李 琪，邢穎娜，杜逢慧，傅曉文，季 蕾，李天元，王加寧，陳貫虹，郭書海，張 強*

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，濟南 250013；2.山東山冶環(huán)境工程有限公司，濟南 250101)

隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，重金屬污染土壤問題已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的重要環(huán)境問題[1-2]。重金屬在土壤中不能被降解，表現(xiàn)極強的不可逆性和滯后性；被作物吸收后還會損傷植物組織、抑制作物生長，影響農(nóng)產(chǎn)品的食用安全；在雨水和風的作用下進入地下水和空氣中，并沿生物鏈累積，嚴重威脅生態(tài)系統(tǒng)和人類健康[3]。鎘是毒性最強的重金屬元素之一，在人體積累會嚴重損害人體器官和機能，引發(fā)“痛痛病”等多種疾病[4]。

植物修復技術利用能夠忍耐和富集某種或多種重金屬元素的植物吸收、提取、轉(zhuǎn)化、分解或固定土壤中重金屬從而清除或減輕土壤污染[5]。相比傳統(tǒng)的客土、鈍化、電動修復、化學淋洗等物理化學修復技術，植物修復不破壞土壤結(jié)構(gòu)、生態(tài)效益良好且經(jīng)濟有效，具有更為廣闊的應用前景[6]。但是，受重金屬脅迫的影響，修復植物一般生長較慢、生物量較小、易受天氣影響、對重金屬的耐性有一定限度等，致使植物修復周期較長、修復效益較低、限制了該技術大規(guī)模的應用[7]。

植物與微生物聯(lián)合修復作為一種強化植物修復技術逐漸成為中外研究的熱點[8-9]。已有研究表明多種植物促生菌、根際有益微生物或其他功能菌通過促進固氮溶磷、分泌植物激素和抗生素、產(chǎn)生鐵載體等促進寄主植物的生長[10]。不同微生物菌株對不同植物去除重金屬能力的影響各不相同。有些研究表明，土壤中的微生物作為一種高表面活性的生物膠體，能夠吸附、沉淀、氧化/還原重金屬，從而大幅度降低重金屬的生物有效性以及對植物的毒性，提高富集植物對重金屬的耐受性[11]。這些微生物雖然能夠保護修復植物、增加植物生物量，但是卻阻礙了植物對重金屬的吸收和轉(zhuǎn)移。還有研究表明，微生物通過代謝活動及產(chǎn)物促進重金屬的溶解和形態(tài)轉(zhuǎn)化，提高重金屬在土壤中的活性和生物有效性，利于植物吸收和富集重金屬，進而提高植物修復效率[12-13]。

早熟禾和紫花苜蓿是兩種生物量大、生長速率快、易于種植、再生能力強的草坪植物，對土壤中重金屬有一定的抗性[14-15]?？莶菅挎邨U菌是較常見的植物內(nèi)生菌，具有防治病蟲害、提高植物品質(zhì)的作用[16]?，F(xiàn)通過盆栽試驗，探究枯草芽孢桿菌聯(lián)合兩種草坪植物(早熟禾、紫花苜蓿)對污染土壤中鎘的去除作用，確定聯(lián)合修復鎘污染土壤的可行性，并結(jié)合土壤中鎘的形態(tài)、酶活性以及微生物多樣性等物理化學生物性質(zhì)的改變，揭示枯草芽孢桿菌聯(lián)合草坪植物修復鎘污染土壤的機理，以期為重金屬污染場地修復技術制訂與實施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鎘負載土

采集山東省科學院設施菜地表層土壤(0～20 cm)，室溫風干，過2 mm篩，添加一定濃度的氯化鎘溶液，老化培養(yǎng)2個月，最終土壤中總鎘濃度為(3.98±0.07)mg/kg。

1.2 草坪植物種子

選擇兩種常見的草坪植物：早熟禾(肯塔基，美國)和紫花苜蓿(阿爾岡金，加拿大)。種子購自億豐耀種業(yè)公司，均為一年生進口品種，發(fā)芽率大于90%。種子先在10%的H2O2中浸泡消毒5 min，再經(jīng)無菌水沖洗3次，擦干表面水分后用于播種。

1.3 枯草芽孢桿菌懸液制備

枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisTTL1)為山東省科學院生態(tài)研究所微生物菌種庫中保藏的菌株，吸取100 μL枯草芽孢桿菌懸浮液接種于50 mL高壓滅菌的Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min 下活化培養(yǎng)48 h。取1 mL活化的枯草芽孢桿菌懸液，接種于100 mL液體培養(yǎng)基中，于 30 ℃，180 r/min 下擴大培養(yǎng)24 h。取10 mL菌懸液在5 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，用 10 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液洗滌沉淀兩次以除去殘余的培養(yǎng)基。用10 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖溶液稀釋為波長600 nm下吸光度為1.0 的菌懸液(菌液濃度約為1×108CFU/mL)備用。

1.4 盆栽試驗設計

稱取1.50 kg鎘負載土于聚乙烯塑料盆(直徑16.5 cm，高17.5 cm)中，每盆施磷酸二氫鉀0.33 g(P濃度0.05 g/kg，K濃度0.064 g/kg)、尿素0.35 g(N濃度0.108 g/kg)，按照稱重法澆水至土壤水分為田間持水量的60%～70%，每盆均勻撒播0.5 g(干重)種子，表面覆蓋薄土層，植物生長期間定期按照稱重法補充水分。植物發(fā)芽一周后，種植早熟禾和紫花苜蓿的盆中在植物根部每周分別添加1次15 mL菌懸液，設置為接種處理KBS和ABS；種植早熟禾和紫花苜蓿的盆中在植物根部每周分別添加1次15 mL經(jīng)高溫滅菌處理的菌懸液，設置為未接種處理K和A。共添加4次，枯草芽孢桿菌總添加濃度為4×109CFU/kg土，此外，設置不種植植物、添加滅菌后菌懸液的空白對照組(CK)，以及不種植植物、添加菌懸液的枯草芽孢桿菌對照組(BS)，每個處理重復3次，具體如表1所示。

表1 植物-微生物聯(lián)合修復鎘污染土壤試驗設計

1.5 樣品采集與分析

植物樣品：植物播種90 d后，先拍松根系周圍土壤，然后整株植物連根拔出，抖根法獲得植物根際土壤，去離子水清洗植物根部，用濾紙擦干后，測量植物鮮重，于105 ℃干燥箱中殺青30 min，于 75 ℃ 烘干至恒重后稱量干重，經(jīng)粉碎機粉碎、硝酸-微波消解后采用石墨爐原子吸收光譜儀測定植物鎘含量。

土壤樣品：部分根際新鮮土樣分別進行以下分析：采用烘干法測定質(zhì)量含水率；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定土壤脲酶活性；采用Illumina HiSeq高通量測序技術(百邁客生物科技有限公司，北京)對土壤樣品中細菌的16S rDNA的V3-V4區(qū)PCR擴增產(chǎn)物進行測序，并對測序數(shù)據(jù)進行微生物多樣性分析。另一部分根際新鮮土樣于室內(nèi)自然風干后研磨過2 mm篩，經(jīng)硝酸-高氯酸-氫氟酸電熱板消解后采用石墨爐原子吸收光譜儀測定鎘含量，采用DTPA(二乙三胺五乙酸)提取法測定土壤有效態(tài)鎘含量。

BCFCd=cp/cas

(1)

R=cpwdryp/(cbswdrys)×100%

(2)

式中：BCFCd為鎘生物富集系數(shù)；cp為植物中鎘含量；cas為處理后土壤中鎘含量；R為土壤總鎘去除率；wdryp為植物干重；cbs為處理前土壤總鎘含量；wdrys為土壤干重。

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，P<0.05表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種枯草芽孢桿菌對鎘污染土壤中草坪植物生長的影響

圖1顯示了在草坪植物根部接種枯草芽孢桿菌對兩種草坪植物的鮮重和干重的影響?？梢钥闯?，生長90 d后收獲的紫花苜蓿的鮮重和干重均大于早熟禾，且差異顯著，植物含水率為58%～76%。接種枯草芽孢桿菌顯著增加了早熟禾和紫花苜蓿的鮮重和干重，其中，早熟禾的鮮重和干重的增加比例分別為65.3%、63.3%，紫花苜蓿的增加比例分別為26.4%、29.5%。關于微生物促進植物生長已有不少文獻報道，施加枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等微生物肥料菌劑能夠加速土壤中難溶的氮、磷、鉀分解，轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫牡⒘?、鉀化合物，改善作物的營養(yǎng)狀況，增加作物的抗逆性，從而促進植物生長，增加植物生物量[11,16]。

圖1 接種枯草芽孢桿菌對鎘污染土壤中草坪植物生物量的影響

2.2 接種枯草芽孢桿菌對重金屬去除的影響

圖2顯示了早熟禾和紫花苜蓿兩種植物的鎘含量和鎘總量。可以看出，在根部接種枯草芽孢桿菌后，早熟禾的鎘含量降低了8.5%，但是因為早熟禾的干重增加比例更大，早熟禾的鎘總量增加49.4%；對于紫花苜蓿來說，接種枯草芽孢桿菌后，鎘含量和鎘總量分別是未接種的1.8倍和2.4倍。圖2說明枯草芽孢桿菌能夠抑制早熟禾吸收和轉(zhuǎn)運重金屬，但是促進紫花苜蓿吸收和轉(zhuǎn)運重金屬，兩種植物積累的重金屬總量還與植物的生物量有關。

圖2 接種枯草芽孢桿菌對草坪植物中鎘含量和總量的影響

富集系數(shù)是指植物體內(nèi)某種重金屬含量與土壤中該種重金屬含量的比值，它反映了植物對某種重金屬元素的富集能力，富集系數(shù)越大，其富集能力越強。圖3顯示了兩種植物的鎘富集系數(shù)以及土壤中總鎘的去除率?？梢钥闯?，早熟禾和紫花苜蓿兩種草坪植物的鎘富集系數(shù)均大于1，說明兩種植物均具有鎘富集能力。早熟禾的鎘富集能力較強，生物富集系數(shù)約為11，顯著高于紫花苜蓿。接種枯草芽孢桿菌增大了早熟禾的鎘富集系數(shù)，土壤中鎘的去除率增大了49.4%；對于紫花苜蓿，接種枯草芽孢桿菌后的鎘富集系數(shù)和土壤中鎘的去除率分別是未接種的2.0和2.4倍，接種后總鎘去除率為22%。說明接種枯草芽孢桿菌能夠促進早熟禾和紫花苜蓿從土壤中去除鎘，而且對紫花苜蓿的促進作用更強。

圖3 接種枯草芽孢桿菌對鎘生物富集系數(shù)和去除率的影響

土壤重金屬的有效性是衡量土壤重金屬被植物吸收難易程度的指標，一般采用可被某些無機鹽類、弱酸或有機絡合物等化學試劑溶液提取的重金屬含量表示。采用DTPA浸提劑測定土壤有效態(tài)重金屬含量，結(jié)果如圖4所示。相比空白對照組(CK)，污染土壤種植早熟禾(K)和紫花苜蓿(A)后，土壤中有效態(tài)鎘含量分別降低14.2%和38.5%，是因為試驗中兩種植物均具有富集鎘的能力，優(yōu)先吸收土壤中的有效態(tài)鎘。相比CK，未種植植物時接種枯草芽孢桿菌(BS)，土壤中有效態(tài)鎘含量增加約11.7%，說明枯草芽孢桿菌對土壤中重金屬起到活化作用。種植早熟禾時，相比K處理，接種枯草芽孢桿菌(KBS)使土壤中有效態(tài)鎘含量降低了約25.3%，而且早熟禾體內(nèi)的鎘含量也降低(圖2)，說明與早熟禾共存時，枯草芽孢桿菌可能對重金屬的抗性作用超過了活化作用，也可能添加枯草芽孢桿菌后，刺激早熟禾產(chǎn)生抑制重金屬活性的根系分泌物，降低了鎘的有效態(tài)含量和生物吸收量。已有研究表明微生物可能通過生物吸附、胞外沉淀、生物轉(zhuǎn)化、生物累積等作用對重金屬產(chǎn)生抗性，降低土壤中重金屬的生物有效性[11]。種植紫花苜蓿時，相比A處理，接種枯草芽孢桿菌(ABS)后，土壤中有效態(tài)鎘含量增加約12%，而且紫花苜蓿體內(nèi)的鎘含量也增加(圖2)，說明枯草芽孢桿菌與紫花苜蓿共存對土壤中重金屬的聯(lián)合作用表現(xiàn)為活化作用。已有研究表明微生物主要通過代謝活動產(chǎn)生多種酸性代謝產(chǎn)物促進土壤中重金屬的溶解，促進重金屬由專性吸附態(tài)和氧化錳結(jié)合態(tài)向可交換態(tài)和有機結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變，增加重金屬生物有效性[12-13]。

圖4 接種枯草芽孢桿菌對土壤中有效態(tài)鎘含量和脲酶活性的影響

2.3 接種枯草芽孢桿菌對根際土壤生物性質(zhì)的影響

土壤酶是評價土壤質(zhì)量的重要指標之一，主要來自土壤微生物、植物和動物的活體或殘體，參與多種土壤生物化學過程[4]。脲酶是一種酰胺酶，可以將酰胺態(tài)有機氮化物水解轉(zhuǎn)化為植物可以直接吸收利用的無機氮化物[1]。脲酶的作用是極為專性的，土壤的脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、有機質(zhì)含量、全氮和速效氮含量呈正相關，在一定程度上可以反映土壤的供氮水平與能力[9]。由圖4可以看出，相比空白對照組(CK)，重金屬污染土壤種植早熟禾(K)顯著提高了土壤脲酶活性，種植紫花苜蓿(A)對脲酶活性無顯著影響。對于未種植植物的土壤(CK)和僅種植早熟禾(K)或紫花苜蓿(A)的土壤，接種枯草芽孢桿菌的BS、KBS和ABS處理將土壤的脲酶活性分別增加了24.3%、82.2%和48.6%。說明接種枯草芽孢桿菌能夠提高土壤肥力，改善土壤的營養(yǎng)條件，促進植物生長，這與圖1中顯示的植物生物量的增加結(jié)果是一致的。

接種枯草芽孢桿菌對土壤微生物多樣性的影響結(jié)果如圖5所示。Alpha多樣性分析可研究單個樣品內(nèi)部的物種多樣性，其指標包括樣品中OUTs(operational taxonomic units)個數(shù)、豐富度指數(shù)(ACE)、多樣性指數(shù)(Shannon)和覆蓋率(均大于99.9%)等。OTUs即分類操作單元，每個OUT(高于97%相似性水平)對應一個物種。從圖5可以看出，接種枯草芽孢桿菌的BS、KBS和ABS處理土壤的OTUs個數(shù)分別與未種植植物(CK)、只種植早熟禾(K)和只種植紫花苜蓿(A)土壤的OTUs數(shù)無顯著差異。ACE衡量物種豐度即物種數(shù)量的多少，ACE指數(shù)越大，說明樣品的物種越豐富。Shannon指數(shù)用于衡量物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，說明樣品的物種多樣性越高。如圖5所示，相比CK，只種植早熟禾(K)的土壤ACE指數(shù)增加了9.3%、Shannon指數(shù)無顯著差異，但是相比K處理，接種枯草芽孢桿菌(KBS)后的土壤ACE指數(shù)降低了11.6%、Shannon指數(shù)仍無顯著差異。說明只種植早熟禾能夠提高土壤中微生物的豐富度，但是為早熟禾接種枯草芽孢桿菌后降低了物種豐富度。相比CK，只種植紫花苜蓿(A)的土壤ACE指數(shù)降低了18.0%、Shannon指數(shù)降低了16.1%，但是相比A處理，接種枯草芽孢桿菌(ABS)后的土壤ACE指數(shù)無顯著變化、Shannon指數(shù)增加了47.0%。說明只種植紫花苜蓿降低了土壤中微生物的豐富度和多樣性，但是為紫花苜蓿接種枯草芽孢桿菌后增加了物種多樣性，改善了土壤的微生態(tài)環(huán)境。接種枯草芽孢桿菌對種植早熟禾和紫花苜蓿的土壤中微生物群落組成和結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的不同影響可能是對早熟禾(鈍化和阻隔)和紫花苜蓿(活化和促進吸收)修復鎘污染土壤不同的作用效果的一個重要原因。

圖5 接種枯草芽孢桿菌對根際土壤中微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響

3 結(jié)論

在生長于鎘污染土壤中的早熟禾和紫花苜蓿兩種草坪植物的根部土壤中接種枯草芽孢桿菌，考察枯草芽孢桿菌對草坪植物生長、重金屬富集、土壤重金屬形態(tài)、脲酶活性及微生物多樣性等性質(zhì)的影響，研究得出以下結(jié)論。

(1)接種枯草芽孢桿菌顯著增加鎘污染土壤的脲酶活性，提高土壤肥力，改善土壤的營養(yǎng)條件，促進植物生長，早熟禾和紫花苜蓿的鮮重和干重顯著增加。

(2)早熟禾和紫花苜蓿均具有富集鎘的能力，接種枯草芽孢桿菌能夠降低種植早熟禾的土壤中鎘的生物有效性，抑制早熟禾吸收和轉(zhuǎn)運重金屬，顯著降低早熟禾的鎘含量，因為早熟禾的干重增加比例更大，所以顯著提高土壤中鎘的去除率。接種枯草芽孢桿菌顯著增加種植紫花苜蓿的土壤中鎘的生物有效性，促進紫花苜蓿吸收和富集鎘，顯著提高土壤中鎘的去除率。

(3)接種枯草芽孢桿菌能夠改善只種植紫花苜蓿造成的土壤微生態(tài)環(huán)境破壞，但是卻降低了種植早熟禾土壤的微生物豐富度。

總之，雖然接種枯草芽孢桿菌對種植早熟禾(鈍化和阻隔)和紫花苜蓿(活化和促進吸收)的土壤中鎘存在不同的作用效果，但是均促進了植物的生長，提高了植物對污染土壤中鎘的去除率，強化了修復效果，為重金屬污染土壤的微生物-植物聯(lián)合修復技術提供了理論基礎和技術支持。