郭振義，謝欣冉，李亞娟，劉亮潔，張麗靖，吳紹軒，張玲玲,2,王 師

( 1.中國(guó)海洋大學(xué)，海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 2660003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237 )

類固醇是一類具有甾核和生物活性的小分子親脂性化合物，其在性別分化、生殖、發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1-7]。孕酮、睪酮和雌二醇是3種主要的與動(dòng)物生殖調(diào)控相關(guān)的性類固醇激素。在脊椎動(dòng)物中，它們是以膽固醇為前體，由脫氫酶和細(xì)胞色素P450酶通過(guò)一系列催化羥基化和脫羥基氧化反應(yīng)合成的[8]。軟體動(dòng)物也存在性類固醇激素，已有報(bào)道通過(guò)高效液相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方法在雙殼綱、腹足綱動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到了孕酮、睪酮、雌二醇等的存在[9-12]。同時(shí)研究顯示，性類固醇激素參與紫貽貝(Mytilusgalloprovincialis)[6]、砂海螂(Myaarenaria)[13]等的生殖調(diào)控。但關(guān)于性類固醇激素在軟體動(dòng)物中是否存在合成、轉(zhuǎn)化、運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程，目前所知甚少。

蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)是一種雙殼類軟體動(dòng)物，在中國(guó)、韓國(guó)、日本、俄羅斯薩哈林島均有分布，已在東北亞形成規(guī)?；B(yǎng)殖。自2000年以來(lái)，蝦夷扇貝全球年產(chǎn)值已超過(guò)15億美元。鑒于蝦夷扇貝在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的重要地位，目前已有大量關(guān)于蝦夷扇貝性腺發(fā)育、繁殖規(guī)律的研究報(bào)道[14-17]。謝欣冉等[18]發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝精巢和卵巢中的孕酮、睪酮和雌二醇含量變化隨性腺發(fā)育呈現(xiàn)出一定的規(guī)律，推測(cè)其在配子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。筆者分析蝦夷扇貝7個(gè)成體組織中3種常見(jiàn)的性類固醇激素(孕酮、睪酮和雌二醇)的含量分布，以期為理解性類固醇激素在軟體動(dòng)物中的合成與轉(zhuǎn)化過(guò)程提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2齡蝦夷扇貝于2015年2月和10月取自山東省萊州市海益養(yǎng)殖廠，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后置于過(guò)濾海水中暫養(yǎng)24 h。每次挑選40個(gè)活力良好的樣品(雌雄各20個(gè))，手術(shù)刀割開(kāi)蝦夷扇貝閉殼肌，用去掉針頭的無(wú)菌1 mL注射器，自閉殼肌割裂處吸取血淋巴，4 ℃放置1 h后，3000 r/min離心10 min，吸取上清液，以備激素測(cè)定。同時(shí)，取適量的腎、肝胰腺、鰓、外套膜、閉殼肌和性腺，用吸水紙吸干組織塊表面海水后，于液氮中快速冷凍，保存于-80 ℃，用于激素提取。

1.2 性類固醇激素提取

采用二氯甲烷液液萃取法進(jìn)行激素提取，步驟如下：取0.1 g上述組織樣品，用預(yù)冷的0.5 mL超純水勻漿2次，每次2 min；使用超聲波細(xì)胞破碎儀將組織勻漿破碎(200 W,超聲10 s，暫停5 s，共3 min)；加入400 μL預(yù)熱的HCl(25 mmol/L),渦旋2 min，之后40 ℃水浴孵育15 min；孵育結(jié)束后，加入1.25 mL Na2HPO4(0.07 mol/L)，向勻漿液中加入14 mL二氯甲烷，渦旋2 min，之后將勻漿液于6000 r/min離心10 min，使水與有機(jī)相分離，使用巴斯德管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中；向殘留有上層無(wú)機(jī)相的離心管中再次加入14 mL二氯甲烷，渦旋2 min，之后6000 r/min離心10 min，使用巴斯德管將下層有機(jī)相轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中；使用氮吹儀在室溫將有機(jī)相中二氯甲烷吹干獲得的固態(tài)殘留物，用500 μL激素測(cè)定試劑盒中的EIA buffer溶解。

1.3 性類固醇激素測(cè)定

用美國(guó)Cayman公司的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒測(cè)定蝦夷扇貝各成體組織中孕酮、睪酮和雌二醇的含量，流程參照試劑盒中的說(shuō)明書(shū)。每個(gè)樣品設(shè)2個(gè)技術(shù)重復(fù)，用Cayman公司提供的ELISA Double表格計(jì)算樣品中的激素含量。類固醇含量定義為每克濕質(zhì)量的類固醇質(zhì)量(ng/g)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

蝦夷扇貝不同組織中性激素的差異顯著性采用單因素方差分析法分析；雌雄個(gè)體的各組織中性激素的差異顯著性使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；將所測(cè)得的3種激素含量進(jìn)行以2為底的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，通過(guò)Pearson相關(guān)分析法分析3種激素的相關(guān)性。顯著性水平均設(shè)定為0.05。以上分析均使用SPSS 21.0軟件計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 成體各組織中3種性類固醇激素的含量分布

在蝦夷扇貝成體各組織中，孕酮的含量為2.09～13.94 ng/g，其中血淋巴的孕酮含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他各成體組織，其次為肝胰腺，閉殼肌中含量最低；睪酮的含量為0.29～2.51 ng/g，血淋巴中含量最高，其次為腎、肝胰腺和性腺，閉殼肌中含量最低；各組織中雌二醇的含量為0.96～8.01 ng/g，血淋巴中含量最高，其次為腎和性腺，肝胰腺中含量最低。3種激素總含量在不同成體組織中的變化為3.27～24.45 ng/g，血淋巴中含量最高，閉殼肌中含量最低。

分析孕酮、睪酮、雌二醇相對(duì)于性類固醇激素的百分比，在扇貝大部分組織中，上述3種激素分別約占性類固醇激素總含量的60%、10%和30%，但在肝胰腺中孕酮占比高達(dá)80%(圖1)。

分析孕酮、睪酮和雌二醇含量之間的相關(guān)性(圖2)。在蝦夷扇貝個(gè)體中，3種激素含量均呈顯著正相關(guān)：孕酮與睪酮的相關(guān)性最高(r=0.89，P<0.01)、其次是雌二醇與睪酮(r=0.83，P<0.01)、孕酮與雌二醇的相關(guān)系數(shù)稍低(r=0.70，P<0.01)。

圖2 蝦夷扇貝成體各組織中3種性類固醇激素之間的相關(guān)性Fig.2 Correlation among the three sex steroids in the adult tissues of Yesso scallop P. yessoensis

2.2 性類固醇激素組織分布的雌雄差異

分析性類固醇激素在雌、雄個(gè)體不同組織間的差異(圖3)。雄性個(gè)體的血淋巴、肝胰腺和閉殼肌中孕酮含量顯著高于雌性個(gè)體(P<0.05)，肝胰腺中的差異最大，閉殼肌中的差異較小(圖3a)；在所有成體組織中，雄性個(gè)體所含睪酮量均高于雌性個(gè)體，并且在血淋巴、鰓、外套膜、肝胰腺和閉殼肌中呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)(圖3b)；在血淋巴和閉殼肌中，雄性個(gè)體的雌二醇含量顯著高于雌性個(gè)體(P<0.05)，其他組織中雌雄差異不顯著(圖3c)。

圖3 性類固醇激素在蝦夷扇貝雌、雄個(gè)體各組織中的含量Fig.3 Sex steroid concentrations in the tissues of male and female Yesso scallop P. yessoensis所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤 (n=3);*表示雌性個(gè)體和雄性個(gè)體間存在顯著差異(P<0.05)；下同.Each value is represented as mean±SE (n=3); * indicates significant differences between male and female (P<0.05)； et sequentia.

孕酮、睪酮、雌二醇相對(duì)于性類固醇激素總含量的百分比在雌雄個(gè)體間的差異大多不顯著，但存在一定規(guī)律：除肝胰腺外，雌性個(gè)體的孕酮比例均略高于雄性個(gè)體；在所有檢測(cè)的組織中，雄性個(gè)體的睪酮占比均高于雌性個(gè)體，在外套膜中差異顯著(P<0.05)；在大部分組織中，雄性個(gè)體的雌二醇占比高于雌性個(gè)體，但是在肝胰腺和性腺中則相反，雌性個(gè)體的雌二醇占比高于雄性個(gè)體。

進(jìn)一步探究了各成體組織中睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮在雌、雄個(gè)體間的差異(圖4)。雄性個(gè)體各成體組織中睪酮/孕酮均高于雌性個(gè)體，在鰓和外套膜中差異顯著(P<0.05)(圖4a)。雌二醇/睪酮在除鰓以外的組織中均是雌性個(gè)體高于雄性個(gè)體，在肝胰腺和性腺中差異顯著(P<0.05)，雌性的值分別為雄性的1.77和1.83倍(圖4b)。雌二醇/孕酮在大部分成體組織中呈現(xiàn)雄性個(gè)體高于雌性個(gè)體，但僅在鰓中差異顯著(P<0.05)(圖4c)。

圖4 睪酮/孕酮、雌二醇/睪酮和雌二醇/孕酮比值在蝦夷扇貝雌、雄個(gè)體各組織中的水平Fig.4 The levels of testosterone/progesterone, estradiol/testosterone and estradiol/progesterone in the adult tissues of male and female Yesso scallop P. yessoensis

3 討 論

3.1 不同物種成體組織中性激素水平的差異

ELISA試劑盒法是目前軟體動(dòng)物性類固醇激素含量檢測(cè)最常用的方法，已被廣泛應(yīng)用于貽貝[19]、牡蠣[20]、扇貝[21]、蛤[22]等的性激素測(cè)定。筆者采用ELISA試劑盒檢測(cè)了蝦夷扇貝各成體組織中孕酮、睪酮和雌二醇的含量，其中血淋巴中雌二醇的平均含量為8.01 ng/g、睪酮含量為2.51 ng/g、孕酮含量為13.94 ng/g。與菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[23]和中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[24]血淋巴中的激素含量相比，蝦夷扇貝血淋巴中性類固醇激素的含量要高于二者。

蝦夷扇貝肝胰腺中雌二醇的平均含量為0.96 ng/g、睪酮含量為0.82 ng/g、孕酮含量為7.13 ng/g；在中國(guó)明對(duì)蝦的肝胰腺中，孕酮平均含量為0.90 ng/g，雌二醇含量為0.22 ng/g[24]?？梢?jiàn)孕酮含量高于雌二醇，這在蝦夷扇貝和中國(guó)明對(duì)蝦中均存在，并且蝦夷扇貝肝胰腺中的性類固醇激素含量稍高于中國(guó)明對(duì)蝦。

3.2 軟體動(dòng)物性類固醇激素的合成與轉(zhuǎn)化

已有研究報(bào)道，軟體動(dòng)物可以從環(huán)境中吸收孕酮[25]，并在肝胰腺(有時(shí)稱為“消化腺”)進(jìn)一步代謝[26]。本試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，蝦夷扇貝肝胰腺中孕酮含量占性類固醇激素總含量的比例顯著高于其他組織，支持肝胰腺可能是合成或吸收孕酮的場(chǎng)所。同時(shí)研究顯示，蝦夷扇貝血淋巴中3種性類固醇激素的含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成體組織，提示性類固醇激素可能在血淋巴中積累，并運(yùn)送至其他組織。

在脊椎動(dòng)物中存在著孕酮轉(zhuǎn)化為睪酮，睪酮再通過(guò)芳香化酶的作用轉(zhuǎn)化為雌二醇的過(guò)程[27]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，蝦夷扇貝的3種激素(孕酮、睪酮和雌二醇)含量之間均呈顯著正相關(guān)，表明蝦夷扇貝可能存在著類似于脊椎動(dòng)物3種激素的轉(zhuǎn)化過(guò)程。在雙殼類中，孕酮也被認(rèn)為是雌雄激素的前體，在生殖周期中起重要調(diào)節(jié)作用[28]。此外，研究者在多種軟體動(dòng)物中均檢測(cè)到了3種激素轉(zhuǎn)化過(guò)程相關(guān)酶的活性：在Aplysiadepilans中檢測(cè)到了3β-羥基類固醇脫氫酶復(fù)合物活性[29]，在Ruditapesdecussata和紫貽貝中檢測(cè)到5α-還原酶活性[30-31]，在大羊角螺(Marisacornuarietis)中檢測(cè)到17β-羥基類固醇脫氫酶活性[32]。近期研究顯示，蝦夷扇貝體內(nèi)存在較為完整的性激素合成通路，提示蝦夷扇貝具有合成孕酮、睪酮等激素的能力[33]。綜上所述，軟體動(dòng)物中可能存在著類似于脊椎動(dòng)物性類固醇激素的合成過(guò)程。

盡管負(fù)責(zé)脊椎動(dòng)物雌二醇轉(zhuǎn)化的芳香化酶編碼基因Cyp19A僅在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，雌二醇/睪酮在蝦夷扇貝雌雄性腺之間具有較大差異，提示扇貝性腺中存在雌二醇轉(zhuǎn)化相關(guān)酶。這與謝欣冉等[18]的觀點(diǎn)一致，即蝦夷扇貝和櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)性腺可能都具有催化睪酮向雌二醇轉(zhuǎn)化的能力。此外近期的同位素試驗(yàn)也證實(shí)，Mytilustrossulus[34]體內(nèi)存在將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的酶，且卵巢中的芳香化效率高于精巢。由此可見(jiàn)，芳香化酶活性可能廣泛存在于雙殼類動(dòng)物，該類群動(dòng)物具有體內(nèi)合成雌激素的能力。

4 結(jié) 論

通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)了蝦夷扇貝成體各組織中孕酮、睪酮和雌二醇的含量，初步推測(cè)孕酮可在扇貝肝胰腺中合成或吸收；此外，3種激素均在血淋巴中積累，并可能存在類似脊椎動(dòng)物的孕酮→睪酮→雌二醇轉(zhuǎn)化過(guò)程。負(fù)責(zé)睪酮轉(zhuǎn)化為雌二醇的芳香化酶編碼基因Cyp19A雖然僅存于脊椎動(dòng)物，但由于蝦夷扇貝卵巢中雌二醇/睪酮高于精巢，這為軟體動(dòng)物中芳香化酶活性的存在提供了證據(jù)。本試驗(yàn)結(jié)果將有助于深入理解軟體動(dòng)物性類固醇激素的合成與轉(zhuǎn)化過(guò)程。