宋姍姍 楊艾華 王微微 王俁棋 范紅結(jié) 王小敏

摘要 為解決細(xì)菌在不同食品表面以及食品工業(yè)環(huán)境中形成生物膜引起食品質(zhì)量安全問(wèn)題，以中藥材火炭母提取物為對(duì)象，對(duì)不同供試菌株進(jìn)行抑制細(xì)菌及抑制細(xì)菌生物膜試驗(yàn)，探討其抑菌性能。結(jié)果表明：火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用，其最低抑菌濃度（MIC）分別為3.91、1.95、15.63、15.63 mg/mL;在亞抑菌濃度下，火炭母提取物能有效抑制金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜形成，其最小生物膜清除濃度（MBEC）分別為0.98和0.49 mg/mL。

關(guān)鍵詞 火炭母;提取物;抑菌;細(xì)菌;生物膜

中圖分類號(hào) R-285? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）12-0187-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Antimicrobial Properties of the Extracts from Polygonum chinense L.

SONG Shan shan，YANG Ai hua，WANG Wei wei et al （School of Basic Medicine Sciences，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000）

Abstract In order to solve the problem of food quality and safety caused by bacteria forming biofilm on different food surfaces and in food industry environment，this study took the extract of Polygonum chinense as the object，carried out bacteriostatic and bacteriostatic membrane tests on different index strains，and discussed its bacteriostatic performance.The results showed that the extract of Polygonum chinense had a certain inhibitory effect on the growth of Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa，and the minimum inhibitory concentrations （MIC） was 3.91，1.95，15.63 and 15.63 mg/mL，respectively.Under the concentration of subbacteriostatic bacteria，the extract of Polygonum chinense could effectively inhibit the biofilm formation of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis， the minimum biofilm removal concentration （MBEC） was 0.98 and 0.49 mg/mL，respectively.

Key words Polygonum chinense L.;Extract;Antibacterial;Bacteria;Biofilm

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)生物膜的研究在醫(yī)學(xué)及環(huán)境學(xué)方面比較廣泛，在食品方面重視程度較低。然而，其引起的食品安全問(wèn)題卻不容忽視。細(xì)菌生物膜廣泛存在于各種食品和食品加工表面，可引起食源性疾病暴發(fā)和加速食品腐敗，嚴(yán)重制約了食品工業(yè)的健康發(fā)展[1]。研究表明，細(xì)菌生物膜是其在生長(zhǎng)過(guò)程中，為了適應(yīng)生存環(huán)境由細(xì)菌自身分泌的多糖、DNA、蛋白質(zhì)等胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的一個(gè)具有三維立體空間結(jié)構(gòu)的生態(tài)系[2]。在生物膜的保護(hù)下，細(xì)菌耐受性增強(qiáng)，顯著增加食品安全風(fēng)險(xiǎn)[3]。

已有研究表明，植物源天然減菌劑能夠通過(guò)破壞細(xì)胞壁或細(xì)胞膜、抑制蛋白質(zhì)功能或與遺傳物質(zhì)結(jié)合、抑制細(xì)菌和真菌[4]。

火炭母（Polygonum chinense L.）為蓼科植物，是民間常用道地藥材，也是“廣東涼茶”“王老吉”和“二十四味”等涼茶的主要組成成分之一，具有清熱利濕、涼血解毒的功效，可用于濕熱泄瀉、痢疾、黃疸、咽喉腫痛等病癥的治療[5-6]。近年來(lái)對(duì)火炭母的研究主要集中于化學(xué)成分和藥理作用，已有研究發(fā)現(xiàn)，火炭母具有抗氧化及清除自由基、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腹瀉、抗肝癌等作用[7]，而針對(duì)本品作為抗菌抗生物膜減菌劑方面的研究則鮮有報(bào)道。因此，該研究以中藥材火炭母為對(duì)象，采用65%乙醇溶液為提取液，通過(guò)超聲波輔助手段提取火炭母有效成分，且經(jīng)低溫冷凍干燥處理，去除有機(jī)溶劑的影響;分析不同濃度火炭母提取物對(duì)各供試菌株的最低抑菌濃度（MIC）、最低殺菌濃度（MBC）、最小生物膜清除濃度（MBEC）及生長(zhǎng)周期的影響，探討火炭母提取物的抑菌性能，為其綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 火炭母購(gòu)買自遵義經(jīng)方藥堂，取全株40 ℃烘干粉碎，過(guò)100目篩制成火炭母粉末備用;金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CMCC26003）、大腸桿菌（Escherichia coli CMCC44102）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa CMCC10104）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis CMCC26069），均由遵義醫(yī)科大學(xué)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 火炭母提取物的制備。稱取5 g火炭母干燥粉末，以65%乙醇為溶劑，超聲波振蕩30 min、45 ℃水浴30 min后低速離心取上清液，沉淀按照上述步驟重復(fù)提取2～3次。收集上清液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，所得濃縮物低溫冷凍干燥成粉末，將粉末用無(wú)菌水配制成濃度1.0 g/mL的火炭母提取物母液，121 ℃滅菌15 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試菌液的制備。挑取各供試菌單菌落，接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)15～18 h，使細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，無(wú)菌生理鹽水調(diào)整細(xì)菌濃度至1.5×108 CFU/mL，備用。

1.2.3 火炭母提取物抑菌活性的測(cè)定。將各供試菌菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面，待表面干燥后，等距離放置無(wú)菌牛津杯，輕輕按壓后加入藥液。試驗(yàn)組：1.0 g/mL火炭母提取物50 μL，對(duì)照組：0.9%無(wú)菌生理鹽水50 μL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑大小。

1.2.4 火炭母提取物最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測(cè)定。取各供試菌菌液50 μL，加至含不同濃度火炭母提取物的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。取試管內(nèi)液體50 μL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，平板菌落計(jì)數(shù)。

1.2.5 火炭母提取物對(duì)各供試菌株生長(zhǎng)的影響。將各供試菌菌液加至含有不同濃度火炭母提取物的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣測(cè)定OD600值，每個(gè)火炭母提取物濃度做3個(gè)重復(fù)，取平均值，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)、生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 生物膜形成能力的檢測(cè)。將各供試菌接種于剛果紅平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，室溫放置24 h，觀察結(jié)果。

1.2.7 火炭母提取物對(duì)生物膜形成的影響。LB培養(yǎng)基稀釋火炭母提取物母液，配制不同濃度的藥液。96孔板上每孔加入100 μL供試菌液和不同濃度的火炭母提取物藥液100 μL，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，空白對(duì)照組加入200 μL LB培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h，結(jié)晶紫半定量染色法處理，570 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 火炭母提取物對(duì)各供試菌株的抑制作用 試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.0 g/mL火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為18.3±0.1、8.3±0.2、11.3±0.1、24.0±0.1 mm，表明火炭母提取物對(duì)4種供試菌均有不同程度的抑制作用。根據(jù)藥理學(xué)試驗(yàn)方法（抑菌圈直徑≥16 mm為高度敏感，11～15 mm為中度敏感，≤10 mm為輕度敏感）[8]分析，表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌對(duì)火炭母提取物為高度敏感，銅綠假單胞菌為中度敏感，大腸桿菌為輕度敏感。

2.2 MIC和MBC的確定 從表1可以看出，火炭母提取物對(duì)革蘭氏陰性菌（大腸桿菌和銅綠假單胞菌）的抑菌效果較弱，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌）的抑菌效果較強(qiáng)。其中表皮葡萄球菌的MIC和MBC均最低，說(shuō)明該指示菌對(duì)火炭母提取物最敏感。

2.3 火炭母提取物對(duì)各供試菌生長(zhǎng)曲線的影響

為進(jìn)一步確定火炭母提取物在低于MIC濃度下對(duì)各供試菌生長(zhǎng)是否產(chǎn)生影響，在不同藥物的濃度作用下，對(duì)供試菌的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定。由圖1可知，火炭母提取物在5、10和15 mg/mL時(shí)對(duì)銅綠假單胞菌均有抑制作用，但5和10 mg/mL 時(shí)，其抑制作用相似;火炭母提取物在1.0、1.5 mg/mL時(shí)對(duì)表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)過(guò)程和最大生長(zhǎng)量均有一定的抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度增高而增強(qiáng);火炭母提取物在1.5、2.5和3.5 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)過(guò)程和最大生長(zhǎng)量均具有顯著的抑制作用，但3種藥物濃度的抑制作用幾乎無(wú)差異;火炭母提取物在5 mg/mL時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)與對(duì)照組相比無(wú)生長(zhǎng)延遲現(xiàn)象，但在10和15 mg/mL 時(shí)，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)具有抑制作用。

2.4 生物膜形成能力的檢測(cè)

剛果紅平板檢測(cè)結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的菌落為黑色、光亮的干燥菌落，判定為細(xì)菌生物被膜陽(yáng)性菌株;大腸桿菌和銅綠假單胞菌的菌落為白色干燥菌落，判定為細(xì)菌生物被膜陰性菌株。

2.5 火炭母提取物對(duì)生物膜形成的影響 經(jīng)結(jié)晶紫半定量染色，570 nm處測(cè)定吸光度。由表3可知，火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌生物膜的形成均產(chǎn)生了一定的抑制作用。金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MBEC值分別為其MIC值的1/4，即火炭母提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的MBEC值分別為0.98和0.49 mg/mL。研究證實(shí)火炭母提取物對(duì)上述2種細(xì)菌生物膜形成具有明顯的抑制作用，且藥物作用濃度均低于其藥物最低抑菌濃度，說(shuō)明藥物活性成分能夠穿透生物膜基質(zhì)，在亞抑菌濃度下促進(jìn)生物膜內(nèi)細(xì)菌的死亡，抑制生物膜的形成。

3 結(jié)論

不同濃度的火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌均具有一定的抑制作用，抑制效果與濃度呈正相關(guān);表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）均最低，說(shuō)明該指示菌對(duì)火炭母提取物最敏感;火炭母提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌抑菌效果顯著，對(duì)革蘭氏陰性菌的作用較弱，尤其是大腸桿菌。究其原因可能與火炭母提取物活性成分種類和含量有關(guān)，但具體成分分析還有待進(jìn)一步深入研究。在低于各供試菌株MIC濃度下，火炭母提取物對(duì)各供試菌株的生長(zhǎng)曲線與正常生長(zhǎng)曲線相比發(fā)生顯著變化，并可有效抑制生物膜的形成。表明菌種生長(zhǎng)剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其生長(zhǎng)狀態(tài)和生物膜形成能力就受到提取物的影響。

火炭母廣泛分布于我國(guó)浙江、江西、云南、四川、貴州等南方地區(qū)，資源豐富、價(jià)格低廉、提取工藝簡(jiǎn)單，符合消費(fèi)者對(duì)食品安全的追求[9-10]。因此，可深入研究火炭母對(duì)微生物的抑制作用，將其作為一種可應(yīng)用于食品的清除生物膜消毒劑，更廣泛地使用到食品工業(yè)中。

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