常恒禎，常江，戰(zhàn)俊澎，楊馨，郭珣，劉益辛，鄒德穎，2，任洪林

1.吉林大學人獸共患病研究教育部重點實驗室／動物醫(yī)學學院／人獸共患病研究所，吉林長春130062；2.遼寧省盤錦檢驗檢測中心，遼寧盤錦124000

目前應用最廣泛的重組蛋白表達系統(tǒng)為E.coli原核表達［1］，但由于蛋白表達速度過快、不正確折疊或多肽鏈疏水區(qū)域間非特異性相互作用等原因［2］，該系統(tǒng)表達的蛋白多以無活性的包涵體形式存在，難以獲取可溶性目的蛋白［3］。目前，多通過縮短表達時間及降低IPTG濃度來降低包涵體表達量［4］；另有研究在培養(yǎng)基中加入金屬離子，或使用麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein，MBP）標簽等增加可溶性表達［5-6］。但這些方法均未達到理想效果，部分蛋白仍穩(wěn)定表達于包涵體中，且表達量較低，另外，制備抗體不宜加入MBP標簽蛋白，因其可能干擾目標蛋白的正確結構和功能［7］，且不保證可溶性蛋白正確折疊［8］。

因此，增加包涵體蛋白的表達量及純化量顯得尤為重要。本研究通過優(yōu)化包涵體蛋白表達條件及對3種常用包涵體純化方法（切膠、包涵體復性及Ni-NTA親和層析純化）進行比較，獲得最佳表達及純化方法，以期提高包涵體表達量及可溶性蛋白純化量。

1 材料與方法

1.1 菌株及質粒 感受態(tài)E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL購自上海唯地生物技術有限公司；全長IL-1β與全長IL-1Ra重組質粒［9］（以下簡稱IL-1β-1Ra-2重組質粒）、全長IL-1Ra重組質粒由吉林大學人獸共患病細菌室保存。

1.2 主要試劑 IPTG購自北京博奧拓科技有限公司；KCl、NaH2PO4及Na2HPO4購自北京化工廠有限責任公司；EDTA、Tris、Urea購自廣州賽囯生物科技有限公司；蛋白預染marker購自北京聚合美生物科技有限公司；BSA標準蛋白購自北京索萊寶科技有限公司；小鼠抗His標簽單克隆抗體購自北京義翹神州科技有限公司；PEG 20000購自北京索萊寶科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自美國Immunoway公司。

1.3 溶液配制

1.3.1 包涵體復性純化試劑 TE緩沖液：20 mmol／L Tris，1mmol／LEDTA，pH 8.5；洗滌緩沖液Ⅰ：20mmol／L Tris、1 mmol／L EDTA，1%TritonX-100，pH 8.5；洗滌緩沖液Ⅱ：20 mmol／L Tris，1 mmol／L EDTA，1%TritonX-100，2 mol／L Urea，pH 8.5；變性緩沖液：20mmol／LTris，10mmol／LEDTA，8mol／LUrea，pH 9.5；復性緩沖液Ⅰ~Ⅳ：2 mmol／L GSH，0.2 mmol／L GSSG，20 mmol／L Tris，等差數(shù)列依次加入6、4、2、0 mol／L Urea，pH均為9.5。

1.3.2 Ni-NTA親和層析純化試劑 Buffer A：2 mol／L Urea，20 mmol／L Tris，0.3 mol／L NaCl，1%Triton-X100，1 mmol／Lβ-巰基乙醇，pH 8.0；Buffer B~E：100 mmol／L NaH2PO4，10 mmol／L Tris·Cl、8 mol／L Urea（pH分別為：8.0、6.3、5.9、4.5）；平衡緩沖液：50 mmol／L NaH2PO4、300 mmol／L NaCl，10 mmol／L imidazole，pH 8.0。

1.4 包涵體蛋白表達條件的優(yōu)化

1.4.1 感受態(tài)菌株 將10μLIL-1β-1Ra-2重組質粒和全長IL-1Ra重組質粒分別轉化至感受態(tài)E.coli BL21（DE3）、E.coli BL21（DE3）PLysS及E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL中，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h；挑取單菌落，接種于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，165 r／min振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，進行15%SDS-PAGE分析，同時以未誘導菌為對照。

1.4.2 IPTG誘導濃度 將10μL IL-1β-1Ra-2重組質粒和全長IL-1Ra重組質粒分別轉化至感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h；挑取單菌落，接種于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，165 r／min振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6時，加入IPTG至終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol／L，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，進行15%SDS-PAGE分析。

1.4.3 誘導溫度 將10μL IL-1β-1Ra-2重組質粒和全長IL-1Ra重組質粒分別轉化至感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL，涂布于含卡那霉素（100μg／mL）的LB固體培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h；挑取單菌落，接種于含卡那霉素（100μg／mL）的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃，165 r／min振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6時，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，分別于16和37℃，165 r／min培養(yǎng)8 h；取2 mL菌液，于4℃，13 460×g離心2 min，收集菌體，超聲破碎，分別收集上清和沉淀，進行15%SDS-PAGE分析。

1.5 包涵體蛋白的純化 采用最佳蛋白表達條件對IL-1β-1Ra-2重組質粒進行誘導表達，當菌液A600達0.8時，收菌，進行蛋白純化。

1.5.1 切膠純化 菌體經15%SDS-PAGE分離后，將蛋白膠加入0.25 mol／L KCl溶液至完全浸泡，4℃反應5 min，切下目的條帶放入透析袋，加常規(guī)電泳液至完全浸泡目的條帶，密封，置放有冰水混合物的電泳槽中，于70 V電壓下作用2 h；置4℃，0.01 mol／L的PBS中透析6 h；4℃，6 080×g離心30 min，取上清，進行15%SDS-PAGE分析。

1.5.2 包涵體復性純化 用0.01 mol／L的PBS將菌體沉淀洗滌3次，按菌體濕重與TE緩沖液1∶80（質量 ∶體積）的比例加入TE緩沖液，充分混勻，超聲破碎，收集包涵體沉淀。將包涵體濕重與洗滌緩沖液Ⅰ按1∶50（質量 ∶體積）的比例加入洗滌緩沖液Ⅰ，于室溫，200 r／min攪拌洗滌2 h；4℃，6 080×g離心40 min，收集包涵體沉淀（重復該步驟1次）；相同條件下采用洗滌緩沖液Ⅱ洗滌包涵體1次，溶解于變性緩沖液中，于室溫下120 r／min攪拌過夜；25℃，6 080×g離心30 min，收集上清，即變性包涵體。將變性包涵體裝入透析袋中，依次浸入復性緩沖液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ中進行復性（變性液與復性緩沖液的體積比為1∶100），于4℃層析柜中緩慢攪拌，每次透析6~12 h；再置0.01 mol／L的PBS緩沖液（pH 7.4）中透析6 h；4℃，6 080×g離心30 min，取上清。取各步驟樣品進行15%SDS-PAGE分析。

1.5.3 Ni-NTA親和層析純化 收集沉淀，按每克菌體濕重加入80 mL Buffer A重懸，超聲破碎，收集包涵體沉淀；用30 mLBuffer A洗滌2次，6 080×g離心30 min；收集包涵體沉淀，按每克濕重加入50 mL Buffer B，室溫渦旋溶解2 h（或緩慢攪拌過夜）至溶液為半透明；25℃，6 080×g離心30 min，取上清液。將鎳柱用5~10倍柱體積的平衡緩沖液平衡柱體，待流穿后，加入4倍柱體積的上清液，于室溫，200 r／min混合1~2 h；流穿后分別用4倍柱體積Buffer C洗滌2次、0.5倍柱體積Buffer D洗脫4次、0.5倍柱體積Buffer E洗脫4次；收集洗脫液，于含6~0 mol／L Urea的Tris緩沖液中透析6~12 h，再置0.01 mol／L的PBS中透析6 h；4℃，6 080×g離心30 min，取上清。取各步驟樣品進行15%SDS-PAGE分析。

1.6 純化方法的驗證 采用最佳蛋白表達條件對IL-1β-1Ra-2重組質粒和全長IL-1Ra重組質粒進行誘導表達，當菌液A600達0.8時，收菌，采用最佳純化方法進行純化。通過Bradford法測定蛋白濃度，計算蛋白量。純化產物經15%SDS-PAGE分離蛋白后，轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶于4℃封閉12 h；加入小鼠抗His標簽單克隆抗體（1∶2 000稀釋），于37℃孵育1 h；用PBST洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶4 000稀釋），用PBST洗滌4次，ECL法顯色。

2 結果

2.1 最佳蛋白表達條件

2.1.1 感受態(tài)菌株 IL-1β-1Ra-2重組質粒轉化感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL后可見相對分子質量約10 560的目的蛋白條帶，大小與預期相符，轉化其他兩種感受態(tài)菌株后均未見該目的蛋白條帶；全長IL-1Ra重組質粒轉化3種感受態(tài)菌株后可見相對分子質量約19 770的目的蛋白條帶，大小與預期相符。見圖1（全長IL-1Ra重組質粒以感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plu（sDE3）-RIPL為例，其他略）。因此確定采用感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL進行后續(xù)試驗。

圖1 轉化感受態(tài)菌株的優(yōu)化Fig.1 Optimization of competent strains

2.1.2 IPTG終濃度 經不同IPTG終濃度誘導的IL-1β-1Ra-2重組蛋白及IL-1Ra重組蛋白產物均可見相對分子質量約10 560和19 770的目的蛋白條帶，大小與預期相符。當IPTG終濃度為1 mmol／L時，IL-1β-1Ra-2重組蛋白表達量最高；IPTG終濃度為0.4 mmol／L時，IL-1Ra重組蛋白的表達量最高。見圖2。因此，確定IL-1β-1Ra-2重組質粒及全長IL-1Ra重組質粒最佳IPTG終濃度分別為1和0.4 mmol／L。

圖2 IPTG終濃度的優(yōu)化Fig.2 Optimal of final concentration of IPTG

2.1.3 誘導溫度 IL-1β-1Ra-2重組質粒于16℃誘導時，未表達；37℃誘導時，可見相對分子質量約10 560的目的蛋白條帶，大小與預期相符，于包涵體中表達；全長IL-1Ra重組質粒于16及37℃誘導時，均可見相對分子質量約19 770的目的蛋白條帶，大小與預期相符，可穩(wěn)定表達于包涵體中，37℃的表達量更高。見圖3。因此確定IL-1β-1Ra-2重組質粒及全長IL-1Ra重組質粒最佳誘導時間均為37℃。

圖3 誘導溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of temperature for induction

2.2 包涵體的純化

2.2.1 切膠純化 切膠純化濃度極低，濃縮后才可見相對分子質量約10 560的目的蛋白條帶，大小與預期相符，純化回收量約為5.1 mg。由于蛋白回收量過少，條帶顏色較淺，見圖4。因此，切膠純化法不適用于大批量生產。

圖4 切膠純化產物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profile of purified product by gel cutting

2.2.2 包涵體復性純化 包涵體變性、復性及純化產物中均可見相對分子質量約為10 560的目的蛋白條帶，大小與預期相符，見圖5。表明洗滌過程中未過多消耗目的蛋白，且能去除90%以上的雜帶。目的蛋白于變性緩沖液中溶解率可達85%以上，純化后蛋白純化回收量約為46 mg。

圖5 包涵體復性純化產物的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE profile of renaturalized and purified products

2.2.3 Ni-NTA親和層析純化 包涵體溶解后可見相對分子質量約為10 560的目的蛋白條帶，大小與預期相符；流穿后洗脫，目的蛋白回收量較低，約為1.2 mg。見圖6。

圖6 Ni-NTA親和層析純化產物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE profile of purified product by Ni-NTA affinity chromatography

綜上所述，包涵體復性純化蛋白回收量最高，因此選擇包涵體復性純化作為最佳純化方法。

2.3 純化方法的驗證 IL-1β-1Ra-2重組蛋白及全長IL-1Ra重組蛋白包涵體復性純化產物于相對分質量約10 560和19 770可見目的蛋白條帶，且?guī)缀鯚o雜帶，純度可達90%以上，可溶性蛋白回收量分別約為46及63 mg，見圖7；且均可與鼠抗His標簽單克隆抗體發(fā)生特異性結合，且于相對分子質量約10 560和19 770處可見特異性結合條帶，見圖8。圖中未誘導組出現(xiàn)較弱條帶，是目的蛋白在未誘導條件下的本底表達。

圖7 最佳方法純化產物的SDS-PSGE分析Fig.7 SDS-PAGE profile of purified product by optimal method

圖8 最佳方法純化產物的Western blot檢測Fig.8 Western blotting of purified product by optimal method

3 討論

感受態(tài)E.coli BL21（DE3）pLysS相較于E.coli BL21（DE3）具有降低目的基因背景表達水平的特點，但對IPTG誘導表達無明顯影響。感受態(tài)E.coliBL21-Codon Plus（DE3）-RIPL與E.coli BL21（DE3）pLysS及E.coli BL21（DE3）比較，具有減少重組蛋白的降解、提高外源基因在原核系統(tǒng)中表達水平等特點，更利于非高表達重組蛋白的誘導表達。本實驗結果表明，感受態(tài)E.coli BL21-Codon Plus（DE3）-RIPL可改善相對分子質量約10 000的重組蛋白難以在E.coli中穩(wěn)定表達，需融合表達至大型蛋白（如MBP和GST）后才可穩(wěn)定表達［10］的問題，并可獲得更高產量［11］。

本研究對3種常用包涵體純化方法進行了比較。在切膠純化方法中，根據(jù)目的蛋白大小及其表達量，選擇可游離出目的蛋白的最適電壓和反應時間，但蛋白可溶性回收量較低，若以變、復性增加回收目的蛋白的可溶性，則失去其高效、成本低等特點。有文獻表明，KCl染色切膠純化法不適用于純化低表達量蛋白［12］，與本實驗結果一致。本實驗Ni-NTA親和層析純化中，蛋白純化采用變性后過鎳柱再復性的方法，但洗脫后回收量較低，與王曉娟［13］的實驗結果一致。這可能與溶解緩沖液pH及溶解效果欠佳等有關，也可能與蛋白表達量較低、相對分子質量較小有關。Ni-NTA親和層析純化法中的Buffer B與包涵體復性純化法中的變性緩沖液同用于包涵體的溶解，通過兩者對比發(fā)現(xiàn)，不易與重金屬離子發(fā)生沉淀的TE緩沖液溶解效果明顯優(yōu)于磷酸鹽緩沖液。在包涵體純化過程中，有些蛋白的活性狀態(tài)需要有金屬離子，而有些蛋白含有半胱氨酸（如IL-1β-1Ra-2重組蛋白），應添加EDTA，減少金屬離子，以保證游離巰基活性［14］，從而減少沉淀的發(fā)生。包涵體復性純化中，通過前期多次大量純化，發(fā)現(xiàn)蛋白純度的高低主要取決于洗滌緩沖液Ⅰ和洗滌緩沖液Ⅱ各自洗滌的時間和次數(shù)，對于高表達量的蛋白應適當增加洗滌次數(shù)。不穩(wěn)定的蛋白質可加入適量甘油，增加復性時的重折疊率［15］。另外，正確的半胱氨酸殘基自發(fā)結合需要弱氧化條件，但非正確狀態(tài)下則需要更強的氧化條件（如比率為10∶1的GSH∶GSSG）來達到最佳的天然構象［16］。本實驗通過包涵體復性純化法復性后，蛋白重折疊效果良好，無過多沉淀析出。

綜上所述，在相同表達條件下，包涵體復性純化法優(yōu)于Ni-NTA親和層析和切膠純化法，更易獲得高純度和高回收量的可溶性蛋白，適用于相對分子質量約10 000的非高表達包涵體蛋白的純化。