王虎斌,黃衛(wèi)胤,溫玉發(fā),孫 玲,陳 爽,喬紅群

(1.南京工業(yè)大學(xué) 江蘇省藥物研究所 安全性評(píng)價(jià)中心,江蘇 南京 211800;2.南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 211800)

1995年美國(guó)食品藥品管理局(FDA)首次提出的生物藥劑學(xué)分類(lèi)系統(tǒng)(BCS),是根據(jù)藥物在胃腸道中的溶解性和藥物通過(guò)腸道膜的滲透性對(duì)藥物進(jìn)行分類(lèi)的框架[1]。2016年國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局基于BCS分類(lèi)頒發(fā)了《人體生物等效性試驗(yàn)豁免指導(dǎo)原則》,該原則應(yīng)用于仿制藥物申請(qǐng)人體生物利用度和生物等效性實(shí)驗(yàn)豁免[2]。根據(jù)藥物的溶解性和滲透性,藥物在BCS分類(lèi)下有四類(lèi):Ⅰ類(lèi)(高溶解性-高滲透性)、Ⅱ類(lèi)(低溶解性-高滲透性)、Ⅲ類(lèi)(高溶解性-低滲透性)、Ⅳ類(lèi)(低溶解性-低滲透性)[3]。當(dāng)口服固體制劑具有很高的溶解度,且在體內(nèi)的溶出時(shí)間比胃排空時(shí)間短時(shí),藥物在體內(nèi)的吸收就不會(huì)依賴藥物的溶出時(shí)間和在胃腸道內(nèi)的停留時(shí)間。對(duì)于高溶解性的藥物,若藥物的吸收不被處方中輔料顯著影響,可免去藥物的人體生物利用度和生物等效性實(shí)驗(yàn),即滿足人體生物等效性實(shí)驗(yàn)豁免的條件。

拉米夫定為核苷類(lèi)似物,是乙型肝炎病毒的治療藥物,同時(shí)也可聯(lián)合齊多夫定用于治療艾滋病[4-6]。口服后其體內(nèi)的活性代謝物——拉米夫定三磷酸鹽作為逆轉(zhuǎn)錄酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,會(huì)影響乙型肝炎病毒DNA的復(fù)制,引起鏈終止[7-8]。拉米夫定對(duì)人體DNA聚合酶的親和力很低,因此不干擾人體正常的DNA合成[9-10]。拉米夫定在體內(nèi)有良好的吸收,據(jù)報(bào)道其口服生物利用度超過(guò)80%,且藥動(dòng)力學(xué)特征呈現(xiàn)線性動(dòng)力學(xué)過(guò)程,只有5%～10%的拉米夫定被代謝為無(wú)藥理活性的反式亞砜代謝物,70%左右的拉米夫定以原形式通過(guò)腎臟消除,在肝臟中的代謝很少[11-13]。拉米夫定溶解性高,若能通過(guò)合理的實(shí)驗(yàn)研究其滲透性,得到其腸道滲透性數(shù)據(jù),則可以判斷其是否滿足生物等效性豁免[14]的條件。

在研究化合物腸道滲透性的諸多模型中,在體單向腸灌流模型保留了腸道神經(jīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的完整性、血液及淋巴液的供應(yīng),較接近機(jī)體內(nèi)的狀態(tài)[15]。該模型簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確,可用于預(yù)測(cè)腸道對(duì)藥物的吸收[16]。筆者使用在體單向腸灌流模型研究拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)的滲透性,判定拉米夫定的BCS類(lèi)別并為其申請(qǐng)人體生物等效性豁免提供有效、可靠的滲透性數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥品與試劑

拉米夫定(批號(hào)為DBH010G-B15B-171003,純度為99.8%),由福建廣生堂藥業(yè)股份有限公司提供;拉米夫定對(duì)照品(批號(hào)為101007-20150,純度為99.7%)、苯妥英鈉對(duì)照品(批號(hào)為100210-201303,純度為99.9%)和阿昔洛韋對(duì)照品(批號(hào)為100121-201104,純度為99.8%),購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;人工小腸液(批號(hào)為0706A18)和人工胃液(批號(hào)為0920A18),購(gòu)自北京雷根生物公司;水為自制超純水;其余試劑皆為分析純。

1.2 動(dòng)物

無(wú)特定病原體級(jí)(SPF)SD大鼠30只,雌雄各半，體質(zhì)量大于300 g,由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(浙)2018-0001,合格證號(hào)為1806130011。動(dòng)物依據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組,分別為苯妥英鈉對(duì)照組,阿昔洛韋對(duì)照組和拉米夫定高、中、低3個(gè)劑量組,每組6只,雌雄各半。

實(shí)驗(yàn)大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)期一周期間自由進(jìn)食、飲水。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)江蘇省藥物安全性評(píng)價(jià)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.3 儀器

LC-15C型高效液相色譜儀(HPLC)、SPD-15C檢測(cè)器,日本Shimadzu公司;BT100SV2-CE型蠕動(dòng)泵,保定雷弗流體科技有限公司;F3JN77433型超凈水機(jī),美國(guó)Millipore公司;XS105型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;5424型高速離心機(jī),Eppendorf(中國(guó))有限公司;基本型渦旋混合器,美國(guó)Talboys公司。

1.4 溶液的配制

1.4.1 Krebs-Ringer’s(K-R)溶液的配制

依次取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.32 g、葡萄糖1.40 g、MgCl20.02 g、NaHCO31.37 g,置于1 L超純水中溶解,用H3PO4調(diào)節(jié)pH至6.8(每次臨用時(shí)現(xiàn)配)。

1.4.2 空白灌流液的制備

取1.4.1節(jié)中配制的K-R溶液,經(jīng)大鼠腸道灌流后,離心取上清液,即得空白灌流液。

1.4.3 拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取拉米夫定對(duì)照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,加入甲醇與水(體積比為1∶1)溶解并定容,得到1 mg/mL的拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,冷藏于冰箱(4 ℃)中備用。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液的配制

取1.4.3節(jié)配制的儲(chǔ)備液適量,用空白灌流液稀釋至拉米夫定質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2.5、5、10和25 μg/mL的系列溶液,即為標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液。

1.4.5 含藥灌流液的配制

精密稱取拉米夫定供試品300 mg,置于250 mL容量瓶中,加適量K-R溶液使其完全溶解后定容,得到拉米夫定質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL的含藥灌流液,作為灌流的高劑量組,再分別稀釋10倍和100倍后作為灌流的中(120 μg/mL)、低(12 μg/mL)劑量組。

精密稱取苯妥英鈉7.5 mg,置于250 mL量瓶中,加適量K-R溶液,振蕩使其溶解后,再加K-R溶液稀釋至刻度,制成含苯妥英鈉30 μg/mL的灌腸溶液。

精密稱取阿昔洛韋12 mg,置于100 mL量瓶中,加適量K-R溶液,振蕩使其溶解后,再加K-R溶液稀釋至刻度,制成含阿昔洛韋120 μg/mL的灌腸溶液。

1.5 檢測(cè)條件

檢測(cè)拉米夫定的色譜柱為Xterra MS C18型柱(2.1 mm×150 mm,5 μm),流動(dòng)相為25 mmol/L醋酸銨-甲醇緩沖溶液(用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.8,醋酸銨與甲醇的體積比為85∶15),流速為0.15 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL,柱溫為室溫,檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm。

檢測(cè)苯妥英鈉的色譜柱為Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為20 mmol/L KH2PO4-乙腈緩沖溶液(用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.5,KH2PO4與乙腈體積比為60∶40),檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL,柱溫為室溫。

檢測(cè)阿昔洛韋的色譜柱為Venusil XBP C18型柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(體積比為10∶90),檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm,流速為1.0 mL/min,進(jìn)樣體積為10 μL,柱溫為室溫。

1.6 大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)[17-18]

1.6.1 大鼠在體單向腸灌流模型的建立

實(shí)驗(yàn)前取禁食12 h但不禁水的SD大鼠,腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)麻醉后沿腹中線切口4 cm，打開(kāi)腹腔,在腸道兩端插硅膠管,用滅菌的手術(shù)線固定,近心端作為灌流入口,遠(yuǎn)端作為出口。實(shí)驗(yàn)時(shí)，用等滲生理鹽水浸漬的紗布覆蓋于腸組織表面以保濕,于紅外燈下使大鼠保持正常體溫。先用37 ℃等滲生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物直至出口處溶液變清澈,然后用預(yù)熱至37 ℃的含藥灌流液進(jìn)行灌流,灌流速率為0.2 mL/min,預(yù)平衡30 min后,入口處用已知質(zhì)量的裝有含藥灌流液的小瓶進(jìn)行灌流,在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集灌流液(每隔20 min為一個(gè)灌流時(shí)間點(diǎn),同時(shí)迅速更換下一個(gè)已知質(zhì)量的含藥灌流液小瓶和收集液小瓶),稱量后計(jì)算灌入和收集的藥液質(zhì)量,灌流時(shí)間持續(xù)至110 min。灌流結(jié)束后麻醉處死大鼠并測(cè)量灌流腸道的長(zhǎng)度(l)和內(nèi)徑(r)。

1.6.2 模型驗(yàn)證

采用高滲透性模型藥品(苯妥英鈉對(duì)照品)與低滲透性模型藥品(阿昔洛韋對(duì)照品)在所建模型上進(jìn)行在體吸收參數(shù)的測(cè)定,在與高、低滲透性藥物的吸收參數(shù)作比較后,若發(fā)現(xiàn)兩者實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合要求,說(shuō)明已建模成功。

1.6.3 拉米夫定大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)

按1.6.1節(jié)方法進(jìn)行拉米夫定高、中、低3個(gè)劑量組大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn),灌流時(shí)間持續(xù)至110 min。

1.7 大鼠腸道灌流樣品的處理

取適量大鼠腸灌流樣品,以轉(zhuǎn)速16 000 r/min離心2 min后,取上清液,低劑量組直接進(jìn)樣分析,中、高劑量組分別稀釋10倍和100倍后進(jìn)樣分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

(1)

(2)

(3)

式中:Q為腸道灌流的流速(0.2 mL/min)。

2 結(jié)果與討論

2.1 拉米夫定分析方法的驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 專屬性

分別取空白灌流液、對(duì)照樣品(空白灌流液中添加10 μg/mL拉米夫定)和拉米夫定灌流樣品(10 μg/mL拉米夫定大鼠灌流液)進(jìn)樣分析,HPLC圖譜見(jiàn)圖1。由圖1可知:在實(shí)驗(yàn)條件下,拉米夫定的保留時(shí)間為5.785 min,空白灌流液在拉米夫定出峰處未檢出雜峰,分析方法特異性良好。

圖1 拉米夫定的HPLC圖譜Fig.1 HPLC spectra of lamivudine

2.1.2 線性關(guān)系

取標(biāo)準(zhǔn)曲線系列樣品進(jìn)樣分析,記錄HPLC圖譜,以拉米夫定的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y)、拉米夫定的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行線性回歸運(yùn)算,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=204 501x+8 297.1(相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9),拉米夫定質(zhì)量濃度的線性范圍為0.25～25 μg/mL。

2.1.3 稀釋可靠性

取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度分別為120、1 200 μg/mL的溶液各5份,分別稀釋10倍和100倍后進(jìn)樣分析，記錄HPLC峰面積,以HPLC峰面積計(jì)算拉米夫定質(zhì)量濃度并計(jì)算準(zhǔn)確度。得到稀釋后的準(zhǔn)確度為98%～102%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)<1%,表明稀釋可靠性符合研究要求。

2.1.4 進(jìn)樣精密度

取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度為12 μg/mL的樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次,考察進(jìn)樣精密度,HPLC峰面積與保留時(shí)間的RSD分別為0.3%和0.1%,表明進(jìn)樣精密度符合研究要求。

2.1.5 精密度與準(zhǔn)確度

取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用空白灌流液稀釋,配制拉米夫定質(zhì)量濃度分別為2.5、12、20 μg/mL的低、中、高濃度樣品溶液,每一濃度樣品同日內(nèi)連續(xù)測(cè)定5次,把測(cè)得的HPLC峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到拉米夫定質(zhì)量濃度，并計(jì)算其RSD以考察批內(nèi)精密度,同法連續(xù)測(cè)定3 d以考察批間精密度;配制上述質(zhì)量濃度樣品各5份并進(jìn)樣分析,將樣品的HPLC峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算拉米夫定質(zhì)量濃度,以實(shí)驗(yàn)濃度與理論濃度的比值計(jì)算回收率并作為準(zhǔn)確度,結(jié)果見(jiàn)表1。批內(nèi)和批間精密度的RSD均小于2%,得到的回收率為98%～102%,均符合研究要求。

表1 精密度與準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Experimental results of precision and accuracy

2.1.6 穩(wěn)定性

取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加至空白灌流液中配制低、中、高濃度樣品溶液。拉米夫定在空白灌流液中于室溫下放置0、0.5、1、4、8、12和24 h后進(jìn)樣分析,以HPLC峰面積計(jì)算拉米夫定的質(zhì)量濃度,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知:拉米夫定在不同介質(zhì)和不同考察時(shí)間點(diǎn)質(zhì)量濃度的RSD均小于5%,拉米夫定在空白灌流液中的穩(wěn)定性良好。

表2 拉米夫定在空白灌流液中的穩(wěn)定性Table 2 Stability of lamivudine in blank perfusion

2.1.7 拉米夫定在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性

取拉米夫定標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加至人工胃液和人工腸液中配制低、中、高濃度樣品溶液。拉米夫定在人工胃液中的考察時(shí)間點(diǎn)為37 ℃下放置0、0.2、1、1.5和2 h;拉米夫定在人工腸液中的考察時(shí)間點(diǎn)為37 ℃下放置0、0.83、1.17、1.5、1.83、4、6、8和10 h。以HPLC峰面積計(jì)算拉米夫定的質(zhì)量濃度,結(jié)果分別見(jiàn)表3和4。由表3和4可知:拉米夫定在不同介質(zhì)和不同考察時(shí)間點(diǎn)的質(zhì)量濃度的RSD均小于5%,拉米夫定在人工胃液和人工腸液中的穩(wěn)定性良好。

表3 拉米夫定在人工胃液中的穩(wěn)定性Table 3 Stability of lamivudine in artificial gastric juice

表4 拉米夫定在人工腸液中的穩(wěn)定性Table 4 Stability of lamivudine in artificial intestinal fluid

2.2 對(duì)照藥物的方法驗(yàn)證結(jié)果

對(duì)照藥物苯妥英鈉和阿昔洛韋的驗(yàn)證內(nèi)容包括專屬性、標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度和灌流液穩(wěn)定性。對(duì)照藥物在1.5節(jié)所述檢測(cè)條件下,苯妥英鈉的保留時(shí)間為4.732 min,阿昔洛韋的保留時(shí)間為7.295 min,空白灌流液在對(duì)照藥物出峰處未檢出雜峰,表明色譜方法特異性良好。對(duì)照藥物在0.25 ～ 25 μg/mL的范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系,苯妥英鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=19 532x-3 512.2(R2=1.000 0),阿昔洛韋的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=35 329x+1 169.8(R2=1.000 0);對(duì)應(yīng)的準(zhǔn)確度為98% ～ 101%,RSD均小于1%;對(duì)應(yīng)的灌流液穩(wěn)定性分別為98.73%和99.88%。驗(yàn)證結(jié)果均符合研究要求。

2.3 大鼠在體單向腸灌流模型的驗(yàn)證結(jié)果

2.4 拉米夫定大鼠在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 拉米夫定在大鼠腸道的吸收參數(shù)Table 5 Lamivudine absorption parameters in rat intestine

表6 拉米夫定在不同時(shí)間點(diǎn)的吸收參數(shù)Table 6 Lamivudine absorption parameters at different time points

拉米夫定片劑單次口服最高劑量為300 mg,溶于250 mL水中后,質(zhì)量濃度為1 200 μg/mL,因此,筆者選擇此質(zhì)量濃度作為研究拉米夫定腸道吸收的高劑量組濃度,稀釋10倍和100倍后分別作為中劑量組和低劑量組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)的吸收參數(shù)在各劑量組間無(wú)顯著性差異。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示拉米夫定的Peff為0.3×10-5～2×10-5cm/s,拉米夫定在腸道內(nèi)的吸收介于高滲透性和低滲透性之間,屬于中滲透性藥物,預(yù)計(jì)其口服固體制劑的人體吸收分?jǐn)?shù)為50%～84%。拉米夫定藥動(dòng)學(xué)研究顯示其在體內(nèi)快速吸收且口服的生物利用度大于80%,接近BCSⅠ類(lèi)藥物的邊界,本實(shí)驗(yàn)中拉米夫定的Peff也接近2×10-5cm/s。根據(jù)拉米夫定的溶解性資料,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,拉米夫定屬于BCS Ⅲ類(lèi)化合物[21]。對(duì)于活性成分為拉米夫定的仿制制劑,只要處方中的其他輔料成分不顯著影響拉米夫定的吸收,就不必證明該拉米夫定在體內(nèi)生物利用度和生物等效的可能性,即視為滿足生物等效性豁免的條件。

3 結(jié)論

1)本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC-UV分析方法，驗(yàn)證專屬性、精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性均符合研究要求,可用于灌流樣品中拉米夫定的分離檢測(cè)。

3)不同劑量組拉米夫定在大鼠腸道內(nèi)及不同灌流時(shí)間點(diǎn)的吸收參數(shù)間無(wú)顯著性差異(P>0.05),拉米夫定存在被動(dòng)擴(kuò)散的吸收機(jī)制。