夏偉偉 鄧竹根 張慧君 高晴 徐甜甜 代偉

摘 要：為了驗證一種特異性標記在甜瓜白粉病抗性育種中的實際應(yīng)用效果，用CTAB法提取19份甜瓜親本材料種子總DNA，合成與甜瓜抗白粉病基因Pm-2F緊密連鎖標記的特異性引物，通過PCR擴增出特異性Pm-2F連鎖基因，酶切驗證及測序。結(jié)果表明，篩選的19份甜瓜親本材料中有3個抗病株系，抗病株系雜合的F1代種子在田間表現(xiàn)為強抗性，其他材料雜合F1代均表現(xiàn)感病。試驗室結(jié)果與田間表現(xiàn)一致，符合率達到100%，表明此特異性標記可以應(yīng)用于甜瓜白粉病抗性育種。

關(guān)鍵詞：甜瓜;白粉病;Pm-2F;抗性;育種

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）05-015-06

Application of a specific marker in screening resistance to powdery mildew in melon

XIA Weiwei1， DNEG Zhugen1， ZHANG Huijun2， GAO Qing1， XU Tiantian1， DAI Wei1

（1. Anhui Jianghuai Hortriculture Seeds Co.， Ltd.， Hefei 230031， Anhui， China; 2. Huaibei Normal University， Huaibei 235000， Anhui， China）

Abstract： In order to verify the practical application of a specific marker in the breeding of melon powdery mildew resistance. The total DNA was extracted from a 19-member population of melon parent seeds by CTAB method. The specific marker for tightly linked to the Pm-2F gene with powdery mildew resistance genes of melon was synthesized. The specific Pm-2F linkage gene was amplified by polymerase chain reaction （PCR）， and then validated by restriction enzymes digestion and sequencing. The results showed that three disease-resistant lines in 19 parental materials were determined， which their heterozygous F1 generation for resistant lines showed strong resistance in the field， but others were susceptible to powdery mildew. The laboratory results were consistent with that in the field with 100%， indicating that this specific marker can be applied to the breeding of melon powdery mildew resistance.

Key words： Melon; Powdery mildew; Pm-2F; Resistance; Breeding

甜瓜（Cucumis melo L.）是葫蘆科甜瓜屬一年生蔓性草本植物，在中國種植面積約53.3 萬 hm2 [1]。甜瓜屬于我國高端農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，能夠增加種植者的收入。甜瓜在種植過程中病害嚴重，其中以白粉病為主。白粉病主要危害甜瓜葉片，產(chǎn)生白粉，嚴重阻礙植株光合作用，導致甜瓜的產(chǎn)量及品質(zhì)嚴重下降，而且白粉病的危害在甜瓜生長周期中一直存在。培育抗白粉病的優(yōu)質(zhì)甜瓜品種對于育種工作者顯得尤為重要，但是傳統(tǒng)育種方式工作繁瑣、周期長，而且白粉病生理小種分化速度快。因此，利用分子標記輔助選擇（marker-assisted selection， MAS）技術(shù)可以加快培育抗白粉病品種的進程[2-3]。

白粉病是一種真菌病害，甜瓜上引起該病的病原菌主要是單囊殼白粉?。≒odosphaera xanthii）和二孢白粉?。℅olovinomyces cichoracearum），其中單囊殼白粉?。≒. xanthii）占主導地位[4]。在我國甜瓜白粉病生理小種主要有2個，不同的地方生理小種不同[5-7]，但P. xanthii 2F是國內(nèi)白粉病優(yōu)勢小種[8]，因此對甜瓜白粉病優(yōu)勢小種P. xanthii 2F抗病基因的篩選至關(guān)重要。目前對白粉病抗病基因Pm-2F的研究較多，Pm-2F是單顯性基因[8]。

科技人員對于白粉病分子輔助育種研究很多，已經(jīng)開發(fā)出眾多抗病標記，但是這些抗病篩選標記與抗病基因連鎖距離較遠，篩選結(jié)果不理想[9-13]。而筆者在本文中所使用的特異性標記是根據(jù)國內(nèi)白粉病優(yōu)勢小種P. xanthii 2F的抗病基因Pm-2F研究所得，與抗病基因連鎖距離近，常用于國內(nèi)白粉病抗病材料篩選，是一種普適標記[14]。

筆者用此特異性標記來篩選甜瓜白粉病抗病材料，進行輔助育種，加快了育種進度。在本研究中試驗結(jié)果與田間表現(xiàn)一致，表明該特異性標記可以作為瓜菜輔助育種工具，為加速育種進程奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選用試材為甜瓜19份親本材料及9份雜合F1代，所有親本材料和F1代均為種子。

1.2 試劑

Pfu Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒小樣提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司，限制性內(nèi)切酶 Dde I連接酶購自賽默飛公司，DNA Marker購自TRANS公司。

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)文獻下載特異性序列合成引物：Pm-F：5'-GCCCAACCTTCAACTCGATA'，Pm-R：5'-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3'。引物由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴增

以CTAB法提取19份甜瓜親本材料種子總DNA為模板，用引物Pm-F、Pm-R進行PCR擴增。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，割膠純化。

1.5 測序與比對

純化的PCR產(chǎn)物送上海英濰捷基生物公司測序。利用軟件DNAStar和DNAMAN Version 5.22進行序列處理、分析。多序列比較采用DNAStar Clustal V方法進行序列比對。

1.6 酶切

擴增的片段用限制性內(nèi)切酶Dde I在37 ℃恒溫水浴鍋中酶切15 min，酶切產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳。所擴片段能被Dde I酶酶切即為抗病材料，反之，為感病材料。

1.7 甜瓜F1代種子田間驗證

9份甜瓜F1代種子（由測試的19份甜瓜親本材料雜交獲得）種植于大棚中，在植株生長各個階段觀察發(fā)病情況，標記、記錄和拍照。

1.8 室內(nèi)分子鑒定

所有分子試驗于2019年3月份在安徽省合肥市長豐縣吳山鎮(zhèn)橋沖村江淮園藝示范園分子試驗室進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段的擴增

以19份甜瓜親本材料種子總DNA為模板，用特異性引物Pm-F、Pm-R進行PCR擴增，經(jīng)電泳可見一條約為466 bp的特異性條帶（圖1）。

2.2 白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段序列比對分析

對純化后的白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段進行測序，序列長度為466 bp。將19份甜瓜親本材料白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段相關(guān)序列與已發(fā)表文獻白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖抗病序列進行核苷酸序列相似性比對，發(fā)現(xiàn)3個甜瓜親本材料（歐蜜父母，歐蜜母本和11號母本）核苷酸序列與已知抗病相關(guān)序列相似性達到100%（圖2）。表明這3個親本材料具有抗性。

2.3 親本材料白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段酶切驗證

將純化的白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段進行酶切，發(fā)現(xiàn)有3個親本材料（歐蜜父本、歐蜜母本和11號母本）所擴片段能被Dde I酶酶切（圖3），白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段能夠被Dde I酶酶切，說明對白粉病有抗性。親本材料酶切結(jié)果和序列比對結(jié)果一致，表明這3個親本材料具有抗性。

2.4 雜合F1代白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段酶切驗證

將雜合F1代純化的白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段進行酶切，發(fā)現(xiàn)攜帶白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段的歐蜜親本雜合F1代擴增的對應(yīng)片段能被Dde I酶酶切（圖5），而未攜帶白粉病抗病基因Pm-2F緊密連鎖片段的金喜親本雜合F1代擴增的對應(yīng)片段不能被Dde I酶酶切（圖6）。

2.5 歐蜜親本雜合F1代和金喜親本雜合F1代田間驗證

對9份甜瓜雜合F1代進行田間觀察，發(fā)現(xiàn)與測序和酶切得到的結(jié)果一致，歐蜜親本雜合F1代田間表現(xiàn)為強抗性（圖7），金喜親本雜合F1代在田間表現(xiàn)為感?。▓D8）。

3 討論與結(jié)論

確定白粉病優(yōu)勢小種對于抗病基因的篩選至關(guān)重要。前人的研究表明，我國甜瓜白粉病均由Podosphaera xanthii引起，而2 France為優(yōu)勢小種[5]。筆者選用的特異性標記是根據(jù)國內(nèi)白粉病優(yōu)勢小種P. xanthii 2F的抗病基因Pm-2F研究所得。試驗結(jié)果與張春秋的一致[14]。

根據(jù)目前文獻資料，我國甜瓜白粉病生理小種至少有2種（1和2 France[5] ）。海南、江浙等地區(qū)引起甜瓜白粉病發(fā)生的是優(yōu)勢生理小種2 [6，15]。而部分地區(qū)優(yōu)勢生理小種則不詳[16] 。白粉病生理小種分化快，同一地區(qū)不同時期致病小種不同[17-18]。筆者選用的特異性標記在甜瓜白粉病優(yōu)勢小種2地區(qū)的應(yīng)用效果非常明顯，對于其他生理小種利用此標記進行分子輔助育種存在一定的風險。因而下一步要尋找其他生理小種的抗病標記和長期監(jiān)測試驗地區(qū)的小種變化。同時，其他關(guān)于抗白粉病的基因已陸續(xù)發(fā)表，如Pm-1，Pm-2、 Pm-3、Pm-4、Pm-5、Pm-6、Pm-7、Pm-E、Pm-F、Pm-G、Pm-H、Pm-W、Pm-X、Pm-Y[19]，這些抗白粉病基因的研究拓寬了分子育種標記的選擇途徑，這也是筆者下一步研究的方向。

筆者在本研究中對選用的19份甜瓜親本材料種子，分別用測序、酶切驗證和大田種植3種方法一一對應(yīng)驗證，結(jié)果一致。歐蜜父本、母本的雜合F1代表現(xiàn)為抗白粉病，表明試驗所使用的特異性標記可以應(yīng)用于甜瓜抗白粉病材料的篩選。而11號母本因故未得到F1代種子，抗病性有待進一步研究。本研究結(jié)果為甜瓜抗白粉病新品種選育提供了一種輔助性方法，為加快育種步伐奠定了基礎(chǔ)。

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