張二豪 趙潤(rùn)東 祿亞洲

摘要 以綠僵菌為試驗(yàn)材料，通過同源重組的方法構(gòu)建信息素基因（MaMAT1）敲除和回復(fù)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得MaMAT1基因敲除和回復(fù)菌株，并對(duì)ΔMaMAT1菌株孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量、抗?jié)駸?、抗紫外及毒力進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與WT菌株相比，ΔMaMAT1菌株的萌發(fā)率、抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰o顯著差異，但其產(chǎn)孢量、毒力顯著降低。

關(guān)鍵詞 蝗綠僵菌;信息素;敲除;毒力

中圖分類號(hào) S-476? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A? 文章編號(hào) 0517-6611（2021）12-0094-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.12.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Functional Study of MaMAT1 in Metarhizium acridum

ZHANG Er hao， ZHAO Run dong， LU Ya zhou

（Food Science College， Tibet Agriculture and Animal Husbandry University， Linzhi， Tibet 860000）

Abstract Using Metarhizium acridum as the experimental material， the function of MaMAT1， knock down and complementation of MaMAT1 were constructed by homologous recombination， ΔMaMAT1 and CP strains were obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation， and the germination， sporulation， UV B， heat shock tolerance and virulence of MaMAT1 were analyzed. The results showed that the disruption of MaMAT1 did not affect the germination， UV B and heat shock tolerance， however， the sporulation and virulence significantly decreased compared to WT.

Key words Metarhizium acridum;MAT1;Knock down;Virulence

昆蟲病原真菌作為一類潛在生防微生物，在害蟲防治過程中扮演著重要角色。截至2017年，已有200多種昆蟲病原真菌被注冊(cè)并用于害蟲防治[1]?；染G僵菌（Metarhizium acridum）作為一種重要的昆蟲病原真菌，在亞洲、非洲和澳洲已被廣泛用于蝗蟲和蚱蜢的防治[2-4]?；染G僵菌作為昆蟲病原真菌的模式生物，其侵染致病過程具有明顯的特征，即孢子萌發(fā)、菌絲發(fā)育、附著孢分化、浸染釘?shù)男纬杉袄ハx體內(nèi)定殖[5-7]。但其較高的生產(chǎn)成本、較長(zhǎng)的致死時(shí)間限制其大規(guī)模應(yīng)用，因此提高昆蟲病原真菌產(chǎn)孢量，增強(qiáng)毒力、縮短發(fā)酵時(shí)間成為人們研究的熱點(diǎn)。

“信息素（荷爾蒙）”在真核生物中是遠(yuǎn)距離作用的化學(xué)物質(zhì)。普遍認(rèn)為“信息素”是性別因子，控制性別和形態(tài)形成[8]。真菌中，雌性或雄性菌絲產(chǎn)生甾醇類信息刺激雄性或雌性器官的產(chǎn)生[9]。在植物病原真菌Phytophthora 和 Pythium上，甾醇類信息調(diào)節(jié)有性生殖和無性生殖。如在Pythium sylvaticum上可擴(kuò)散的信息分別控制異宗配合或非自我兼容的交配器官的形成[10]。信息誘導(dǎo)是玉米黑粉病菌（Ustilago maydis）侵染的必需階段[11]，信息首先誘導(dǎo)交配型菌絲結(jié)合，然后在tubulin基因的作用下形成具有侵染性的雙核菌絲，誘導(dǎo)細(xì)胞核的形成[12-13]。在昆蟲病原真菌Lagenidium giganteum中有相類似的信息行為。在Allomyces species中，雌性和雄性孢子形成絲狀結(jié)合體參與有性生殖。在Zygomycota中，大多數(shù)菌絲是異宗配合的，它們通過同宗配合和異宗配合實(shí)現(xiàn)有性生殖，在這一過程中信息調(diào)控了菌絲從無性到有性的轉(zhuǎn)換[14-15]。在子囊菌的Neurospora crassa上也觀察到了性信息的作用痕跡，但沒有分離出相應(yīng)的化合物[16-17]。在擔(dān)子菌中，脂肽類信息參與雙核的形成和子實(shí)體的發(fā)育[18]。研究者普遍意識(shí)到真菌的內(nèi)源性信息和動(dòng)物類信息具有同源性[9，19]。它們?cè)谡婢纳L(zhǎng)和發(fā)育過程中扮演著重要角色[20]。

蝗綠僵菌不同產(chǎn)孢時(shí)期轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)信息素基因顯著上調(diào)表達(dá)，而信息素（MAT）基因在綠僵菌的產(chǎn)孢、抗性、侵染、定殖和致病力方面的功能尚不清楚。因此探索信息基因在蝗綠僵菌產(chǎn)孢、抗性、侵染、定殖和致病力方面的功能，為提高蝗綠僵菌孢子生產(chǎn)和害蟲防治提供理論依據(jù)和技術(shù)途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蝗綠僵菌CQMa102（Metarhizium acridum102）菌株分離于被感染的竹脊飛蝗僵蟲尸體上。大腸桿菌（Escherichia coli）和根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)（Agrobacterium tumefaciens）均由西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備。毒力生測(cè)中所用的東亞飛蝗由西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供，其飼養(yǎng)條件：光照周期16 h∶8 h（光∶暗），溫度為（28±2）℃，相對(duì)濕度70%[21]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蝗綠僵菌MaMAT1基因的敲除。

提取蝗綠僵菌基因組DNA，分別擴(kuò)增MaMAT1基因上游（左臂）和下游（右臂）序列，根據(jù)同源重組的原理將左右臂序列分別連接到pK2-PB敲除載體上，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受細(xì)胞中，并涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含50 μg/mL的卡那霉素），37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落并PCR驗(yàn)證，將構(gòu)建好的pK2-PB-MaMAT1-L/R敲除載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞[22]，與綠僵菌共培養(yǎng)以獲得MaMat1基因敲除菌株。

1.2.2 蝗綠僵菌孢子萌發(fā)率的測(cè)定。

取在1/4 SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d的新鮮成熟孢子，將100 μL 1×107個(gè)/mL的孢懸液均勻涂布于1/4 SDA平板上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h，期間每3 h觀察一次，當(dāng)孢子出芽長(zhǎng)度等于或大于孢子直徑50%時(shí)視為萌發(fā)，每組3次重復(fù)。計(jì)算公式：萌發(fā)率=萌發(fā)孢子總數(shù)/總孢子數(shù)×100%。

1.2.3 蝗綠僵菌產(chǎn)孢量的測(cè)定。

取在1/4 SDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d的新鮮成熟孢子，并配制1×107個(gè)/mL的孢懸液，取5 μL 孢懸液于含有1/4 SDA培養(yǎng)基的24孔板中，28 ℃倒置培養(yǎng)，每隔3 d觀察一次，并在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)，每組3次重復(fù)。產(chǎn)孢量=孢子數(shù)/孔面積。

1.2.4 蝗綠僵菌孢子抗?jié)駸?、抗紫外能力測(cè)定[21]。

（1）抗?jié)駸崮芰y(cè)定。取培養(yǎng)14 d的新鮮成熟蝗綠僵菌孢子，取50 μL經(jīng)45 ℃處理0、2、4、6、8 h濃度為1×107個(gè)/mL 的孢懸液均勻涂布于1/4 SDA固體培養(yǎng)基上，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)20 h，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)萌發(fā)孢子數(shù)，每組設(shè)3次重復(fù)。計(jì)算公式同“1.2.2”。

（2）抗紫外能力測(cè)定。取培養(yǎng)14 d的新鮮成熟蝗綠僵菌孢子，取100 μL濃度為1×107個(gè)/mL的孢懸液均勻涂布于1/4 SDA固體培養(yǎng)基上，在1 350 mW/m2紫外條件下，28 ℃倒置培養(yǎng)，每2 h觀察一次，連續(xù)觀察8 h，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。計(jì)算公式同“1.2.2”。

1.2.5 蝗綠僵菌毒力測(cè)定[21]。

（1）體表侵染。配制1×107個(gè)/mL的石蠟油孢懸液，取5 μL孢懸液點(diǎn)滴于5齡東亞飛蝗幼蟲的背板上，每組40頭，每12 h統(tǒng)計(jì)一次，直至蝗蟲全部死亡，蝗蟲死亡率=死亡數(shù)/總頭數(shù)×100%。以點(diǎn)滴不含孢子的石蠟油試驗(yàn)組為陰性對(duì)照。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

（2）體內(nèi)注射。配制1×106個(gè)/mL的孢子水懸液，于5齡東亞飛蝗幼蟲腹部第二、三腹節(jié)處注射5 μL孢懸液，每組40頭，每12 h統(tǒng)計(jì)一次，直至蝗蟲全部死亡，蝗蟲死亡率=死亡數(shù)/總頭數(shù)×100%。以注射5 μL ddH2O的試驗(yàn)組為陰性對(duì)照組。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2019對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，GraphPad.Prism5.02軟件作圖，用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaMAT1基因生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析表明，MaMAT1 cDNA ORF 全長(zhǎng)為741 bp，編碼246個(gè)氨基酸。在線預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)MaMAT1蛋白分子量（Mw）為28.1 kD，等電點(diǎn)（pI）是9.51。通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)找出其他7種綠僵菌MAT1蛋白序列，通過同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，蝗綠僵菌MaMAT1基因位點(diǎn)僅含有MAT1-2-1基因，且與大孢綠僵菌（Metarhizium majus，MAJ）MAT1-2-1基因聚為一支，其相似性高達(dá)94.72%（圖1）。

2.2 MaMAT1基因敲除和回復(fù)驗(yàn)證

根據(jù)同源重組原理，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法獲得ΔMaMAT1和CP菌株，其載體構(gòu)建原理見圖2A。提取WT、ΔMaMAT1和CP菌株基因組DNA，用BfrBI和Nsp7121I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并Southern blot驗(yàn)證（圖2B），結(jié)果表明，WT和ΔMaMAT1菌株僅有一條條帶，其大小分別為500和1 000 bp，而CP菌株含有2條條帶（500和1 000 bp），其大小分別與WT和CP菌株一致。綜上所述，該試驗(yàn)所獲得的ΔMaMAT1和CP菌株均為陽性轉(zhuǎn)化子。

2.3 MaMAT1基因?qū)染G僵菌孢子萌發(fā)率和產(chǎn)孢量的影響

為分析MaMAT1 基因缺失對(duì)蝗綠僵菌孢子萌發(fā)率和產(chǎn)孢量的影響，分別對(duì)ΔMaMAT1、WT和回復(fù)（CP）菌株的萌發(fā)率和產(chǎn)孢量進(jìn)行研究。結(jié)果表明，MaMAT1基因缺失不影響孢子萌發(fā)率，與WT和CP菌株相比，差異不顯著（圖3A），但其產(chǎn)孢量顯著低于WT和CP菌株（圖3B）。綜上所述，MaMAT1基因不影響蝗綠僵菌孢子萌發(fā)率，但顯著影響其產(chǎn)孢量。

2.4 MaMAT1基因?qū)染G僵菌孢子抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰Φ挠绊?/p>

為分析MaMAT1對(duì)蝗綠僵菌孢子抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰Φ挠绊?，分別對(duì)ΔMaMAT1、WT和CP菌株的抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰M(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與WT和CP菌株相比，ΔMaMAT1菌株抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰o顯著差異（圖4）。綜上所述，MaMAT1基因的缺失不影響蝗綠僵菌的抗逆境能力。

2.5 MaMAT1基因?qū)Χ玖Φ挠绊?/p>

以東亞飛蝗5齡幼蟲為試驗(yàn)材料，采用體內(nèi)注射和體表接種2種方法研究MaMAT1基因缺失對(duì)蝗綠僵菌孢子毒力的影響。點(diǎn)滴試驗(yàn)結(jié)果表明，ΔMaMAT1菌株毒力顯著低于WT和CP（P<0.05），與WT相比，其半致死時(shí)間推遲了1.49 d（圖5A、B）。注射試驗(yàn)結(jié)果表明，ΔMaMAT1菌株的毒力降低，差異顯著（P<0.05），與WT相比，其半致死時(shí)間推遲了0.72 d（圖5C、D）。綜上所述，MaMAT1基因影響綠僵菌對(duì)體表的穿透能力和在蝗蟲體內(nèi)免疫應(yīng)答。

3 討論

信息素在真核生物中作為一類調(diào)節(jié)類物質(zhì)，在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演著重要角色[20]。MAT1-1和MAT1-2是控制真菌交配的關(guān)鍵基因，即使親緣關(guān)系較近的物種，其MAT1-1和MAT1-2 位點(diǎn)所含的基因數(shù)量也不同，如羅伯茨綠僵菌、球孢白僵菌和蛹蟲草[23]。生物信息學(xué)分析表明蝗綠僵菌中僅含有信息素基因MAT1-2。

研究表明，在擔(dān)子菌中，信息類物質(zhì)參與雙核的形成和子實(shí)體的發(fā)育[18]。該試驗(yàn)研究表明，MaMAT1基因不影響蝗綠僵菌孢子萌發(fā)率，但其產(chǎn)孢量顯著降低，可能是由于MaMAT1基因的缺失影響了綠僵菌孢子的發(fā)育過程。抗逆境試驗(yàn)分析表明，MaMAT1基因的缺失不影響綠僵菌抗?jié)駸岷涂棺贤饽芰?，說明MaMAT1基因的缺失基本不影響綠僵菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和厚度。真菌中的信息素類似于植物中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子（生長(zhǎng)素、赤霉素、脫落酸和乙烯），在植物病原菌赤霉菌（Gibberella fujikuroi）中，其產(chǎn)生赤霉素參與宿主的致病過程。白色念珠菌中信息受體系統(tǒng)參與了宿主的附著作用[24]?；染G僵菌MAT1基因的缺失導(dǎo)致其毒力顯著降低，這與前人研究結(jié)果一致，說明MAT1基因可能參與了宿主附著作用和致病過程。

蝗綠僵菌作為一種重要昆蟲病原真菌，在害蟲防治方面扮演著重要角色，其產(chǎn)孢量和毒力是限制其大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵因素。從該試驗(yàn)結(jié)果可知，MaMAT1基因參與蝗綠僵菌產(chǎn)孢和毒力有關(guān)。這一研究結(jié)果為提高孢子產(chǎn)量和毒力提供理論依據(jù)。

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