王洋,黃業(yè)傳,柴利

(西南科技大學 生命科學與工程學院,四川 綿陽,621010)

發(fā)酵香腸是指碎肉和丁狀脂肪同鹽、糖、香辛料及其他輔料等混合灌入腸衣后,經(jīng)微生物發(fā)酵及干燥成熟后形成的一種發(fā)酵腸類制品[1],按加工過程中脫水程度和水分含量可分為半干發(fā)酵香腸和干發(fā)酵香腸。其中半干發(fā)酵香腸的最終pH值為4.8～5.3,水分含量在50%以上,且需要冷藏。在發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中往往需要添加亞硝酸鹽,以促進發(fā)色、抑菌及改善肉制品品質(zhì)等[2],同時還起到有效的抗氧化作用。亞硝酸鹽自身毒性較強,且能在腌制過程中與肉制品中的胺類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生具有潛在致癌性的亞硝胺類物質(zhì)[3]。為了提高食品的安全性,國內(nèi)外的研究學者都在致力于尋找一種天然無毒的亞硝酸鹽替代品[4-5]。

玫瑰中的營養(yǎng)物質(zhì)豐富,含300多種化學成分,其中花色素和黃酮類化合物含量較豐富[6]。玫瑰花色素有良好的著色效果,尤其是酸性環(huán)境下,穩(wěn)定性更好,可經(jīng)受一般食品的加工條件[7],同時玫瑰花色素還有清除亞硝酸鹽的作用[8]；馮作山等[9]研究發(fā)現(xiàn)從玫瑰花渣中提取的總黃酮含量高達3.34%,黃酮類物質(zhì)在抗氧化、抑菌、抗腫瘤、抗炎等方面有顯著的功效[10]。玫瑰含有大量鞣酸,苦澀味較重,目前在肉制品領(lǐng)域上運用較少,本實驗采用糖漬浸提法提取玫瑰有效成分,并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝,利用玫瑰紅色素的著色及黃酮類抗氧化等作用,與亞硝酸鈉復配后添加于肉制品中,旨在改善發(fā)酵肉制品色澤并降低其亞硝酸鹽殘留量,提高發(fā)酵肉制品的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬后腿肉、豬背膘、味精、食鹽、蔗糖、葡萄糖、白胡椒粉、五香粉、豆蔻粉、姜粉,當?shù)厍嗔x鎮(zhèn)家多樂超市；新鮮墨紅玫瑰花,云南紅河；SBM-52菌株(肉葡萄球菌+木糖葡萄球菌+乳酸片球菌+戊糖片球菌),意大利SACCO公司。

蘆丁標準品,成都曼思特生物科技有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、碘化鉀、四硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉,成都科龍試劑廠；檸檬酸(食品級),河南萬邦實業(yè)有限公司；復合磷酸鹽(食品級),徐州恒世食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DJQQLS128-C強力臺式絞切兩用機,如東垣悅食品機械廠；NH 300色差儀(光源為D65),深圳市三恩時科技有限公司；DHG—9053A電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司；UV 1000單光束紫外可見光分光光度計,上海天美科學儀器有限公司；HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋,浙江金壇市正基儀器有限公司；MJ-L500原汁機,松下電器。

1.3 實驗方法

1.3.1 玫瑰液制備與優(yōu)化

1.3.1.1 工藝流程及要點

工藝流程：原料清洗→晾干→浸提→壓榨→過濾→玫瑰汁

取新鮮玫瑰花瓣,洗凈晾干后剪碎,與水和蔗糖按試驗設(shè)計混合,混勻后加入一定質(zhì)量分數(shù)的檸檬酸,因玫瑰花色苷的熱穩(wěn)定性差,當溫度超過70 ℃時,花色苷易分解,故本試驗的提取溫度固定為60 ℃,待浸提結(jié)束后用原汁機榨汁,過濾后即得玫瑰液。

1.3.1.2 單因素試驗設(shè)計

以總黃酮含量、色度值和感官評分為評價指標,探究液花比、糖花比、檸檬酸添加量和提取時間對玫瑰液的品質(zhì)影響,以初步確定最佳工藝條件的范圍。各因素的設(shè)置水平如表1所示。

表1 單因素試驗中各因素水平表

1.3.1.3 Box-Benhnken優(yōu)化試驗設(shè)計

結(jié)合單因素試驗結(jié)果,選出指標較好的水平,同時將總黃酮、色度值、感官評分通過幾何加權(quán)法進行量綱統(tǒng)一歸一化,并依據(jù)各指標重要性得到綜合指標Y,并以此為響應(yīng)值,用響應(yīng)面軟件對數(shù)據(jù)進行多項回歸擬合及模型進行方差分析,探究其最佳提取工藝。

1.3.2 發(fā)酵香腸的制作

1.3.2.1 基礎(chǔ)配方

新鮮豬后腿肉和豬背膘(肥瘦肉質(zhì)量比2∶8),其他成分均以肉的質(zhì)量計,食鹽2%、蔗糖1%、葡萄糖0.8%、復合磷酸鹽0.2%、豆蔻粉0.06%、料酒2%、味精0.1%、姜粉0.1%、五香粉0.1%、白胡椒粉0.1%(均為質(zhì)量分數(shù)),亞硝酸鈉及玫瑰液根據(jù)實驗設(shè)計添加,水分添加量控制在原料肉質(zhì)量的20%以內(nèi)。

1.3.2.2 工藝流程及操作要點

工藝流程：原料肉處理→絞碎→腌制→菌液制備→接種→灌腸→發(fā)酵→煙熏→干燥→成品檢驗

選擇新鮮豬后腿肉和豬背膘,將豬背膘切成薄片于-18 ℃下預凍,將瘦肉切成塊后和預凍好的背膘一同攪碎；加入各種調(diào)味料和輔料并攪勻,于4 ℃腌制24 h；將5 g脫脂奶粉和0.75 g葡萄糖溶于50 mL水中,加入1.0 g SBM-52菌粉,混勻后于常溫下活化2 h；對腌制后的原料接種發(fā)酵劑,確保活菌數(shù)在107CFU/g以上；將原料灌入腸衣中,用牙簽排除香腸內(nèi)的氣體,每隔15～20 cm打一線結(jié),最后放入溫水中洗去表面的油污雜質(zhì)；在溫度為30 ℃,濕度為80%的條件下發(fā)酵,當pH值下降至5.1左右時停止發(fā)酵；用煙熏爐40 ℃熏制45 min,隨后于65 ℃干燥150 min；將成品真空包裝并冷藏24 h后測定其亞硝酸鹽殘留、色差值,蒸煮30 min后做感官評價。

1.3.3 亞硝酸鹽及玫瑰液對發(fā)酵香腸品質(zhì)的影響

肉類制品若要抑制肉毒梭菌毒素的產(chǎn)生,在腌制時亞硝酸鹽的使用量必須在40 mg/kg以上[11],考慮到安全性,本試驗考察亞硝酸鈉添加量40～100 mg/kg的基礎(chǔ)上,玫瑰液的最佳替代效果。具體試驗組的編號及分組情況見表2。

表2 發(fā)酵香腸配方及分組情況

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 總黃酮測定

準確量取玫瑰液1.0 mL用蒸餾水定容至50 mL,取4.0 mL用于測定總黃酮,采用改進的硝酸鋁-亞硝酸鈉顯色法[12]進行測定。

1.3.4.2 色度值測定

將樣品稀釋適宜倍數(shù)后離心取上清液于可見光波長范圍內(nèi)進行光譜特征分析,確定其最大吸收波長為520 nm。取待測樣品1 mL,定容至25 mL后用分光光度計于波長520 nm處測吸光度,以此作為色度值。

1.3.4.3 玫瑰液感官評價

感官評價由8名食品專業(yè)研究生組成,評分標準參考張冰晶等[13]的方法并稍作修改,如表3所示。

表3 玫瑰液感官評分標準

1.3.4.4 綜合指標的計算

加權(quán)評分的計算方法參照文獻[14],幾何加權(quán)法統(tǒng)一量綱的計算如公式(1)所示:

(1)

式中：Ui為統(tǒng)一量綱值；fimin為測定最小值；fimax為測定最大值。

權(quán)重分配解釋：玫瑰紅色素和總黃酮對試驗設(shè)計同等重要,故相應(yīng)的色度值及總黃酮含量的權(quán)重系數(shù)各分配0.3,蔗糖和檸檬酸添加會使提取液的感官特性發(fā)生顯著變化,故感官評分的權(quán)重系數(shù)為0.4。加權(quán)后綜合指標的計算如公式(2)所示:

綜合指標Y=0.3×U1+0.3×U2+0.4×U3

(2)

式中：U1為統(tǒng)一量綱后的總黃酮量綱值；U2為統(tǒng)一量綱后的A520值；U3為統(tǒng)一量綱后的感官評分量綱值。

1.3.4.5 亞硝酸鈉的測定

參考國家標準GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度法。

1.3.4.6 色差的測定

色差儀校正后,將香腸切成2 cm厚的切片,用保鮮膜覆蓋其表面,用鏡口緊貼切面(鏡口直徑8 mm),測定其亮度值(L*)和紅度值(a*),每個樣品重復測定6次,取其平均值。

1.3.4.7 發(fā)酵香腸感官評價

參考黃金枝等[15]的方法并略作修改。由8位食品專業(yè)研究生的組成評定小組,采用盲評計分方式及排序法對香腸的感官指標進行評價。分別從外觀、組織狀態(tài)和口感3個方面進行評定,計分標準：10分制,其中各評定項目中極好為10.0～8.1分,較好為8.0～6.1分,一般為6.0～4.1分,較差為4.0～2.1分,極差為2.0～0分,總分為30分。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2016處理數(shù)據(jù),采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析,用SPSS Statistics 20軟件進行顯著性分析,同時使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 液花比對玫瑰液品質(zhì)的影響

由圖1可知,當液花比在0.5∶1～1∶1(mL∶g)時,總黃酮含量呈上升趨勢,分析原因是由于玫瑰花總黃酮含量豐富,相對溶劑較少,玫瑰花中的總黃酮不能完全溶出,未達到提取的飽和點;當液花比高于1∶1(mL∶g)后,總黃酮含量逐漸降低,可能因為溶劑的增加導致細胞中的其他雜質(zhì)溶出,同時溶劑也有稀釋作用,使得提取的總黃酮含量較低；提取液的色度值變化趨勢與總黃酮類似,花色素易溶于水,適當?shù)娜軇┯欣诨ㄉ氐奶崛?當液花比高于1∶1(mL∶g)時,溶劑增多反而會稀釋提取液的花色苷的濃度,并且花色苷分子之間的作用力也會受到削弱,穩(wěn)定性較差。從感官上來看,當液花比在1∶1(mL∶g)左右時,感官評分較高,過度的稀釋會導致整體的風味及口感不理想。綜合各指標可確定液花比在0.5∶1～1.5∶1(mL∶g)范圍內(nèi)最佳。

圖1 液花比對提取液品質(zhì)的影響

2.1.2 糖花比對玫瑰液品質(zhì)的影響

由圖2可知,隨著蔗糖添加量的增加,總黃酮的含量直線下降,這是因為蔗糖可以提高滲透壓,在高滲透壓作用下玫瑰鮮花的汁液和包括黃酮類化合物在內(nèi)的其他營養(yǎng)成分逐漸溶出,加糖量越多,出汁率越高,加之糖的濃度提高使得提取液總黃酮的相對含量降低,而色度值的變化與總黃酮的變化趨勢相反,蔗糖有良好的護色作用,可提高花色素的熱穩(wěn)定性,蔗糖的濃度越大,增強穩(wěn)定性的效果越明顯[16],且蔗糖還具有一定的輔色作用,在提取的過程中隨著糖濃度的升高,其滲透壓讓花色素加速溶出并與糖形成較穩(wěn)定的結(jié)合[17]。當糖花比高于2∶1(g∶g)時,色度值的增長趨勢較緩慢,可能由于花色素類物質(zhì)提取接近飽和。從感官上來講,當糖花比為2∶1(g∶g)時,蔗糖能有效掩蓋住玫瑰厚重的苦澀味,且甜度適宜,當糖分增加時,使得提取液發(fā)黏發(fā)稠,同時口味甜膩。綜合各指標結(jié)果,可確定糖花比在1.5∶1～2.5∶1(g∶g)最佳。

圖2 糖花比對提取液品質(zhì)的影響

2.1.3 檸檬酸對玫瑰液品質(zhì)的影響

由圖3可知,檸檬酸對總黃酮含量的影響不顯著,這與陸慶[18]的研究結(jié)果相似。色度值與檸檬酸添加量呈正相關(guān),這是因為花色苷在酸性條件下穩(wěn)定,通過檸檬酸處理玫瑰花可降低細胞液內(nèi)pH值,增加花色苷在酸性溶液中的溶解度,并使其維持鮮紅色的花色烊陽離子結(jié)構(gòu)[19]。然而檸檬酸的添加顯著影響提取液的感官特性,從感官結(jié)果中可看出,當檸檬酸質(zhì)量分數(shù)在0.30%左右時,感官評分較高,此時提取液酸甜適中,顏色鮮艷。綜合各指標結(jié)果,可以確定檸檬酸質(zhì)量分數(shù)在0.25%～0.35%最佳。

圖3 檸檬酸添加量對提取液品質(zhì)的影響

2.1.4 提取時間對玫瑰液品質(zhì)的影響

由圖4可知,經(jīng)過1.5 h提取后總黃酮含量達到峰值,隨后隨時間推移而趨于平緩,是因為在提取的起初階段,提取液和原料這2個體系間存在濃度差,當提取1.5 h后,這2個體系達到相對平衡的狀態(tài),原料中的總黃酮不易溶出,含量趨于穩(wěn)定。不僅如此,時間的推移還會使其他水溶性的物質(zhì)溶解,干擾總黃酮的提取。從色度值的變化趨勢可以看出提取液中的花色苷的含量在0.5～1.0 h穩(wěn)定增加,隨后較為平緩,最后表現(xiàn)下降趨勢,這是由于玫瑰花色苷的熱穩(wěn)定性較差,花色苷的結(jié)構(gòu)易破壞而降解,故提取時間不宜過長。從感官結(jié)果來看,在提取1.5 h左右時,提取液的品質(zhì)較好,色澤及風味較佳。綜合各指標結(jié)果,可以確定提取時間在1.0～2.0 h最佳。

圖4 提取時間對提取液品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 響應(yīng)面分析因素水平的選擇

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,以液花比(A)、糖花比(B)、檸檬酸(C)及提取時間(D)為自變量,采用4因素3水平的響應(yīng)面分析方法,試驗的因素及水平設(shè)計見表4。

表4 響應(yīng)面因素水平及編碼

2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

試驗設(shè)計及結(jié)果見表5,將表5中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析,可得到回歸方程預測模型：Y=0.6-0.094A-0.14B-0.025C+0.027D+0.092AB+0.019AC-0.005AD+0.012BC-0.029BD-0.015CD-0.17A2-0.078B2-0.10C2-0.064D2

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

運用Design-Expert軟件對模型進行方差分析,以此來驗證回歸模型及各個參數(shù)的顯著度,結(jié)果如表6所示,模型的P值為0.000 1<0.01,表明該模型方程極顯著,模型失擬項的P值為0.375 8>0.05,表明本試驗不存在其他顯著影響因素,模型的決定系數(shù)R2為98.9%,這說明該模型與實際試驗擬合度較高,98.9%的響應(yīng)值變化可有效通過此模型進行解釋。為了驗證模型預測結(jié)果與實際情況是否相近,利用軟件分析得到最優(yōu)工藝條件,考慮實際生產(chǎn)可操作性,將最佳工藝條件略作修改,修改后的參數(shù)為：液花比0.7∶1(mL∶g)、糖花比1.5∶1(g∶g)、檸檬酸質(zhì)量分數(shù)為0.3%、提取時間為1.75 h,在此條件下重復3次試驗,所得的綜合指標平均結(jié)果為0.716,與預測理論值相近,其相對誤差約為1.68%,偏差不大,說明此結(jié)果可靠,該模型能較好預測響應(yīng)值的變化趨勢。

表6 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析表

2.3 不同添加量的玫瑰液和亞硝酸鹽對發(fā)酵香腸亞硝酸鹽殘留的影響

由圖5可知,PC組的亞硝殘留最高,接近20 mg/kg,是由于初始添加量最高所致；其余添加玫瑰試驗組的亞硝殘留呈現(xiàn)梯度增長的趨勢,是由于相鄰組間初始亞硝酸鹽添加量相差20 mg/kg所致,然而當亞硝酸鹽添加量一致時,A、B、C組內(nèi)亞硝殘留均出現(xiàn)隨玫瑰提取液的增加而增加,這可能是因為玫瑰中本身存在一定量的硝酸鹽,在發(fā)酵過程中可以在硝酸鹽還原菌的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽[20],導致不同玫瑰液添加量中的亞硝酸鹽殘留出現(xiàn)差異,D組亞硝酸鹽殘留相對較高,均在10 mg/kg左右,盡管所有試驗組的殘留量均在國家標準范圍內(nèi)(<30 mg/kg),但產(chǎn)品的安全性隨亞硝殘留量的增加而降低,考慮安全性因素,將A、B、C試驗組作為考察范圍。

圖5 各試驗組亞硝酸鹽殘留的結(jié)果

2.4 不同添加量的玫瑰液和亞硝酸鹽對發(fā)酵香腸色差的影響

對腌肉制品來說,色澤中最重要也最直觀的參數(shù)是a*值。從表7可見a*值最低的是NC組,因未添加亞硝酸鈉使香腸的切面泛白。a*值最高的是C2、C3及D1組,其a*值顯著高于PC組(P<0.05),這是由于玫瑰液中的玫瑰紅色素在起作用,花色素在酸性環(huán)境下較穩(wěn)定,使得發(fā)酵香腸的a*值顯著提升；隨著玫瑰液添加量的增加,使得L*值顯著降低(P<0.05),可能由于玫瑰液中含有較多的酚類物質(zhì),這些多酚類物質(zhì)容易被多酚氧化酶氧化成相應(yīng)的醌類,從而降低香腸的L*值[21],當亮度值低于57時香腸切面顏色暗淡,感官較差,不納入選擇范圍內(nèi)。綜合a*值和L*值結(jié)果,C2和D1組的在色澤方面較理想。

表7 不同添加量的玫瑰液和亞硝酸鈉對發(fā)酵香腸色差的影響

2.5 感官評價

由圖6可知,與PC組相比,玫瑰的添加使得發(fā)酵香腸的品質(zhì)得到極大地提升,玫瑰液中的果膠有一定的凝膠特性,在改善色澤的同時一定程度上有助于提高香腸的彈性,改善硬度、口感,且賦予發(fā)酵香腸獨特的風味及營養(yǎng)價值。從圖6可直觀反映出C2、C3、及D2組的感官評分較高,且遠高于其他試驗組及對照組。

圖6 發(fā)酵香腸的感官評定

通過觀察亞硝酸鹽殘留、色差值及感官評定結(jié)果可知,C2試驗組符合各項指標要求,因此我們可以確定C2試驗組為部分替代亞硝的最佳組合,即80 mg/kg亞硝酸鈉+10%(質(zhì)量分數(shù))玫瑰液。

3 結(jié)論

玫瑰含有豐富的花青素和抗氧化物質(zhì),在半干發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中使用可減少亞硝酸鹽的添加量。采用響應(yīng)面法對提取工藝進行優(yōu)化,當液花比0.7∶1(mL∶g)、糖花比1.5∶1(g∶g)、檸檬酸質(zhì)量分數(shù)為0.3%、提取時間為1.75 h時,玫瑰液綜合品質(zhì)指標較高。將優(yōu)化后的玫瑰液與亞硝酸鈉復配添加到發(fā)酵香腸中,通過考察玫瑰液對發(fā)酵香腸亞硝酸鹽殘留量、色差(L*值和a*值)及感官品質(zhì)的影響,并確定了80 mg/kg 亞硝酸鹽和10%(質(zhì)量分數(shù))玫瑰液的組合就能使發(fā)酵香腸達到一個很好的色澤,且各方面品質(zhì)特性均遠優(yōu)于單獨添加150 mg/kg的發(fā)酵香腸。表明玫瑰替代發(fā)酵肉制品中亞硝酸鹽的應(yīng)用效果較好且前景廣闊。