王沛琦，胡尊紅，胡學(xué)禮，劉旭云，楊 謹(jǐn)，李文昌

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南昆明650205）

鎘（Cd）是毒性最強(qiáng)的重金屬之一[1]，其具有極高的遷移性和生物可利用性，Cd 在植物體內(nèi)累積會(huì)對(duì)其造成極大的毒害，并使作物減產(chǎn)；同時(shí)Cd 進(jìn)入食物鏈后還會(huì)直接危害人類健康[2-3]。許多研究表明，植物產(chǎn)生的有機(jī)酸在植物外部排斥Cd 和內(nèi)部耐受Cd 的機(jī)制中起著重要的作用[4-5]。植物體內(nèi)或根系環(huán)境中的有機(jī)酸含有1 個(gè)或多個(gè)羧基，其作為重金屬元素的配基，與重金屬配位結(jié)合，改變重金屬的形態(tài)，降低重金屬的毒性等[6-8]。PINTO 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫下玉米主要產(chǎn)生檸檬酸，高粱主要產(chǎn)生蘋果酸，這些有機(jī)酸與Cd 發(fā)生絡(luò)合沉淀，變成低毒或無毒的Cd 絡(luò)合物，減少了Cd 對(duì)根系的毒害性，進(jìn)而提高了植物的耐受機(jī)制。秦麗等[10]研究表明，隨著Cd 脅迫濃度的增加以及脅迫時(shí)間的延長，續(xù)斷菊根部合成的有機(jī)酸總量均呈上升趨勢(shì)，說明植物可以通過調(diào)節(jié)根系分泌物來改變根際狀態(tài)以適應(yīng)Cd 的脅迫，減輕Cd 對(duì)植物的傷害。孫瑞蓮等[11]研究認(rèn)為，葉片中的有機(jī)酸含量與其Cd 生物積累量有關(guān)，其中，酒石酸、檸檬酸和乙酸可以指示不同生育期龍葵葉片中鎘的積累量。可見，Cd 脅迫會(huì)刺激植物產(chǎn)生有機(jī)酸，與進(jìn)入植物體內(nèi)的Cd 進(jìn)行絡(luò)合，進(jìn)而提高植物的抗性。目前，有關(guān)蓖麻對(duì)重金屬Cd 的吸收及Cd 脅迫下蓖麻體內(nèi)有機(jī)酸含量對(duì)Cd積累調(diào)控的研究相對(duì)較少。

本研究以前期篩選出來的耐Cd 蓖麻品種滇蓖2 號(hào)為材料，采用盆栽試驗(yàn)，分析了蓖麻根及葉片中草酸、蘋果酸、檸檬酸3 種有機(jī)酸的含量差異及其與植株中鎘積累的關(guān)系，以期評(píng)價(jià)有機(jī)酸在蓖麻Cd 積累與解毒過程中的作用，為Cd 污染農(nóng)田土壤的修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為宿生耐鎘蓖麻品種滇蓖2 號(hào)，由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育。

試驗(yàn)土壤取自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院老樓耕作層（0～20 cm）的土壤，土壤類型為紅壤土，其基本理化性質(zhì)如表1 所示。

表1 供試土壤理化性質(zhì)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019 年在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所溫室進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。每個(gè)花盆裝風(fēng)干過篩土20 kg，以分析純 CdCl2·2.5 H2O 為處理劑，設(shè) 6 個(gè) Cd2+質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平，分別為 0（CK）、20、50、100、200、300 mg/kg，共 6 個(gè)處理，每個(gè)處理 3 個(gè)重復(fù)，共 18 盆。CdCl2·2.5 H2O 與風(fēng)干土充分混勻裝盆后，靜置平衡20 d[11]。選取成熟飽滿的蓖麻種子經(jīng)10%次氯酸鈉消毒，用溫水浸泡24 h 后，每盆播種6 粒，出苗后每盆定苗3 株，正常水分管理。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生物量測(cè)定 Cd 脅迫60 d 后，對(duì)蓖麻植株的株高、根長、側(cè)根數(shù)、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。待其自然陰干后對(duì)其干質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 體內(nèi)有機(jī)酸測(cè)定 Cd 脅迫60 d 后，分別稱取去葉脈的新鮮干凈葉片和根0.5 g，加入2 mL0.5 mol/L的HCl 研磨成勻漿，于60 ℃水浴中提取l h；勻漿離心后取上清液過濾，定容至50 mL，4 ℃保存。采用外標(biāo)法測(cè)定植物體內(nèi)與重金屬螯合的3 種主要有機(jī)酸（草酸、蘋果酸、檸檬酸）的含量[12]。HPLC 液相條件：Agilent 1 100 高效液相色譜儀，Kromasil C18 反相色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm），流動(dòng)相為10 mmol/L 磷酸二氫鈉（用磷酸調(diào)節(jié)溶液pH為 2.8），進(jìn)樣量為 10 μL，流速為 0.8 mL/min，柱溫25 ℃，走樣時(shí)間為20 min，紫外波長214 nm。以草酸、蘋果酸、檸檬酸為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.3 植株重金屬Cd 含量測(cè)定 Cd 脅迫60 d 后，植物樣品（根、莖、葉）在105 ℃下殺青30 min，然后70 ℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，用電子天平分別稱量各部分干質(zhì)量。采用植物粉碎機(jī)粉碎樣品后過篩，備測(cè)。樣品采用濃硝酸－高氯酸（V濃硫酸∶V高氯酸＝4∶1）的混合液進(jìn)行微波消解后，定容并過濾，用原子火焰分光光度計(jì)對(duì)植株Cd 含量進(jìn)行測(cè)定[1]。

式中，C1、C2、C3、C4分別代表蓖麻根部、莖、葉及土壤的 Cd 含量（mg/kg）；M1、M2分別代表根部生物量（g）及蓖麻莖葉生物量（g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并作圖；用SPSS Statistics 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)（Duncan，P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd 脅迫對(duì)蓖麻植株生長的影響

從表2 可以看出，蓖麻植株的生長隨著Cd 脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，其中，株高、莖粗、根長、側(cè)根數(shù)、根干質(zhì)量及地上部分干質(zhì)量在低劑量（20 mg/kg）脅迫下與對(duì)照相比均增加，且差異達(dá)顯著水平（P＜0.05）；在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 時(shí)，株高、莖粗、根長、側(cè)根數(shù)、根干質(zhì)量及地上部分干質(zhì)量較20 mg/kg 有所下降，但株高、側(cè)根數(shù)、根干質(zhì)量及地上部分干質(zhì)量與對(duì)照相比有一定增加，莖粗、根長較對(duì)照相比有所下降，但差異不顯著；隨著Cd 脅迫質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高各指標(biāo)逐漸降低，在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 mg/kg 時(shí)達(dá)到最小值，較CK 分別下降了 68.33%、53.85%、51.73%、91.62%、92.19%及93.00%，與對(duì)照相比差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。綜上所述，蓖麻在Cd 脅迫下呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象。

表2 Cd 脅迫對(duì)蓖麻植株生長的影響

2.2 蓖麻對(duì)Cd 的富集特征

由表3 可知，蓖麻根、莖及葉中Cd 含量隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸增加；在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/kg 時(shí)，根、莖及葉中Cd 含量與對(duì)照相比差異不顯著，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 及以上時(shí)，根、莖及葉中Cd 含量大幅增加，蓖麻各組織富集Cd 的能力并無下降或趨于飽和的狀態(tài)，且與對(duì)照相比呈顯著差異（P＜0.05）。在Cd 脅迫時(shí)，蓖麻各組織Cd含量總體呈現(xiàn)出根＞莖＞葉。

表3 蓖麻對(duì)Cd 的富集和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)

從富集系數(shù)看，不同Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下，蓖麻根對(duì)Cd 的富集系數(shù)為1.28～4.33，均大于1，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 mg/kg 時(shí)，蓖麻根對(duì)Cd 的富集能力最強(qiáng)，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 時(shí)，蓖麻根對(duì)Cd 的富集能力最弱；蓖麻莖、葉對(duì)Cd 的富集系數(shù)均小于1，其中，當(dāng) Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 300 mg/kg 時(shí)，蓖麻莖對(duì)Cd 的富集能力最強(qiáng)，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg時(shí)，蓖麻莖對(duì)Cd 的富集能力最弱，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/kg 時(shí)，蓖麻葉對(duì)Cd 的富集能力最強(qiáng)，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為300 mg/kg 時(shí)，蓖麻葉對(duì)Cd 的富集能力最弱。從轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)看，不同濃度下蓖麻對(duì)Cd 的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)均小于1，說明在較高劑量的Cd 脅迫下，蓖麻由根向莖葉轉(zhuǎn)運(yùn)鎘的能力較弱，蓖麻將大部分Cd 積累在根部，限制Cd 向上轉(zhuǎn)移。

2.3 有機(jī)酸含量測(cè)定

3 種有機(jī)酸混合標(biāo)樣的HPLC 圖譜如圖1 所示，3 種有機(jī)酸待測(cè)樣品的圖譜如圖2 所示，3 種低分子量有機(jī)酸檢出的順序依次為草酸、蘋果酸、檸檬酸。通過外標(biāo)法建立的線性回歸方程為：草酸，y＝4.095 1x－16.41（R2＝0.999 9），保留時(shí)間為3.610 min；蘋果酸，y＝0.489 4x－0.956 4（R2＝0.999 5），保留時(shí)間為 5.707 min；檸檬酸，y＝0.159 9x＋1.533 6（R2＝0.999 4），保留時(shí)間為11.790 min。

2.4 Cd 脅迫對(duì)蓖麻3 種有機(jī)酸含量的影響

由圖3 可知，隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，蓖麻根部3 種有機(jī)酸含量變化明顯，草酸的含量隨著Cd質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高逐漸降低，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到300 mg/kg 時(shí)，草酸含量下降到20.73 mg/g，僅為對(duì)照的56.55%。蘋果酸、檸檬酸含量隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，蘋果酸在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 時(shí)達(dá)到最大，為0.69 mg/g，檸檬酸在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 mg/kg 時(shí)達(dá)到最大，為3.95 mg/g；當(dāng) Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到 300 mg/kg 時(shí)，蘋果酸、檸檬酸含量均下降到最低，分別為0.34、1.20 mg/g，分別為對(duì)照的84.47%和32.18%，檸檬酸的下降幅度大于蘋果酸。Cd 處理下，根部有機(jī)酸含量大小為草酸＞檸檬酸＞蘋果酸。

由圖4 可知，隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，蓖麻葉片中3 種有機(jī)酸的含量均呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 時(shí)3 種有機(jī)酸含量達(dá)最大，但上升幅度各不相同，草酸、蘋果酸、檸檬酸分別上升到7.59、6.76、28.05 mg/g；當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到300 mg/kg 時(shí)，草酸、蘋果酸、檸檬酸含量均下降到最低，分別為3.22、1.02、11.48 mg/g，分別為對(duì)照的97.57%、32.36%和59.53%，蘋果酸的下降幅度最大，其次是檸檬酸，且二者與對(duì)照間呈顯著差異，草酸下降幅度最小，與對(duì)照間差異不顯著。Cd 處理下，葉片有機(jī)酸含量大小為檸檬酸＞草酸＞蘋果酸。

2.5 蓖麻體內(nèi)Cd 含量與3 種有機(jī)酸含量的相關(guān)性分析

植物體內(nèi)有機(jī)酸主要是光合作用及呼吸作用的中間產(chǎn)物，受植物生長狀況的影響，有機(jī)酸在植物體內(nèi)重金屬的積累中發(fā)揮了較大作用[5]。本研究中，3 種有機(jī)酸在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100 mg/kg 時(shí)均表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，故以Cd 劑量為100 mg/kg 為分界點(diǎn)，對(duì)蓖麻體內(nèi)Cd 含量與3 種有機(jī)酸含量的相關(guān)性進(jìn)行分析。

從表4 可以看出，蓖麻3 種有機(jī)酸含量與不同器官的鎘含量之間存在顯著的相關(guān)性；當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜100 mg/kg 時(shí)，草酸與檸檬酸含量與根、莖、葉中Cd 含量呈顯著負(fù)相關(guān)，蘋果酸含量與根、莖、葉中Cd 含量呈顯著正相關(guān)。

表4 Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù) ＜100 mg/kg 時(shí)蓖麻體內(nèi)Cd 含量與根部有機(jī)酸含量的相關(guān)性

從表5 可以看出，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100 mg/kg時(shí)，草酸、檸檬酸及蘋果酸含量與根、莖、葉中Cd 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)。

表5 Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100 mg/kg 時(shí)蓖麻體內(nèi)Cd 含量與根部有機(jī)酸含量的相關(guān)性

蓖麻根、莖、葉Cd 含量與葉片有機(jī)酸含量的相關(guān)性如表6、7 所示。當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜100 mg/kg 時(shí)，草酸、蘋果酸與檸檬酸的含量與根、莖、葉中Cd 含量為極顯著正相關(guān)，其中，草酸與蘋果酸與根中Cd含量的相關(guān)系數(shù)最大，為0.999，檸檬酸與莖及葉中Cd 含量的相關(guān)系數(shù)最大，分別為0.990、0.992（表6）；當(dāng) Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥ 100 mg/kg 時(shí)，葉片中草酸、檸檬酸及蘋果酸含量與根、莖、葉中Cd 含量均呈顯著負(fù)相關(guān)（表 7）。

表6 Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)＜100 mg/kg 時(shí)蓖麻體內(nèi)Cd 含量與葉片有機(jī)酸含量的相關(guān)性

表7 Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥100 mg/kg 時(shí)蓖麻體內(nèi)Cd 含量與葉片有機(jī)酸含量的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

重金屬對(duì)植物具有強(qiáng)的毒害作用，其中，植物農(nóng)藝性狀、生物量等可作為評(píng)價(jià)植物對(duì)重金屬逆境脅迫耐性最直觀的指標(biāo)[13]。景俏麗等[14]研究表明，低濃度Cd 可以促進(jìn)植物生長，高濃度Cd 會(huì)抑制植物生長。本研究發(fā)現(xiàn)，蓖麻幼苗在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)（20、50 mg/kg）Cd 脅迫下，植株生長正常，且株高、側(cè)根數(shù)、根干質(zhì)量及地上部分干質(zhì)量較對(duì)照略有增加；隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，各指標(biāo)較對(duì)照有所下降，當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到300 mg/kg 時(shí)，植株各農(nóng)藝性狀較對(duì)照顯著降低，葉片發(fā)黃，根部有黑點(diǎn)，生長受到抑制，但是沒有致死，說明蓖麻耐鎘能力較強(qiáng)。

富集和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是衡量植物對(duì)重金屬積累能力的一項(xiàng)重要指標(biāo)[15]。本研究表明，蓖麻根對(duì)不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd 的富集系數(shù)均大于1，莖葉對(duì)Cd 的富集系數(shù)均小于1，轉(zhuǎn)移系數(shù)均小于1，說明蓖麻對(duì)Cd 由根部向地上部分轉(zhuǎn)運(yùn)能力較弱，將大部分Cd積累在根部，以此來減少Cd 對(duì)蓖麻植株的毒害，這可能是蓖麻對(duì)Cd 有很強(qiáng)的耐性的原因之一[16]。

在重金屬污染下，進(jìn)入植物體內(nèi)的重金屬可以與儲(chǔ)存在液泡中的有機(jī)酸絡(luò)合，形成低毒的絡(luò)合物，從而增強(qiáng)植物的耐性，對(duì)植物抵抗重金屬毒害起重要作用[17-20]。許多研究表明，植物體內(nèi)及植物根際與重金屬螯合的主要有機(jī)酸是草酸、蘋果酸和檸檬酸[21-22]。本研究對(duì)Cd 脅迫下蓖麻葉片及根系中的草酸、蘋果酸和檸檬酸的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同脅迫下有機(jī)酸含量存在差異，蓖麻葉片中有機(jī)酸含量大小為檸檬酸＞草酸＞蘋果酸，隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提高，3 種有機(jī)酸的含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，在Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50 mg/kg 時(shí)3 種有機(jī)酸含量均達(dá)最大值，這與孫瑞蓮等[11]對(duì)Cd 超積累植物龍葵的研究結(jié)果相一致；蓖麻根部有機(jī)酸含量大小為草酸＞檸檬酸＞蘋果酸，其中，草酸的含量隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高逐漸降低，蘋果酸、檸檬酸含量隨著Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。雖然Cd 脅迫對(duì)蓖麻根內(nèi)草酸含量有抑制作用，但草酸含量明顯高于檸檬酸和蘋果酸，蓖麻葉片中檸檬酸含量最高，說明草酸和檸檬酸可能在蓖麻對(duì)Cd 富集和抗性中起主要作用。當(dāng)Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于100 mg/kg 時(shí)，根系含有的蘋果酸，葉片含有的草酸、蘋果酸和檸檬酸與蓖麻體內(nèi)Cd 含量呈正相關(guān)；大于100 mg/kg 時(shí)根及葉片中3 種有機(jī)酸與蓖麻體內(nèi)Cd 含量均呈負(fù)相關(guān)，說明低劑量Cd 脅迫下，蓖麻根中的蘋果酸及葉片中的草酸、蘋果酸與檸檬酸的積累增強(qiáng)有助于根、莖葉中鎘的富集，而在高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Cd 脅迫下蓖麻體內(nèi)Cd 抑制了有機(jī)酸的合成。本研究僅對(duì)Cd 脅迫下蓖麻體內(nèi)Cd 含量及根、葉的有機(jī)酸含量進(jìn)行了研究，對(duì)蓖麻體內(nèi)積累的草酸、蘋果酸及檸檬酸能否通過根系分泌作用活化環(huán)境中的鎘，并促進(jìn)Cd 從根部轉(zhuǎn)運(yùn)到莖部，還有待進(jìn)一步研究。