程新,黃璟,JACOB Ojobi Omedi,張賓樂(lè),鄭建仙,黃衛(wèi)寧*,高鐵成,李寧,FILIP Arnaut

1(食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué)),江蘇 無(wú)錫,214122) 2(華南理工大學(xué) 輕工與食品學(xué)院,廣東 廣州,510641) 3(廣州焙樂(lè)道食品有限公司,廣東 廣州,511400)4(焙樂(lè)道食品集團(tuán),比利時(shí) 布魯塞爾,1201)

白蕓豆(PhaseolusvulgarisL.)因其抗性淀粉含量高,血糖指數(shù)(glycemic index,GI)低等特點(diǎn)而受到關(guān)注。研究者們致力于通過(guò)限制淀粉消化率來(lái)降低某些食物的GI值。研究表明,濕熱處理能顯著提高白蕓豆抗性淀粉(resistant starch,RS)含量,降低淀粉消化率[1]。LAPPI等[2]發(fā)現(xiàn)在酸面團(tuán)發(fā)酵的低pH環(huán)境下,淀粉消化率顯著降低。

濕熱處理(heat moisture treatment,HMT)是一種物理改性技術(shù),包括三個(gè)主要條件：1)較低的水分條件(低于35%);2)較高的溫度條件(超過(guò)90 ℃);3)一定的處理時(shí)間(15 min～16 h)[3]。濕熱處理可以促進(jìn)分子間的定向重排,有利于提高RS含量,限制α-淀粉酶對(duì)淀粉的可及性,增強(qiáng)淀粉的抗消化特性[4]。現(xiàn)代酸面團(tuán)發(fā)酵技術(shù)在降低淀粉消化率方面具有明顯優(yōu)勢(shì),乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵是酸面團(tuán)發(fā)酵的一種新形式,鄒奇波等[7]研究發(fā)現(xiàn),食竇魏斯氏菌和馬克斯克魯維酵母混菌發(fā)酵可改善全麥面包品質(zhì)。但植物乳桿菌/戊糖片球菌和馬克斯克魯維酵母混菌發(fā)酵在白蕓豆面包體系中的應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道,且濕熱處理與混菌發(fā)酵的聯(lián)合效應(yīng)值得探究。

本研究采用課題組分離自酒曲的植物乳桿菌L1(LactobacillusplantarumLPL-1)/戊糖片球菌J28(PediococcuspentosaceusKID7)和馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus,ATCC36534)為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)比濕熱處理和混菌發(fā)酵的區(qū)別,研究?jī)烧邌为?dú)/組合作用對(duì)酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中理化特性及微觀結(jié)構(gòu)的影響,評(píng)估不同處理對(duì)白蕓豆酸面團(tuán)面包淀粉消化率及GI值的影響,以期為工業(yè)化開(kāi)發(fā)天然、營(yíng)養(yǎng)的豆類(lèi)面包提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白蕓豆粉,陜西斯諾特生物技術(shù)有限公司；黃油,中糧東海糧油工業(yè)(張家港)有限公司；高筋粉,河北參花面粉有限公司；植物乳桿菌L1(LactobacillusplantarumLPL-1)、戊糖片球菌J28(PediococcuspentosaceusKID7),分離自酒曲；馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)ATCC36534,上海一研生物科技有限公司；α-淀粉酶、淀粉葡萄糖苷酶、胃蛋白酶、GOPOD試劑盒、乳酸標(biāo)品、乙酸標(biāo)品,上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、YPD肉湯培養(yǎng)基,杭州百思生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明 B,阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈臺(tái)(SW-CJ-2F 型),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；冷凍離心機(jī)(1850R 型),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱(SPX-150C 型),上海遜博士業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；全溫振蕩培養(yǎng)箱(HZL-F160 型),太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；高效液相色譜儀(2515 型),美國(guó)Waters 公司；pH計(jì)(FE-20 型),梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司；紫外分光光度計(jì)(TU-1810 型),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；激光共聚焦顯微鏡(LSM710 型),德國(guó)蔡司公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白蕓豆粉的濕熱處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取100 g白蕓豆粉(SY),調(diào)至30%水分含量,混合均勻后裝入容器,密封后置于室溫下平衡24 h。待平衡結(jié)束,移入120 ℃烘箱中加熱2 h,再移入40 ℃烘箱中干燥12 h,最后碾磨過(guò)篩(100目),制得濕熱處理后的熟白蕓豆粉(HY),并密封于4 ℃保存[3]。

1.3.2 白蕓豆混菌發(fā)酵酸面團(tuán)的制備

將植物乳桿菌L1和戊糖片球菌J28分別接至MRS液體培養(yǎng)基,活化2代后,分別與馬克斯克魯維酵母KM按培養(yǎng)基體積比為1∶1進(jìn)行離心(6 000 r/min,5 min),離心后與白蕓豆粉混合均勻(酸面團(tuán)初始接種量達(dá)到107CFU/g,DY 250),制成4種酸面團(tuán)：植物乳桿菌L1與馬克斯克魯維酵母KM混菌發(fā)酵生白蕓豆酸面團(tuán)(SY-LK)、戊糖片球菌J28混菌發(fā)酵生白蕓豆酸面團(tuán)(SY-JK)及濕熱-混菌發(fā)酵熟白蕓豆酸面團(tuán)(HY-LK,HY-JK),置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.3.3 酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中pH及有機(jī)酸測(cè)定

參照楊文丹等[8]方法測(cè)定白蕓豆酸面團(tuán)發(fā)酵前后的pH。

根據(jù)王益姝等[9]方法利用HPLC測(cè)定有機(jī)酸。每個(gè)樣品重復(fù)3次,并根據(jù)乳酸和乙酸含量計(jì)算發(fā)酵熵(FQ):發(fā)酵熵=乳酸含量/乙酸含量。

1.3.4 酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中游離總酚含量變化

采用馬子琳等[10]的方法提取酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程的游離總酚。再用福林酚法[11],測(cè)定游離總酚含量。

1.3.5 白蕓豆酸面團(tuán)面包面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)變化

激光共聚焦顯微鏡參考莊靚等[12]的方法,對(duì)不含酵母的面包面團(tuán)(制作配方見(jiàn)表1)微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。首先,將樣品用刀片切成5 mm×5 mm×5 mm小塊,并用包埋劑包埋,立即放-80 ℃冰箱中冷凍1 h。用冷凍切片機(jī)將樣品切成20 μm薄片,然后用羅丹明 B(1.3×10-5g/mL)和FITC(3.5×10-4g/mL)的混合染料對(duì)切片進(jìn)行染色1 min,去離子水沖洗后蓋上蓋玻片,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察,放大倍數(shù)200×。

1.3.6 白蕓豆酸面團(tuán)面包的制作

普通小麥面包(記作XMB)、對(duì)照生蕓豆面包(記作SYB)、濕熱處理白蕓豆面包(記作HYB)、植物乳桿菌L1、戊糖片球菌J28分別與馬克斯克魯維酵母KM混菌發(fā)酵生白蕓豆酸面團(tuán)面包(記作SY-LKB,SY-JKB)和濕熱-混菌發(fā)酵白蕓豆酸面團(tuán)面包(記作HY-LKB,HY-JKB)的制作配方見(jiàn)表1,制作工藝參考鄒奇波等[7]方法。

表1 不同類(lèi)型面包的配方

1.3.7 白蕓豆酸面團(tuán)面包對(duì)α-淀粉酶的抑制作用測(cè)定

參考吳小霞[13]對(duì)α-淀粉酶抑制能力的測(cè)定方法,并做修改。將40 mL可溶性淀粉溶液置于37 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min,再加入1 g不同處理的白蕓豆酸面團(tuán)面包和2 mL(500 U/mL)α-淀粉酶溶液,振蕩水浴反應(yīng)30 min后取消化液4 mL,沸水浴10 min。滅酶結(jié)束后,離心取上清液,用DNS法測(cè)定還原糖含量。同時(shí)將2 mL α-淀粉酶溶液和40 mL可溶性淀粉溶液作為陽(yáng)性對(duì)照,1 g白蕓豆酸面團(tuán)面包和40 mL可溶性淀粉溶液作為陰性對(duì)照。不同酸面團(tuán)面包對(duì)α-淀粉酶的抑制能力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m,陽(yáng)性對(duì)照組還原糖質(zhì)量,mg；m1,樣品組還原糖質(zhì)量,mg；m2,陰性對(duì)照組還原糖質(zhì)量,mg。

1.3.8 白蕓豆酸面團(tuán)面包淀粉體外消化率測(cè)定

采用CHINEDUM等[14]的方法測(cè)定白蕓豆面包總淀粉(total starch,TS)含量及淀粉體外消化率,并做適當(dāng)修改。面包凍干樣品經(jīng)過(guò)胃蛋白酶、α-淀粉酶以及淀粉葡萄糖苷酶處理后,離心收集上清液,最后使用GOPOD試劑盒測(cè)定,得到消化至20 min(G20)和120 min(G120)的葡萄糖含量及游離葡萄糖含量(free glucose,FG)。快速消化淀粉(rapidly digestible starch,RDS)、緩慢消化淀粉(slowly digestible starch,SDS)和抗性淀粉(resistant starch,RS)的計(jì)算公式(2)、(3)、(4)如下：

(2)

(3)

(4)

淀粉體外消化率TS以不同時(shí)間(0、30、60、90、120和180 min)淀粉水解率表示。不同時(shí)間淀粉水解率按公式(5)計(jì)算：

(5)

1.3.9 白蕓豆酸面團(tuán)面包的血糖指數(shù)(GI)

利用 GONI 等[15]建立的非線性模型計(jì)算酸面團(tuán)面包淀粉體外消化動(dòng)力學(xué)。方程如公式(6)所示：

C=C∞(1-e-kt)

(6)

式中：C為時(shí)間t(min)淀粉水解百分率,C∞為淀粉水解180 min 后平衡百分率,k是動(dòng)力學(xué)常數(shù)。根據(jù)淀粉體外消化獲得的數(shù)據(jù),估算不同組別的參數(shù)C∞和k。

淀粉水解指數(shù)(Hydrolysis Index,HI),血糖反應(yīng)的預(yù)測(cè)指標(biāo),其計(jì)算方法是將實(shí)驗(yàn)組的水解曲線下面積(AUC)除以小麥面包的AUC,血糖指數(shù)(GI)參照 FERRER 等如公式(7)所示[16]：

GI=0.862×HI+8.198

(7)

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS、Origin 8.5來(lái)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖,數(shù)據(jù)、圖表中均采用字母上標(biāo)來(lái)表示顯著性分析結(jié)果,字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白蕓豆酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中的酸化特性

混菌發(fā)酵后SY-LK、SY-JK組pH值分別下降到4.22、4.35,HY-LK、HY-JK組pH值略高,分別為4.56、4.68。表明無(wú)論豆粉是否經(jīng)過(guò)處理,相比于JK混菌發(fā)酵,LK混菌發(fā)酵具有更強(qiáng)的酸化作用。這與菌株的發(fā)酵類(lèi)型有關(guān),植物乳桿菌L1為兼性異型發(fā)酵乳桿菌,而戊糖片球菌J28為同型發(fā)酵。MICHAEL 等[17]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌發(fā)酵面包組酸度評(píng)分顯著高于其余發(fā)酵類(lèi)型乳酸菌。

混菌發(fā)酵后SY-LK組乳酸含量最高,為14.03 mg/g酸面團(tuán),這與pH測(cè)定結(jié)果一致。SY-LK組中低pH環(huán)境激活更多內(nèi)源性酶,還可能由于馬克斯克魯維酵母代謝產(chǎn)生的氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)植物乳桿菌L1生長(zhǎng),產(chǎn)生更多乳酸[18]。在淀粉糊化過(guò)程中乳酸可以促進(jìn)淀粉和蛋白相互作用,降低淀粉消化率[19]。濕熱處理后,乳酸沒(méi)有顯著性變化,但乙酸含量顯著增加。原因在于濕熱處理后,最終發(fā)酵pH接近馬克斯克魯維酵母生長(zhǎng)的適宜pH值,酵母代謝增強(qiáng),產(chǎn)生更多乙酸,而乙酸可以延長(zhǎng)胃排空速度,降低淀粉消化率[20]。

表2 白蕓豆酸面團(tuán)發(fā)酵前后的pH及有機(jī)酸

2.2 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)總酚含量的影響

4種白蕓豆酸面團(tuán)總酚含量的排序?yàn)椋喊l(fā)酵(SY-LK>SY-JK)>濕熱-發(fā)酵(HY-LK>HY-JK)>濕熱處理(圖1)。經(jīng)過(guò)HMT后總酚含量降低約20%,是因?yàn)樵贖MT過(guò)程中芳香族環(huán)結(jié)構(gòu)發(fā)生分解,導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)發(fā)生降解[21]?；炀l(fā)酵后總酚含量增加約1.61～1.97倍,其中HY-LK組增幅最高,達(dá)到21.94 mg/g。酸化可以提高β-葡萄糖苷酶活性,而β-葡萄糖苷酶可以水解酚類(lèi)化合物,甚至酚類(lèi)與纖維或有機(jī)酸之間的糖苷鍵,有助于將多酚從束縛型或結(jié)合型的共軛酚類(lèi)中釋放出來(lái),有效改善總酚的提取[22]。本研究中SY-LK酸面團(tuán)組總酚含量最高,為23.57 mg/g。同時(shí)酵母菌代謝消耗氧氣,降低氧化酶氧化酚類(lèi)物質(zhì)的能力[23],所以混菌發(fā)酵后總酚含量提高。而濕熱-混菌發(fā)酵的總酚含量居中,可能是兩者作用相互抵消的結(jié)果,且發(fā)酵作用大于濕熱作用。

圖1 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)白蕓豆酸面團(tuán)總酚含量的影響

2.3 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)面包面團(tuán)微觀結(jié)構(gòu)的影響

由于白蕓豆粉的加入稀釋了面筋蛋白,限制了面筋網(wǎng)絡(luò)的形成,所以對(duì)照組中面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)稀疏,出現(xiàn)明顯斷裂,許多淀粉顆粒暴露甚至溶出(圖2-a)。經(jīng)過(guò)HMT或混菌發(fā)酵作用后,面包面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密連續(xù),暴露或溶出的淀粉顆粒較少(圖2-b、c和e)。原因在于HMT使蕓豆蛋白發(fā)生變性,所以蛋白對(duì)小麥面筋的稀釋作用減弱,面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)破壞變小。此外,淀粉外部的壓力和加熱會(huì)導(dǎo)致相對(duì)松散的顆粒變成致密的顆粒,這些致密淀粉顆粒不易溶出,降低了α-淀粉酶與底物之間的可及性[4],進(jìn)而降低淀粉消化率。而混菌發(fā)酵產(chǎn)生的大量乳酸可以通過(guò)在面筋和淀粉之間產(chǎn)生相互作用來(lái)降低淀粉消化速率[19]。相比于兩者單獨(dú)作用,共同作用后觀察到更加稠密的面筋網(wǎng)絡(luò),黃色區(qū)域明顯變多,且?guī)缀鯖](méi)有淀粉顆粒溶出(圖2-d、f),表明兩者聯(lián)合效應(yīng)使得蛋白和淀粉結(jié)合更緊密,增強(qiáng)了對(duì)α-淀粉酶的抗性。

a-SYB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和SYB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò);b-HYB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和HYB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò);c-SY-LKB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和SY-LKB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò);d-HY-LKB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和HY-LKB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò);e-SY-JKB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和SY-JKB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò);f-HY-JKB 蛋白網(wǎng)絡(luò)和HY-JKB 淀粉與蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.4 α-淀粉酶酶活的抑制作用

α-淀粉酶是淀粉消化吸收過(guò)程中重要的水解酶,抑制其活性可以減緩淀粉水解,降低餐后血糖水平[24]。如圖3所示,HMT和混菌發(fā)酵單獨(dú)或組合作用產(chǎn)生的還原糖含量均顯著低于對(duì)照組,說(shuō)明兩者作用都能抑制α-淀粉酶活性,通過(guò)公式計(jì)算其對(duì)α-淀粉酶的抑制能力。結(jié)果表明兩者對(duì)α-淀粉酶的抑制能力無(wú)顯著差異,但組合作用時(shí)抑制能力顯著大于單獨(dú)作用,其中濕熱-混菌發(fā)酵HY-LKB組抑制率最高,為64.11%。這一結(jié)果表明HMT和混菌發(fā)酵作用可能是通過(guò)對(duì)α-淀粉酶的抑制作用來(lái)降低面包的淀粉消化率和GI值。

圖3 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

2.5 白蕓豆酸面團(tuán)面包淀粉體外消化率

RS在小腸中不能被消化,對(duì)α-淀粉酶具有抗性,從而影響餐后血糖峰值和整體血糖反應(yīng)[25]。SYB組RS含量為16.51%,經(jīng)過(guò)濕熱處理后的HYB組RS含量達(dá)到19.54%；混菌發(fā)酵后SY-LKB組RS含量高達(dá)21.55%；濕熱-發(fā)酵組合作用的HY-LKB組RS含量最高,為23.40%。結(jié)果表明,濕熱處理或混菌發(fā)酵都能顯著提高RS含量,且兩者組合作用更佳?？赡苁且?yàn)?種作用都能改變白蕓豆淀粉結(jié)構(gòu),濕熱處理的高溫使大量支鏈淀粉分子鏈斷裂,形成短直鏈淀粉,這部分淀粉與原豆粉中直鏈淀粉在降溫過(guò)程中通過(guò)氫鍵連接形成RS[6]?；炀l(fā)酵代謝產(chǎn)生的乳酸可影響淀粉結(jié)晶區(qū)的比列,同樣導(dǎo)致大分子支鏈淀粉的斷裂和脫支,直鏈淀粉含量升高,進(jìn)一步形成RS[1]。

表3 白蕓豆面包中RDS、SDS和RS

由圖4曲線發(fā)現(xiàn)第1部分從0到60 min,消化速率快速增加,第2部分從60到180 min,緩慢達(dá)到最大平穩(wěn)水平。結(jié)果表明,白蕓豆面包淀粉體外消化率顯著低于小麥面包,HMT和混菌發(fā)酵在不同程度上都會(huì)降低淀粉消化率,其中混菌發(fā)酵的2組SY-LKB、SY-JKB低于HYB組。表明相比于濕熱處理,混菌發(fā)酵更有利于降低淀粉消化率。而濕熱-混菌發(fā)酵組合作用優(yōu)于兩者單獨(dú)作用,所以HY-LKB組的淀粉消化率最低,HY-JKB組次之,這與濕熱-混菌發(fā)酵酸面團(tuán)中高含量的總酚及RS有關(guān)。

圖4 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)白蕓豆面包淀粉體外消化率的影響

2.6 濕熱處理和混菌發(fā)酵對(duì)血糖指數(shù)(GI)的影響

由表4可知,相比于生蕓豆面包組,HMT和混菌發(fā)酵單獨(dú)作用組HI值降低了22%～28%,與RS、α-淀粉酶抑制率測(cè)定結(jié)果相一致,RS對(duì)α-淀粉酶具有一定的抗性[3]。

表4 白蕓豆面包水解90 min的水解率(H90),180 min平衡濃度(C∞),動(dòng)力學(xué)參數(shù)(k),水解指數(shù)(HI)以及血糖指數(shù)(GI)

且兩者組合作用后HI值進(jìn)一步降低,由HI計(jì)算得到的GI值有同樣的結(jié)果。此外,SY-LKB組HI和GI值顯著低于SY-JKB,這與LK組酸化作用強(qiáng)于JK組結(jié)果相符。乳酸是淀粉糊化過(guò)程中降低淀粉生物利用度的先決條件,在焙烤過(guò)程中乳酸促進(jìn)了淀粉和面筋相互作用,增強(qiáng)了α-淀粉酶的抗消化性,有利于降低淀粉消化率[19]。HY-LKB與HY-JKB組RS含量相似,但HI,GI值表現(xiàn)出顯著差異,這與HY-LKB組中更高含量的乳酸和酚類(lèi)物質(zhì)有關(guān)。酚類(lèi)物質(zhì)是α-淀粉酶的溫和抑制劑,可與α-淀粉酶分子上的親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成醌或內(nèi)酯[22],抗酶性增強(qiáng),從而降低淀粉消化率和GI值。不同處理后的白蕓豆面包GI值范圍為39.54～45.74,顯著低于生蕓豆面包。

3 結(jié)論

研究表明,濕熱-混菌發(fā)酵組合作用可以抑制α-淀粉酶,顯著降低白蕓豆面包淀粉消化率和GI值,且優(yōu)于兩者單獨(dú)作用。HMT改變了白蕓豆淀粉鏈結(jié)構(gòu),顯著提高RS含量?；炀l(fā)酵產(chǎn)生乳酸的同時(shí),不僅抵消了HMT對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的破壞,還提高了RS含量,濕熱-混菌發(fā)酵HY-LKB組RS含量最高(23.40%)。微觀結(jié)構(gòu)表明：HMT和混菌發(fā)酵都強(qiáng)化了面包面團(tuán)的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),同時(shí)HMT減少了淀粉顆粒的溶出,且兩者組合作用時(shí)面團(tuán)中淀粉和蛋白結(jié)合最緊密。乳酸、總酚和RS含量的增加都有利于抑制α-淀粉酶活性,進(jìn)一步降低面包的淀粉消化率和GI值。所以本研究中HY-LKB組α-淀粉酶酶活抑制率最高,為64.11%,而HI和GI值最低,分別為36.37%,39.54。但由于未采用體內(nèi)消化法測(cè)定白蕓豆面包淀粉消化率,測(cè)定的體外淀粉消化率只能作為參考數(shù)據(jù),后續(xù)需要進(jìn)一步深入探究。