等的相關性。

圖6 優(yōu)勢細菌屬與風味指標相關性

3 結論

本研究采用高通量測序技術對不同來源的傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中細菌多樣性進行了解析,同時結合電子鼻技術對風味品質進行評價。結果顯示不同來源臘肉樣品在細菌組成方面存在較高的相似性。厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為絕對優(yōu)勢細菌門；葡萄球菌屬(Staphylococcus)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、環(huán)絲菌屬(Brochothrix)和魏斯氏菌屬(Weissella)為優(yōu)勢細菌屬。葡萄球菌屬(Staphylococcus)可能會促進產品中芳香類物質的產生且抑制不良風味；乳桿菌屬(Lactobacillus)和魏斯氏菌屬(Weissella)可能影響臘肉中醇類、酯類和烷類揮發(fā)性風味物質；嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)和環(huán)絲菌屬(Brochothrix)可能會導致產品品質變差,同時引起不良風味的產生；在非優(yōu)勢細菌屬中,肉食桿菌屬(Carnobacterium)、氣球菌屬(Aerococcus)、芽孢桿菌屬(Bacilli)和不動桿菌屬(Acinetobacter)也有對產品品質造成不良影響的風險。本研究結果為深入了解傳統(tǒng)自然發(fā)酵臘肉的微生物群落與產品品質的關系、開發(fā)專用細菌發(fā)酵劑提供數據支撐和參考依據。